Este trabajo fue apoyado financieramente por las subvenciones K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) y P01GM107012 (KWM) de los Institutos Nacionales de Salud, y con fondos del Departamento de Roy J. Carver de Bioquímica, Biofísica y Biología Molecular en la Universidad Estatal de Iowa . El contenido de esta obra es de la exclusiva responsabilidad de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los NIH.

Este protocolo es suficiente para la expresión utilizando células HEK293F o HEK293s. 1. Establecimiento de la célula <ol><li> Cultura Inoculación Nota: Todos los procedimientos de manipulación de la cultura deben ser realizadas en una instalación BSL-2 y cada artículo llevados a la cabina de bioseguridad deben esterilizarse mediante pulverización con un 70% de etanol en solución acuosa. <ol><li> Haga funcionar el agitador incubadora a 135 rpm, 80% de humedad y al 8,0% de CO 2 y 37 ° C. Girar &quot;en&quot; la lámpara UV de la cabina de bioseguridad al menos 1 hora antes de trabajar. Precalentar las botellas selladas Medio A y Medio B en el baño de agua a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Esterilizar matraces Erlenmeyer de 125 ml de crecimiento con una tapa ventilada, pipetas, pipetas, y botellas de los medios de comunicación precalentadas por pulverización con el 70% de etanol en solución acuosa. Coloque estos artículos en la cabina de bioseguridad. Nota: Esterilizar sólo el exterior de plástico que cubre el frasco de cultivo Erlenmeyer de 125 ml, y luego retire sólo cuando is dentro de la cabina de bioseguridad. </li><li> Por una cultura 30 ml, retirar 26 ml de Medio A y 3 ml de Medio B (10% del cultivo final) y transferir en el matraz de cultivo de Erlenmeyer de 125 ml y mezclar suavemente mediante agitación (en lo sucesivo denominado como medio de cultivo fresco). </li><li> Transferencia de un vial de células que contienen células HEK293F, congelados a -80 ° C, en hielo y pasar a la sala de la cultura. Nota: Las células HEK293F se suministran a una densidad de 1 x 10 7 células / ml. </li><li> Caliente el vial suavemente en baño de agua a 37 ° C para descongelar parcialmente las células (que tarda aproximadamente un minuto y células no debería estar completamente descongelada). Esterilizar el exterior del vial con el etanol al 70% en solución de agua y moverlo a la cabina de bioseguridad. </li><li> El uso de 1 ml pipeta, retirar la suspensión de células (aproximadamente 0,7 ml) y la transferencia en el matraz Erlenmeyer de 125 ml que contiene 29 ml de medio de cultivo fresco. Cierre la tapa del frasco de cultivo y moverlo en la coctelera incubado. </li></ol&gt; </li><li> Mantenimiento Celular: Hora de densidad celular, Viabilidad y pases celulares <ol><li> Comprobar la densidad de células después de 24 h de descongelación de la cultura siguiendo el protocolo a continuación. Nota: Las células se cultivan durante 24 horas después de la descongelación para asegurar el crecimiento de células esenciales y la viabilidad de&gt; 80%. </li><li> Esterilizar el frasco de cultivo con el 70% de etanol en la solución de agua y moverlo a la cabina de bioseguridad. </li><li> Con una pipeta de 1 ml y pipeta, retirar lentamente 100 l de la cultura y la transferencia de la suspensión en un ml tubo Eppendorf estéril 0.5. Cierre y transferir el frasco de cultivo de nuevo en la coctelera tan pronto como sea posible. </li><li> Mezclar 7,5 l de una solución de azul de tripano con 7,5 l de células. Mezclar enérgicamente con 7,5 l de la / mezcla de azul tripán celular y transferirlo a la diapositiva contando. </li><li> Encienda el contador de células automático y colocar la diapositiva de conteo en la cámara de carga. El lector automático se activa y las células se cuentan de forma automática en las unidadesde número de células por ml y el porcentaje de viabilidad </li><li> Determinar el volumen de la cultura donante requerido para la transferencia a un medio de cultivo fresco a la densidad de células de 0,3 x 10 6 células / ml en vivo. Nota: Consulte un ejemplo de cálculo en Materiales suplementarios. </li><li> Repita los pasos 1.1.2 y 1.1.3 del protocolo &quot;1,1 Cultura Inoculación&quot; anterior para preparar los materiales necesarios para el medio de cultivo fresco. </li><li> Transferencia Medio A (23 ml) y Medio B (3 ml) a un matraz de cultivo de 125 ml fresco. Retire las botellas del stock de Medio A y medio B de la cabina de bioseguridad. Nota: Las existencias de botellas de los medios de comunicación no deben guardarse en la cabina de bioseguridad, al mismo tiempo que las células HEK 293F. Esto limita la posibilidad de contaminación de las botellas medianas valores. </li><li> Retire el cultivo de células HEK293 de la incubadora y rociar con el 70% de etanol en solución acuosa. Utilizando una nueva pipeta, retirar la parte alícuota de células (4 ml, este volumen se determinó de acuerdo to paso 1.2.6) a partir del cultivo y la transfiere al matraz que contiene medio de cultivo fresco. </li><li> Traslado tanto las culturas desde la cabina de bioseguridad al agitador incubadora de acuerdo con 1.1.1. Cultivan las células a una densidad aproximada de 2-3 x 10 6 células / ml en vivo. Nota: El tiempo de duplicación aproximada de las células es de 32 h. Se llevará a 3-4 días para llegar a esta densidad. Se incuban las células durante 3-4 pasajes tener patrón de crecimiento estable de las células antes de la primera transfección. </li></ol></li></ol> 2. Preparar materiales para transfección <ol><li> Preparación de células HEK293 (Día 1) <ol><li> Células subcultivo en una densidad de 1 x 10 6 células / ml en medio fresco B 24 hr antes de la transfección acuerdo con la Etapa 1.2. Nota: el volumen del cultivo de transfección será dependiente del número de células. Volúmenes de transfección más grandes (&gt; 20 ml) requerirán un mayor volumen de la cultura en esta etapa. </li></ol></li><li> Preparación Stocks de Materiales <ol><li> Preparar solución madre de polietilenimina lineal (PEI) a una concentración de 1 mg / ml en un tampón que contiene 25 mM 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico ácido (HEPES) y NaCl 150 mM (pH 7,5). Disolver PEI por completo; esto puede tardar 30-60 minutos a temperatura ambiente. Esterilizar a través de filtro de jeringa de 0,22 M y se almacena a -20 ° C para su uso a largo plazo. </li><li> Preparar ADN plásmido estéril (de acuerdo a los pasos 2.2.2.1-2.2.2.4). El procedimiento de construcción del plásmido se describe en otra parte 42. Una breve procedimiento para la preparación de ADN se explica aquí: <ol><li> Crecer un cultivo de células de Escherichia coli químicamente competentes-transformadas con el vector pGEN2 en 1 L de medio LB (10 g Tryptone- / L, Extracto de levadura 5 g / L y cloruros de sodio 10 g / L) suplementado con 100 mg / ml de ampicilina. E. coli se cultiva a 37 ° C en un no humidificado, incubadora de agitación. </li><li> Purificar el ADN pGEN2 vector que codifica plásmido diana de acuerdo con el manuprotocolo de purificación de ADN de fabri-. </li><li> Para asegurar la esterilidad completa del ADN de plásmido, realice los precipitación con isopropanol y resuspensión pasos finales de los procedimientos de extracción de ADN dentro de la cabina de bioseguridad. </li><li> Añadir el volumen de isopropanol (especificado en el kit de preparación de plásmido) a la ADN eluido y se centrifuga a 10.000 x g durante 10 min. Esterilizar el exterior del recipiente de ADN con etanol al 70% en solución de agua y transferirlo dentro de la cabina de bioseguridad. Descartar el sobrenadante usando una pipeta de isopropanol y aire secar el sedimento de ADN. Una vez seco, resuspender el precipitado en tampón estéril Tris 10 mM, pH 8,0. </li></ol></li><li> Preparar solución madre de 220 mM de ácido valproico (VPA) en agua y esterilizar por paso a través de un filtro estéril de 0,22 micras. Guarde la solución a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li></ol> 3. El establecimiento de una transfección transitoria <ol><li> La transfección (Día 0) <ol><li> Compruebe la densidad celular siguiendo los pasos 1.2.2 a través de 1.2.5 de &quot;1.2. Mantenimiento Móvil&quot; arriba. Determinar la cantidad de células para la transfección (2,5-3,0 x 10 6 células / ml en vivo con la viabilidad&gt; 95%). Ver un ejemplo de cálculo en Materiales suplementarios. </li><li> Transferir el volumen de las células de cultivo en suspensión calculados en el paso anterior (aquí 67 ml) a un tubo de centrífuga de 250 ml utilizando una pipeta serológica estéril. Recoger las células por centrifugación durante 5 min a 100 x g. </li><li> Mientras tanto, preparar un medio de cultivo fresco transfección siguiente paso 1.1.3 de acuerdo con &quot;1.1. Cultivo de inoculación&quot; anterior. Ver los Materiales complementarios para el cálculo de la muestra. Además, la transferencia de 5 ml de medio de cultivo fresco a un tubo de 15 ml estéril y dejar de lado. </li><li> Tubos de transferencia que contiene las células sedimentadas en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior de los tubos con el etanol al 70% en solución de agua y utilizar una pipeta estéril para decantar THe sobrenadante que consta de medio de cultivo gastado. </li><li> Vigorosamente resuspender las células sedimentadas pipeteando arriba y abajo con 10 ml de medio de cultivo fresco y traslado al frasco con medio de cultivo fresco transfección (preparado en el paso 3.1.3 anterior). Tornillo de la tapa en el frasco de cultivo celular ventilado y mover el frasco a la incubadora (tal como se establece en 1.1.1) durante 15 minutos-1 hora con agitación. </li><li> Durante este tiempo, diluir el ADN plásmido y las existencias de PEI utilizando medio de cultivo fresco (utilizando el volumen 5 ml retirado de paso 3.1.3 anterior) a una concentración final de 0,5 mg / l. Ver cálculos de ejemplo en materiales complementarios para determinar la cantidad de ADN y PEI. Transferir el matraz de cultivo con las células dispersa en la cabina de bioseguridad. </li><li> Añadir ADN plásmido (300 l de 0,5 mg / l) al cultivo utilizando micro-pipeta y mezclar por agitación manual suave. Añadir PEI (900 l de 0,5 mg / l) a la cultura, se mezcla agitando suavemente. Añadir 3,8 ml de cul frescamedio ture, desde el paso 3.1.3, arriba y matraz de transferencia al agitador incubador durante 24 hr. </li><li> Limpie el gabinete de bioseguridad de acuerdo con el Paso 1.1. </li></ol></li><li> Dilución (Día 1) (Para un volumen de 50 ml transfección) <ol><li> Incubar el cultivo transfectadas durante 24 horas. </li><li> Retirar 1 ml de ácido valproico mM precalentado 220 (VPA; preparado de acuerdo con el paso 2.2.3.) Utilizando un estéril de 1 ml pipeta serológica y la transfiere a un tubo de 50 ml estéril. </li><li> Retirar 5,0 ml de precalentado Medio B y 44 ml de Medio A precalentado y añadir esto a la solución VPA utilizando una pipeta serológica estéril para preparar 50 ml de medio de cultivo fresco con una concentración final de 4,4 mM de VPA. </li><li> Mueva el cultivo transfectado en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior del matraz con un 70% de etanol en solución acuosa, añadir el medio de dilución preparada y transferir el matraz de nuevo a la coctelera se incubaron. </li></ol></li><li> Expresión y cosecha (días 2-6) <ol><li> Se incuban las células durante otros 4-5 días (5-6 días en total desde la transfección). </li><li> Retirar alícuotas de medio de cultivo siguientes paso 1.2.2. a 1.2.5. se describe en &quot;1.2. Mantenimiento de la célula&quot;, anteriormente usando una pipeta serológica de 1 ml estéril, para monitorizar la viabilidad células y guardar alícuotas para analizar la expresión de proteína en cada día por SDS-PAGE (véase la Sección 5, más abajo). </li><li> Células de la cosecha después de 5-6 días por centrifugación de las células más medio a 1000 g durante 5 min. Además, cosechar el sobrenadante si el viabilidad celular cae por debajo de 50% (consulte los pasos 1.2.2-1.2.5). </li><li> Retirar el sobrenadante que contendrá proteína secretada. Añadir 5 ml de un blanqueador 10% al sedimento celular HEK y desechar como un riesgo biológico. </li></ol></li></ol> Purificación 4. Proteína <ol><li> Preparar una columna con 5 ml de proteína A-Sepharose. Equilibrar la columna con 5 volúmenes de columna de tampón A (20 mM de ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico (MOPS), pH 7,4, NaCl 100 mMl). </li><li> Centrifugar el sobrenadante recogido con proteína expresada a alta velocidad (14.000 g durante 10 min) para eliminar cualquier residuo celular restante. Recoger por decantación en un tubo nuevo. Deseche la pastilla como un peligro biológico. </li><li> Recoger una alícuota de 10 l del sobrenadante y, además, una pequeña muestra en cada etapa de purificación de proteínas para analizar la muestra por SDS-PAGE (descrito en la Sección 5). Cargue el sobrenadante clarificado y recoger el flujo a través. </li><li> Lavar la columna con 3 volúmenes de columna de tampón-A y eluir la proteína con volúmenes de 5 columnas de glicina 100 mM, pH 3,0. Recoger el eluido en tubos que contienen un medio volumen de tampón Tris 1 M, pH de 8,0 para neutralizar rápidamente el pH. </li><li> Lavar la columna con 10 volúmenes de columna de tampón A y almacenar para su uso futuro. </li><li> Intercambio de tampón se eluyó la proteína con al menos un exceso de 10 veces de tampón A utilizando 10 kDa de peso molecular filtros centrífugos de corte. Nota: No concentrar la muestra eluida aun volumen muy bajo (&lt;2 ml) en el tampón de eluido. Usa los filtros centrífugos para intercambiar el tampón con tampón A. </li><li> Tienda purificado proteínas a 4 ° C hasta su próximo uso. Nota: proteína expresada en el sobrenadante puede purificarse mediante columnas de afinidad seleccionados sobre la base de las propiedades de la proteína o el uso de etiquetas de afinidad. Para un procedimiento típico de purificación, columna de proteína A se puede utilizar para IgG o fragmentos Fc o columna de níquel se puede utilizar para proteínas expresadas con una etiqueta de poli-histidina. Aquí, es una descripción de las etapas de purificación para IgG1-Fc utilizando una columna de Proteína A. </li></ol> 5. Análisis de proteínas por SDS-PAGE <ol><li> Diluir las alícuotas (7,5 mu l) de cada muestra con un volumen igual de tampón de carga 2x (0,125 M Tris, pH 8.0, 4% SDS, 10% β-mercaptoetanol, 20% glicerol, y 0,01% azul de bromofenol). </li><li> Hervir la mezcla a 90 ° C durante 5 min usando un bloque de calor o baño de agua. Centrifugar las muestras a 10.000 g for 1 min. Cargue el gel preparado con 5 l de proteína marcadora y 14 l de las muestras para el análisis utilizando una pipeta de 20 l con una punta desechable. </li><li> Ejecute uno de gel a 25 miliamperios durante 60 minutos. Una vez que el paso de electroforesis es completa, transferir el gel a un recipiente con 1 L de agua y microondas durante 5 min. </li><li> Tinción del gel con solución de tinción (etanol 40%, ácido acético al 10% y 0,1% Azul Brillante de Coomassie) durante 2 horas y destain en agua. </li></ol> 6. Los glicanos Análisis por Espectrometría de Masas <ol><li> Analizar glicanos como se ha descrito previamente 44. Brevemente, 75 g de IgG1-Fc se tripsinizó, luego se trató por PNGasaF para la liberación de glicanos 45. Glicanos liberados fueron permetilada y se analizaron por espectrometría de uso de láser asistida por matriz-desorción ionización tiempo de vuelo de masas (MALDI-TOFMS). </li></ol> 7. Protocolo Ajustes por Escenarios especiales <ol><li> Etiquetado de proteínas con 15 N-etiquetados aminoácidos (para un volumen de 50 ml transfección) <ol><li> Dispensar 5 mg de cada aminoácido en un único vial de vidrio estéril. Resuspender con 4 ml de agua en autoclave (nota Tyr no solubilizar por completo, a diferencia de Lys y Phe). Esterilizar la solución en autoclave a 121 ° C durante 15 min. Deje que la solución se enfríe, aproximadamente a 50-60 ° C. </li><li> Para un volumen de transfección 50 ml, siga el paso 3.1.3 de acuerdo con &quot;3.1 Establecer una transfección transitoria&quot;. Vea la sección de Materiales suplementarios para un ejemplo con volúmenes adecuados. </li><li> Para la transfección, siga los pasos de &quot;3. El establecimiento de una transfección transitoria&quot; utilizando medio de cultivo fresco sustituida con residuos de aminoácido marcado como se preparó anteriormente. </li><li> Después de 24 h de transfección, en el día de la dilución de la cultura, retirar 5,0 ml de precalentado Medio B, 40 ml de Medio A precalentado y un recién autoclave 4 ml alícuota de la mezcla de aminoácidos (preparado como en el paso 7.1.1. Supra) y añadir 1ml precalentado solución madre de solución de VPA para preparar 50 ml de medio de cultivo de dilución fresca con una concentración final de 4,4 mM de VPA. Añadir este medio a la cultura de la transfección usando una pipeta serológica estéril. </li><li> Transferir el cultivo transfectado en la cabina de bioseguridad después de esterilizar el exterior del matraz con un 70% de etanol en solución acuosa, añadir el medio de dilución preparada y transferir el matraz de nuevo a la coctelera se incubaron. Nota: Semi-A es un medio libre de suero químicamente definido. Por lo tanto, es posible preparar una formulación diferente. Póngase en contacto con el proveedor para obtener una preparación personalizada Medio A que carece de ciertos aminoácidos. Es posible tener todos los aminoácidos dejados de lado, sin embargo, se prefiere usar medio que carece de pocos residuos seleccionados porque un medio de deserción escolar completa requeriría un ajuste de la osmolaridad después de la suplementación. Elegimos un medio de deserción Lys-Tyr-Phe que puede ser complementada y no requiere ajuste de la osmolaridad. Furthermore, el Medio Un proveedor no comparte libremente las concentraciones de los componentes del medio; hemos utilizado 100 mg / L de cada uno para Lys, Tyr y Phe con éxito. Los volúmenes del medio de transfección y expresión deben ajustarse para dar cuenta de los aminoácidos añadidos. Aquí están los ajustes en el protocolo anterior para el etiquetado de isótopos </li></ol></li><li> Complementar la transfección con una pequeña molécula <ol><li> Preparar solución de 100 mM de stock de 2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa utilizando agua tratada en autoclave y esterilizar esta solución usando un filtro de 0,22 mM. </li><li> Para un cultivo de 50 ml, añadir 125 l (a 250 m) de la solución de análogo de fucosa a los medios de transfección y de dilución. Nota: descuidado para realizar cualquier ajuste de volumen aún más debido a la adición de la sustituyente en esta cuentas de concentración por sólo 0,25% del total de volumen de cultivo .Es es posible modificar la expresión utilizando inhibidores de molécula pequeña de procesamiento de glicano. Aquí se describen las condiciones para la inclusión de 2-desoxi2-fluoro-L-fucosa, un inhibidor de la fucosilación glicano. Encontramos&gt; 90% de reducción en fucosilación añadiendo el análogo de fucosa a una concentración de 250 mM en el medio de transfección y dilución. </li></ol></li></ol>

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Este protocolo ilustra la expresión de proteínas a través de la transfección transitoria de células HEK293F o S. Las condiciones de transfección óptimas establecidas en los laboratorios de Barb y Moremen emplean una combinación crítica de las concentraciones de densidad celular y reactivos para lograr una alta eficiencia de transfección. Consideraciones críticas en la aplicación de este protocolo son: mantener una cultura estable antes de la transfección (con cultura coherente veces doblando); la transfecci...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

La producción de altos rendimientos de proteínas humanas debidamente plegadas y después de la traducción modificados para el análisis detallado de la estructura y la función sigue siendo un reto importante. Un gran número de sistemas de expresión están disponibles que producen las proteínas recombinantes con la función y el comportamiento similar a la nativa. Sistemas de expresión bacterianos, predominantemente cepas de Escherichia coli, representan las herramientas más accesibles y comúnmente utilizados en el campo de la investigación, debido a la simplicidad de estos sistemas de expresión, aunque la levadura, plantas, insectos y sistemas de mamíferos son también describen a 1-4. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas son incapaces de modificación post-traduccional apropiado de las proteínas diana. Un interés fundamental de los laboratorios Barb y Moremen está produciendo proteínas eucariotas con glicosilación apropiada. Muchas proteínas humanas requieren glicosilación apropiada para la función apropiada (ver 5). El eucariotamaquinaria de glicosilación es amplia y capaz de realizar una amplia gama de modificaciones, que incluye tanto la asparagina (N) - y serina / treonina (O) -vinculada glicanos complejos 6. Se estima que&gt; 50% de las proteínas humanas son N-glicosilada 7. Los glicanos son componentes esenciales de muchas proteínas, incluyendo anticuerpos monoclonales terapéuticos, eritropoyetina y factores de coagulación de la sangre como el factor IX, para nombrar unos pocos. Aunque existen varios métodos para preparar proteínas adecuadamente N-glicosilada y van desde puramente sintético 8-10, a quimioenzimática 11-14 o la recuperación de los sistemas recombinantes ingeniería 15-20, como es lógico, los sistemas de expresión humanos hasta ahora han demostrado ser el más robusto métodos para generar proteínas humanas. Muchos glicoproteínas humanas terapéuticas se producen en sistemas recombinantes utilizando células de mamíferos. Sistemas de la nota son el ovario de hámster chino (CHO), mieloma de ratón (NS0), Baby Hamster kidney (BHK), del riñón embrionarias humanas (HEK-293) y líneas de células de la retina humanos que se emplean en la adhesión o suspensión de cultivo para la producción de proteínas 4,21,22. Sin embargo, los sistemas de expresión proteína de mamífero han requerido la generación de líneas celulares estables, medios de crecimiento y el sustrato asistida caros procedimientos de transfección 23. La transfección de células de mamífero se consigue con la ayuda de numerosos agentes, incluyendo fosfatos de calcio 24,25, polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polibreno, polilisina, polietilimina (PEI)) o liposomas catiónicos cargados positivamente 26-29. PEI es un policatiónico, cargada, lineal o polímero ramificado (25 kDa) 26 que forma un complejo estable con el ADN y se endocitosis. Tras la acidificación del endosoma, PEI se piensa a hincharse, lo que lleva a la ruptura de endosomas y la liberación del ADN en el citoplasma 26,30. Hasta hace poco, la transfección transitoria en Suspensiònen la cultura fue llevado por la formación de complejos de ADN / PEI antes seguido de la adición al cultivo celular 29. Sin embargo, Würm y compañeros de trabajo informó de un protocolo altamente eficiente optimizado para la producción de proteínas recombinantes en células HEK293 que formaban un complejo ADN / PEI in situ 31,32. Esto evitó la preparación, la esterilización del complejo, y el intercambio de tampón en un medio de cultivo. Además optimización incluyendo plásmidos de expresión para mejorar llevado a aumentos de rendimiento significativa 33. Aquí un método que se basa en estos avances y es ampliamente aplicable. Condiciones de expresión también pueden alterarse para afectar a la composición de N-glicano. La línea de células HEK293s, con una deleción del gen que detiene el procesamiento de N-glicano en una etapa intermedia, conduce a la expresión de proteínas con uniformes N-glicanos que consta de 2 residuos de N-acetilglucosamina más cinco residuos de manosa (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Estas célulascarecer de la N-acetilglucosaminil transferasa I (GnTI) de genes que se requiere para N-glicano de procesamiento aguas abajo 36,37. El uso de inhibidores de glicosiltransferasa incluyendo kifunensine, análogos del ácido siálico y el análogo de fucosa y 2-desoxi-2-fluoro-fucosa tiene efectos y los límites de procesamiento de N-glicano 38 a 41 similares. El protocolo informó aquí utiliza el vector pGEN2 como se muestra en la Figura 1 42,43, PEI transfección asistida transitoria en líneas de células de mamíferos (HEK293F o células HEK293s), y la recuperación de altos rendimientos de proteína apropiadamente glicosilada. Este sistema es robusto y puede acomodar varios factores, incluyendo el etiquetado de isótopos y la ingeniería glicano para la producción de grandes títulos de proteínas recombinantes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

El arte de la producción de proteínas recombinantes con complejas modificaciones post-traduccionales representa un desafío importante para los estudios de estructura y función. El rápido establecimiento y alta recuperación de las líneas de células de mamíferos transfectadas transitoriamente-aborda esta barrera y es un medio eficaz para la expresión de proteínas que se canalizan a través de la forma natural ER y Golgi vía secretora mediada. Aquí es un protocolo para la expresión de proteínas utilizando el HEK293F humana y líneas de células HEK293s transfectadas con un vector de expresión de mamífero diseñado para altos rendimientos de proteínas. La aplicabilidad de este sistema se demuestra mediante tres glicoproteínas representativos que expresaban con rendimientos entre 95 a 120 mg de proteína purificada recuperada por litro de cultivo. Estas proteínas son la FcRIIIa humana y la sialiltransferasa α2-6 rata, ST6GalI, ambos expresados ​​con una fusión GFP N-terminal, así como la inmunoglobulina humana no modificada G1 Fc. Este robusto sistema utilizes un medio libre de suero que es adaptable para la expresión de proteínas e hidratos de carbono para estudios estructurales utilizando espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear isotópicamente enriquecidos. Además, la composición de la N-glicano se puede ajustar mediante la adición de una molécula pequeña para evitar que ciertas modificaciones de glicano de una manera que no reduce el rendimiento.

La expresión de proteínas de alto nivel y la pureza Este sistema de expresión optimizado genera un alto rendimiento de proteínas glicosiladas. Un patrón típico se muestra en la expresión de IgG1-Fc (Figura 1). En este caso, Día 0 es el día de la transfección seguido por Día 1 (dilución) y días de cultivo subsiguientes hasta el día 5. La expresión de proteínas se analiza utilizando la fracción ...

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High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

high-yield-expression-recombinant-human-proteins-with-transient

Research

JoVE Journal

Biology

29.5K vistas.  Iowa State University. Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Video: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Investigación

Biología

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absoluta Quantum medición del rendimiento de las muestras de polvo

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Una expresión adecuada y el general de la Plataforma para la producción de proteínas secretadas por las células humanas

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...