Esta técnica es más fiable y eficiente y no requiere una amplia práctica o entrenamiento en comparación con las técnicas de aparatos Langendorff más utilizadas. La principal ventaja de esta técnica es que limita el tiempo isquémico ya que la perfusión inicial se produce in vivo. Al realizar esta técnica, es esencial evitar burbujas en el colector y evitar el movimiento excesivo del corazón durante la digestión, estas pueden disminuir el rendimiento.
Demostrando esta técnica estará Sarah Sturgill, una estudiante graduada en el laboratorio del Dr. Mark Ziolo. Comience limpiando el colector de temperatura controlada utilizando un tampón de perfusión recién preparado. Para hacerlo, atornille una aguja de calibre 27 y limpie las burbujas con un conector luer lock.
Asegúrese de que no queden burbujas. Para aislar el cardiomiocitos, exponer el esternón del ratón completamente anestesiado, y lateral a la línea media, cortar proximalmente a través de las costillas y a la axila. Luego corte a través del diafragma, asegurando cortes poco profundos para evitar el corazón.
Sujete el esternón con un hemostático y doble las costillas hacia atrás para exponer la cavidad torácica. Retire el pericardio del corazón suavemente antes de cortar a través de la vena cava inferior inmediatamente distal al corazón. Inyecte tres mililitros de tampón de limpieza helada en el ventrículo derecho del corazón durante un minuto con una aguja de calibre 27.
Luego, sostenga el corazón con pinzas. Aleje el cuerpo y exponga la mayor cantidad posible de aorta. Luego sujete la aorta ascendente con un hemostático y extirpe el corazón.
Transfiera rápidamente el corazón sujetado a la tapa de una placa de Petri de polipropileno que contenga 10 mililitros de tampón de perfusión caliente. Coloque el corazón pinzado en la plataforma de soporte e inyecte 10 mililitros de tampón de perfusión con temperatura controlada a 37 grados centígrados en el ventrículo izquierdo durante cinco minutos usando una aguja estabilizada de calibre 27 conectada al colector. A continuación, transfiera el corazón pinzado y la plataforma de soporte a una placa de Petri con aproximadamente cinco mililitros de tampón de digestión.
Intercambie las jeringas de entrada por una jeringa de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de tampón de digestión. Limpie el colector de cualquier burbuja y el tampón de perfusión restante antes de la inyección. Reemplace cuidadosamente la aguja en la misma posición de la aguja en el ápice ventricular izquierdo.
Con la ayuda de una bomba de perfusión, inyecte tampón de digestión de 37 grados centígrados en el ventrículo izquierdo durante 15 minutos con una jeringa de 50 mililitros. Controle la temperatura de la solución con una camisa de agua calibrada para expulsar una solución de 37 grados centígrados. Retire los ventrículos de las aurículas antes de transferirlos a un vaso de precipitados de 10 mililitros.
Agregue tres mililitros de tampón de digestión al vaso de precipitados y corte los ventrículos en trozos grandes con tijeras afiladas. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y colóquelo en un baño de agua agitante precalentado a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda los trozos de tejido en tres mililitros de tampón de digestión y triture durante aproximadamente cuatro minutos o hasta que se logre una mezcla homogénea.
Una vez hecho esto, filtre las células en un tubo de polipropileno de 50 mililitros con un colador de células de nylon de 70 micrómetros. Lave el colador de células de nylon con tres mililitros de tampón de digestión. Devolver el filtrado a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 mililitros y centrifugarlo.
Deseche el sobrenadante antes de resuspender el pellet en tres mililitros de tope de parada. A la suspensión celular, agregue 54 microlitros de 100 milimolares de cloruro de calcio para que la concentración final de cloruro de calcio sea de 1.8 milimolar. Deje que las células vivas se asienten durante 10 minutos y retire el sobrenadante que contiene células muertas.
Después de resuspender el pellet en una solución de almacenamiento, las células se pueden utilizar para experimentos funcionales y cultivos. Las imágenes de microscopio de campo claro de células aisladas mostraron que el aislamiento de cardiomiocitos de ratón produjo células quiescentes en forma de bastón sin ampollas de membrana ni bordes redondeados. Las células mostraron aproximadamente un 80% de rendimiento y altas tasas de supervivencia que determinaron el éxito de la técnica de aislamiento.
Para un aislamiento exitoso, es más importante eliminar las burbujas del colector e insertar la aguja en el mismo orificio del corazón. Una vez aislados, los cardiomiocitos se pueden utilizar para experimentos funcionales celulares y moleculares.
