Estamos muy agradecidos con el profesor emérito Jean-Claude Perriard y Evelyn Perriard (Instituto Federal de Tecnología de Suiza, Suiza) para la introducción en las técnicas de aislamiento de rata neonatal y cardiomiocitos de ratón. Nos gustaría dar las gracias al profesor Ju Chen y el Prof. Sylvia Evans (UCSD, EE.UU.) por su apoyo. El trabajo en el laboratorio de EE fue financiado por un MRC Carrera Establishment Grant. SL es apoyado por una vía K99/R00 otorgar independencia de la NIH / NHLBI (HL107744). TMM fue apoyado por una beca postdoctoral de la American Heart Association (11POST7310066).

El siguiente procedimiento describe un 16,17 protocolo de dos días para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de ratones neonatales. Todas las soluciones son estériles o estéril filtrada. Todas las herramientas se esterilizan mediante esterilización de la superficie con etanol al 75%. Excepto para la extracción inicial del tejido, todas las medidas se llevan a cabo en una campana de cultivo de células de flujo laminar estéril. Este protocolo está diseñado para el aislamiento de corazones neonatales de ratón desde uno hasta dos camada (s) - aproximadamente 5-14 cachorros, pero puede ser adaptado para tamaños de las camadas más grandes y de rata cardiomiocitos neonatales. Uso de los medios de la escala / de la enzima en su caso. Para el trabajo con los roedores neonatales, consulte las directrices de la universidad local y las normas establecidas por el poder legislativo y / o programas de cuidado de los animales, y se adhieren a su animal protocolo aprobado institucionalmente. Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional de la UC San Diego (IACUC), y se adhieren a federeglamentos rales y estatales. Día 1. 1. El aislamiento del tejido cardiaco de ratones recién nacidos <ol><li> Preparar 50 ml de 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) suplementado con 20 mM de BDM 6-8, y se disperse en dos platos bacterianas estériles colocados en hielo. </li><li> Preparar 10 ml de medio de aislamiento en 50 ml tubo Falcon estéril cónico. Mantenga todas las soluciones en hielo. Esterilizar tijeras (una curva, una recta), y pinzas (curvas, Dumont N º 7). </li><li> Ratones recién nacidos de 1-3 días de edad se aclaran rápidamente en solución de etanol al 75% para la esterilización de la superficie. Los cachorros son decapitados con unas tijeras estériles (heterosexuales), y el pecho se abre a lo largo del esternón para poder acceder a la cavidad torácica y el corazón (Figura 1A, Supplemental Película S1). Comentario técnico: los ratones neonatales mayores de 3 días se pueden usar, pero dan lugar a un menor número de células viables 2. </li><li> Corazones se extraen deel cuerpo con tijeras curvas y se trasladará inmediatamente a la placa bacteriana que contiene 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 mM BDM, en hielo. Todos los pasos siguientes se realizan en la campana de cultivo celular estéril. </li><li> Retire el tejido pulmonar, los buques más grandes (y aurículas, si se desea). Corazones Lave la solución 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 mM BDM (en hielo) para quitar la sangre. Transferencia lavó corazones de primer plato en el segundo plato bacteriano que contiene 1x PBS (sin Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 mM de BDM (en hielo) el uso de fórceps o una cuchara perforada (Figura 1B). </li><li> Transferencia limpiado / lavado corazones en una gota de medio de aislamiento (aproximadamente 250 l; Figura 1C) en un tercer plato bacteriana (en hielo) y el uso de las tijeras curvadas para picar corazones en trozos pequeños (aproximadamente 0,5-1 mm 3, o más pequeñas; Figura 1D, 1E). </li><li> Traslado corazones picados en una cónicatubo que contiene 10 ml del medio de aislamiento (en hielo), y se incuba con agitación suave a 4 ° C durante la noche. </li></ol> Día 2. 2. Tissue digestión enzimática y Plating de células <ol><li> Pesar en 15 mg de mezcla de colagenasa / dispasa (Roche), y disolver la mezcla de enzima en 10 ml de L15-medio suplementado con 5 mM de BDM 20 (medio de la digestión). Filtro estéril el medio de la digestión en la campana de cultivo de células en un nuevo tubo Falcon de 50 ml estéril. </li><li> Preparar 30 ml de medio L-15 suplementado con 20 mM de BDM, y medio en placa. </li><li> Se recubren las placas de cultivo celular con solución de colágeno (Sigma C-8919) durante un mínimo de 1 hora. Retire la solución de colágeno (puede ser reutilizado) y de colágeno recubierto platos de cultivo de células secas en la campana de flujo laminar de cultivo celular estéril. </li><li> Retire el tubo cónico que contiene el corazón predigested de 4 ° C. Fragmentos de tejido deben ser agregados (Figura 1G). Deje que los fragmentos de tejido se hunden hastala parte inferior del tubo y eliminar el sobrenadante (asegurarse de no perder ningún fragmentos de tejido;. normalmente, aproximadamente 1 ml del medio de aislamiento pueden permanecer en el tubo). Añadir 5 ml de medio de digestión y 5 ml de L-15 suplementado con 20 mM de BDM para fragmentos de tejido y la suspensión de compuestos oxigenados que utilizan oxígeno o aire durante 1 min. </li><li> Transferir el tubo cónico de sellado que contiene los fragmentos de tejido cardíaco en medio de la digestión a 37 ° C baño de agua durante aproximadamente 2 min para ajustar la temperatura de la solución de digestión. </li><li> Incubar los fragmentos de tejido cardiaco a 37 ° C con agitación suave durante 20-30 min (por ejemplo agitador a 37 ° C, se establece en no más de 60 rpm). Tiempos de digestión pueden depender en gran medida de la mezcla de enzimas y número de lote Precaución:. Periodos de incubación más largos o más altas concentraciones de enzimas pueden reducir la viabilidad celular. </li></ol> Comentarios técnicos: Se recomienda el uso de una mezcla de colagenasa / dispasa de Roche (Cat.No.: 10269638001), que tiene muy poca variabilidad de lote a lote. La enzima clásica para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón es la tripsina y / o colagenasa tipo II 3,16-20 disponible de Worthington (Cat. n CLS-2). Sin embargo, el rendimiento de la colagenasa II puede diferir sustancialmente de lote a lote. Worthington típicamente permite el ensayo de varios lotes de colagenasa para optimizar los tiempos de digestión y el uso de enzimas. Alternativamente, Worthington vende un kit de aislamiento de cardiomiocitos con una mezcla de enzimas previamente probado incluido que se puede adaptar para el aislamiento de los cardiomiocitos de ratones 17 (Cat. No.: NCIS). <ol start="7"><li> Coloque células colador estéril (40-100 malla de nylon micras) en frescos estériles de 50 ml tubo Falcon cónica. Filtro de células pre-mojado con 5 ml L-15 suplementado con 20 mM BDM. Fragmentos de tejido se tritura suavemente utilizando una pre-humedecida 10 ml de cultivo celular de la pipeta durante aproximadamente 10-20 veces. Los fragmentos de tejido deben dispersar todo durante este paso, la liberación de las células en suspensioN (Figura 1H). </li><li> Deje que los fragmentos de tejido más grandes de sedimento y sobrenadante de transferencia que contiene células suspendidas en el tubo cónico fresco a través de células colador (Figura 1I). </li><li> Vuelva a suspender los fragmentos de tejido sin digerir en 5 ml medio de digestión y se incuba durante otros 5-10 minutos a 37 ° C con agitación suave. </li><li> Después de continuar la digestión de los fragmentos de tejido restantes, se tritura suavemente el tejido por 10-20 veces y añadir al tubo que contiene células cónicas a partir de la primera digerir a través de filtro de células. Enjuagar la célula-filtro con 5 ml de L-15 suplementado con 20 mM de BDM para permitir el paso de todas las células digeridas. </li><li> Tubo cónico de centrifugado que contiene los cardiomiocitos en suspensión durante 5 min a 300 rpm (aprox. 50-100 xg). Eliminar el sobrenadante (que contiene en su mayoría fibroblastos y células endoteliales) y volver a suspender sedimento celular en 10 ml enchapado medio. </li><li> Las células de la placa en placa de cultivo de 10 cm de células (Figura 2A) y se incuba durante 1HR -3 en cultivo celular incubadora. Esta etapa de pre-chapado elimina los fibroblastos y las células endoteliales (Figura 2B), que se adherirá a la placa de cultivo celular no recubierto (Figura 2C). </li><li> Después de la incubación, se lavan los cardiomiocitos no adherentes a partir de 10 cm de plato de cultivo (volver a suspender las células pipeteando repetidamente el medio en placa sobre el plato), y las células se resuspendieron de transferencia a un tubo de centrífuga cónico Falcon estéril (15 ml o 50 ml). Opcional: Repetir la etapa de pre-galjanoplastia para eliminar los fibroblastos adicionales de suspensión celular. Si se desea, las células de fibroblasto y endoteliales adherentes pueden ser cultivadas adicionalmente. </li><li> Contar las células (por ejemplo, utilizando hemocitómetro Neubauer, tripán exclusión de azul de tinción 21). </li><li> Las células de la placa en colágeno recubierto placas de cultivo celular con una densidad de aproximadamente 1,5 x 10 5 células por cm 2 (Figura 2D; véanse también los comentarios en la Tabla 1 en el chapadoy de recubrimiento). Coloque la vajilla en cultivo celular incubadora y dejar en reposo durante 12 a 18 horas para permitir la adherencia y la difusión de los cardiomiocitos. </li></ol> Día 3 - Cultura de los cardiomiocitos neonatales <ol><li> Preparar un medio de mantenimiento y precalentamiento en 37 ° C baño de agua. Consulte la Tabla 1 para la adición de inhibidores de la proliferación o agentes cronotrópicos, o el procedimiento de transfección liposomal de cardiomiocitos de ratones neonatales. </li><li> Un día después de la siembra, los cardiomiocitos deberían haber adherido a la placa de cultivo celular y de manera óptima comenzar espontáneamente a contraerse (Figura 2E, 2F; Suplementario película de S2; consulte la Tabla 2 para los problemas comunes durante el procedimiento de aislamiento / cultura). Reemplace chapado medio con medio de mantenimiento, y la cultura de otros 1-5 días. Cambio de medio según sea necesario. </li></ol>

El uso de modelos animales para estudiar las enfermedades cardíacas se ha convertido en estándar en la investigación cardiovascular. Más cerca de la caracterización bioquímica de estos modelos (es decir, el estudio de respuestas directas de las células cardíacas a los estímulos bioquímicos o biomecánicos) típicamente requiere el aislamiento de los tejidos del corazón o los cardiomiocitos. Los estudios que investigan las respuestas fisiológicas del corazón ex vivo (por ejemplo, a la aceti...

Los primeros informes de la disociación de éxito y la cultura de las células del corazón de roedores se remonta a la década de 1960 1,2. Incluso entonces, Harary y Farley notaron que los cardiomiocitos en cultivo &quot;pueden proporcionar un sistema único para el estudio de los requisitos de la contractilidad periódica [, y pueden] proporcionar un medio de determinar la contribución de las diversas vías metabólicas para el proceso [golpes]&quot;. Aunque Harary y Farley cardiomiocitos aislados y cultivados de ratas jóvenes, y el protocolo original se ha adaptado y modificado por muchos científicos en los últimos años, el procedimiento de aislamiento y el cultivo en general no ha cambiado mucho. Sin embargo, mejores enzimas 3, soluciones normalizadas de 4,5, y la adición del canal reversible y la miosina ATPasa inhibidor de la BDM para proteger las células durante el procedimiento de aislamiento 6-9 ha mejorado significativamente celular rendimiento y la viabilidad. Adultos vs miocardiopatía neonatalcitos Cardiomiocitos aislados y cultivadas a partir de ratones o ratas neonatales tienen varias ventajas sobre los cultivos de cardiomiocitos adultos. Ante todo, el procedimiento de aislamiento para neonatales de ratón o rata corazones es más fácil y menos costoso, en comparación con el aislamiento de cardiomiocitos de rata o ratón adulto 10. Cardiomiocitos neonatales son mucho menos sensibles a la reintroducción en un medio que contiene calcio después de la disociación, aumentando enormemente de células-rendimiento. Otra gran ventaja es que los cardiomiocitos de ratones neonatales se someten a una desdiferenciación más rápido - ciclo de re-diferenciación que da lugar típicamente a latir espontáneamente células 20 horas después de la siembra, mientras que los cardiomiocitos adultos suelen requerir de estimulación para inducir la contracción. Cardiomiocitos neonatales son también más fácilmente transfectable con métodos de transfección liposomal, mientras que los cardiomiocitos adultos requieren vectores virales para la entrega exitosa de ADN transgénico. En contraste con los cardiomiocitos neonataless, la cultura de los cardiomiocitos de roedores adultos 11-13 permite para las investigaciones de la degradación miofibrilar y eventual restablecimiento del aparato contráctil. Estos cambios morfológicos característicos en cardiomiocitos adultos ocurren en períodos de 1 a 2 semanas. La desdiferenciación - ciclo de re-diferenciación está acompañado por la reexpresión del programa genético fetal, imitando así los cambios patológicos observados en las miocardiopatías humanos 14. Otra ventaja de los cardiomiocitos de ratas adultas sobre la cultura de los cardiomiocitos neonatales es la capacidad de estas células de cultivo durante largos períodos de tiempo. Rata vs cardiomiocitos de ratón El aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de rata tiene algunas ventajas sobre el de los cardiomiocitos neonatales de ratón, incluyendo mayores rendimientos de células viables y aumento de las tasas de transfección. Sin embargo, el amplio uso de los modelos de ratones genéticamente modificados para las enfermedades cardíacas (por ejemplo &lt;/ Em&gt; la lim muscular nocaut proteína de ratón como modelo para la miocardiopatía dilatada 15) ha dado lugar a la adaptación del procedimiento de aislamiento de cardiomiocitos derivados de ratones recién nacidos. Aunque los protocolos utilizados para aislar de rata y ratón cardiomiocitos neonatales son casi idénticos, mayor se debe tener cuidado en la selección de una mezcla de enzima apropiado para este último. De hecho, los cardiomiocitos neonatales de ratón son generalmente más susceptibles a overdigestion, resultando en una célula rendimiento y la viabilidad reducida. Por otra parte, la densidad de placas se debe ajustar, ya que los cardiomiocitos derivados de ratones recién nacidos son algo más pequeñas en comparación con las células derivadas de corazones de ratas neonatales. Con muchas aplicaciones para la investigación de los parámetros morfológicos, electrofisiológicos, bioquímicos, de células biológicas y biomecánicas, así como para el proceso de myofibrillogenesis, cardiomiocitos neonatales cultivados se han convertido en uno de los sistemas más versátiles para el estudio defunciones de las células cardíacas in vitro. El primer paso para un ensayo de éxito, sin embargo, depende de una metodología sencilla y fiable para aislar los cardiomiocitos de ratones neonatales. Nuestro protocolo se basa su metodología de muchas fuentes y se ha optimizado para la reproducibilidad y robustez. Se discuten los factores que influyen en los cardiomiocitos rendimiento y viabilidad, y ofrecemos una variedad de opciones para la optimización de las condiciones de aislamiento y cultivo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

Cardiomiocitos neonatales cultivadas han sido utilizados para estudiar myofibrillogenesis y funciones miofibrilares. Cardiomiocitos cultivados permiten una fácil investigación y manipulación de las vías bioquímicas, y su efecto sobre las propiedades biomecánicas de latido espontáneo cardiomiocitos. El siguiente protocolo 2-día describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mostramos cómo diseccionar fácilmente corazones de los recién nacidos, se disocia el tejido cardíaco y enriquecer los cardiomiocitos de la población celular cardiaca. Se discute el uso de diferentes mezclas de enzima para disociación celular, y sus efectos sobre la viabilidad celular. Los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar posteriormente para una variedad de ensayos morfológicos, bioquímicos, electrofisiológicos, de células biológica o biomecánico. Hemos optimizado el protocolo para la robustez y reproducibilidad, mediante el uso de soluciones disponibles en el mercado único y la enzima se mezcla que shpoca variabilidad ujo de lote a lote. También nos ocupamos de los problemas más comunes asociados con el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos, y ofrecemos una variedad de opciones para la optimización de las condiciones de aislamiento y cultivo.

El uso de este protocolo, se aislaron los corazones de 8 un día de edad ratones recién nacidos (Figuras 1A, 1B, Supplemental Película S1). Después de lavar y picar los corazones con las tijeras (figuras 1C-1F), fragmentos de tejido fueron predigerido en medio de aislamiento durante la noche a 4 ° C con agitación suave. Siguiendo predigestion (Figura 1G), transferimos los fragmentos de tejido en un medio de digestión recién hecho, y se incubaron los fragmentos de...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

isolation-and-culture-of-neonatal-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

62.0K vistas.  King’s College London.  Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica. 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Investigación

Biología

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Aislamiento y grabaciones Kv Canal murinos en miocitos auriculares y ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Aislamiento y cultivo de ratón adulto cardiomiocitos de Señalización Celular y<em&gt; In vitro</em&gt; Hipertrofia Cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Aislamiento, cultivo y la transducción de cardiomiocitos de ratones adultos

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...