Nos gustaría dar las gracias a la Sociedad Max-Planck para la financiación de nuestra investigación.

1. Preparación de respirómetros <ol><li> Corte la punta de la pipeta 1.000 l con una hoja de afeitar para permitir la inserción de los capilares de la micropipeta 50 l, tratar de conseguir la punta de la pipeta lo más recto posible. </li><li> Coloque un pedazo de espuma en la pipeta y presione hacia abajo en la punta de la pipeta. </li><li> Agregue una pequeña cantidad de absorbente de CO 2 y de contenerlo por una segunda pieza de espuma. </li><li> Aplicar el pegamento en el lugar donde se inserta la micropipeta en la punta de la pipeta. </li><li> Deje el respirómetro durante la noche para permitir que el pegamento se seque. Un diagrama esquemático de un respirómetro se muestra en la Figura 1A. </li></ol> 2. Preparación de la cámara de medición <ol><li> Preparar la solución de cámara de mezclando agua con eosina en una relación que se traducirá en la coloración visible. </li><li> Verter la solución de eosina / agua en la cámara. </li><li> Etiqueta de uno de los lados de la cámara con una escala de centímetros. </li></ol><ol><li> Etiquetar los respirómetros individuales con un marcador. </li><li> Anestesie moscas utilizando un método alternativo a CO 2 y colocar 3-5 moscas del genotipo deseado dentro de cada respirómetro. </li><li> Selle las respirómetros firmemente en la parte superior el uso de masilla de plastilina. </li><li> Permitir que las moscas se recuperen de la anestesia durante aproximadamente 15 min. </li><li> Preparar una respirómetro sin moscas, que se utilizó como control atmosférica. </li></ol> 4. Realización del experimento <ol><li> Cuelgue las respirómetros en la cámara uniendo un soporte de tubo Eppendorf de 1,5 ml que está abierto en la parte superior y la parte inferior en la parte superior de la cámara. </li><li> Inserte respirómetros con la punta de la micropipeta hacia la cámara que permite que la punta se sumerja en la solución de color. </li><li> Añadir vaselina entre la cubierta de la tapa y la cámara para proporcionar aislamiento más fuerte de temperatura y presión fluctluaciones. </li><li> Cierre la tapa y deje que el sistema se equilibre durante 15 min. </li><li> Tome una fotografía de la cámara de asegurarse de que el nivel de líquido dentro de cada micropipeta es visible y también lo es la escala (véase el ejemplo mostrado en la Figura 1B). </li><li> Después de 1-2 horas, tomar otra foto. </li><li> Cuando se termina el experimento, eliminar las moscas de respirómetros y sopesar si se desea o transferirlos de nuevo al frasco si es necesario más. </li></ol> 5. Análisis de los resultados <ol><li> Abrir las imágenes adquiridas utilizando el software ImageJ 11. </li><li> Utilizando la escala en cada imagen, ajuste la escala de píxeles en el software. </li><li> Medir la distancia (Dd) que el líquido viajó desde un punto de referencia determinado en las imágenes tomadas al principio (d1) y al final del experimento (d2). Un ejemplo de esquema se muestra en la figura 1C. </li><li> Calcular la cantidad de CO2 producido (l / h / mosca) con la fórmula: </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51681/51681eq1.jpg" /> R = radio del tubo micropipeta en centímetros Dd = distancia que el líquido se ha movido en la micropipeta de muestras de ensayo se mide en centímetros ? C = distancia que el líquido se ha movido en la micropipeta de la muestra de control negativo (sin moscas) n = número de moscas utilizadas h = horas

<ol><li>Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+%26%2334%3Brate+of+living%26%2334%3B+model%3A+further+evidence+that+longevity+and+metabolic+rate+are+not+inversely+correlated+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Testing the &#34;rate of living&#34; model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster.</a> J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).</li>
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<li>van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+contribution%3A+long-lived+Drosophila+melanogaster.+lines+exhibit+normal+metabolic+rates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates.</a> J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).</li>
<li>Hulbert, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rate+is+not+reduced+by+dietary-restriction+or+by+lowered+insulin%2FIGF-1+signalling+and+is+not+correlated+with+individual+lifespan+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).</li>
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<li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+flies+and+men%3A+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biology. 11, 38 (2013).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

En este protocolo, se describe un método de bajo costo y confiable para medir la producción de CO 2 en las moscas. Hemos encontrado que este experimento es fácil, rápido de realizar y genera datos reproducible que está de acuerdo con otros estudios 1, 6, 9. El protocolo descrito aquí se puede modificar fácilmente para adaptarse a presupuesto y materiales disponibles de cualquier laboratorio. La construcción de cada respirómetro individuo puede adaptarse, siempre y cuando la cámara permanece hermético. Sin embargo, cuanto más tiempo, micropipetas más delgados ofrecen más precisión sobre los más cortos. El uso de la cámara exterior puede ser opcional siempre y cuando no hay cambios de temperatura y presión ambientales significativos a comprometer el experimento. Esto puede ser determinado por análisis del control negativo y una gran variabilidad dentro de las mediciones de muestras biológicas. Además, el absorbente de CO 2 puede ser de cualquier variedad con tal de que no es tóxico para el Fmentiras (por ejemplo, hidróxido de potasio). Es de suma importancia contar con un control negativo para asegurar que la técnica funciona correctamente. El problema más común es que el respirómetro de no ser sellado completamente. Si este es el caso, entonces la medición será comparable a la del control negativo. Otros problemas pueden surgir debido a las moscas que no han tenido tiempo para recuperarse de la anestesia o han perecido. El paso más crítico en este protocolo es la construcción de la respirómetro. Como se señaló anteriormente, el respirómetro debe ser hermético. La unión de la micropipeta a la cámara de pipeta más grande debe hacerse con el pegamento correcta. Un adhesivo más parecido a la goma ha funcionado mejor. Se recomienda inspeccionar los respirómetros bajo un microscopio para observar cualquier compromiso en la estructura pegada después de su finalización. Además, el sellado de la respirómetro después de moscas se han colocado en el interior es muy importante. El uso de masilla hcomo ha encontrado para trabajar mejor y no con poca frecuencia. La parafina se ha encontrado para trabajar muy mal y debe ser evitado. El líquido que se utiliza para medir el volumen de gas es también muy importante y debe ser manométrica. Por lo tanto, el agua es la mejor opción. No se recomienda el uso de la tinta, ya que puede endurecerse en el capilar haciendo que el respirómetro inútil. También es fundamental no utilizar la reproducción de las hembras, ya que nos dimos cuenta de que su producción de CO 2 puede ser muy variable. Además de la edad de moscas es importante, por lo tanto, las moscas que se comparan deben ser de la misma edad. En nuestra prueba hemos utilizado machos 5 días de edad. La base genética de las moscas también es importante. Las moscas de control deben ser del mismo fondo genético en comparación con los mutantes. Los datos también se pueden presentar como (l / h / mg) mediante la medición de la masa de las moscas después de realizar el ensayo si hay diferencias significativas en el tamaño de las moscas. En nuestras manos, una mosca de tipo salvaje pesa 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). También hay que señalar que, durante la temporización del experimento, se obtienen los valores de la tasa metabólica media. También hemos encontrado que es posible medir una mosca individual, pero hemos logrado la más alta precisión utilizando 3-5 moscas. El espacio disponible en respirómetro para las moscas es suficiente que no se sienten hacinamiento, pero al mismo tiempo no tienen espacio para caminar intensamente: por lo tanto, geotaxis defectuosos no deben tener ningún efecto sobre el nivel de producción de CO 2. Las moscas de largo se han establecido como uno de los principales organismos modelo para el estudio de enfermedades humanas que están relacionados con la biología del desarrollo, biología celular, y la neurobiología. Un número de estudios recientes han demostrado que las moscas pueden ser fácilmente utilizados para estudiar la homeostasis de energía, así (revisado en 12, 13). El método que aquí se presenta se puede utilizar fácilmente en pantallas genéticas para identificar nuevos componentes moleculares posiblemente implicados en el control de la meEstado tabolic antes de comprar un equipo más preciso y caro. Hasta ahora, la mayoría de tales pantallas se realiza sólo en el cultivo celular que indica que se requieren estudios más avanzados.

El ciclo bioquímico de Krebs genera ATP a través de la oxidación de acetato derivado de los carbohidratos, las grasas y las proteínas que producen CO 2. En Drosophila, O 2 de entrada está directamente relacionada con la producción de CO 2 y refleja el nivel de metabolismo 1. Por lo tanto, la medición de CO 2 de salida ha utilizado con éxito en los estudios relacionados con el envejecimiento y el metabolismo de 2-5. Aquí nuestro laboratorio ha modificado montajes experimentales previamente diseñados, lo que permite la medición de la producción de CO 2 en un máximo de dieciocho muestras sin necesidad de equipo especializado. Otros y hemos utilizado anteriormente este método para mostrar las diferencias en las tasas metabólicas en las moscas que son deficientes en la proteína de la distrofia muscular asociada, Distroglicano (Dg) 6-8. O 2 utilizado para el metabolismo oxidativo se convierte en CO 2, que es expulsado como residuos respiratoria. La construcciónción de respirómetros hechas a mano se describe que permite la determinación de la tasa de O 2 consumido. Las moscas se colocan en un recipiente sellado con una sustancia que absorbe CO 2 expulsado, eliminando de manera eficiente desde la fase gaseosa. El cambio en el volumen de gas (disminución de la presión) se mide por el desplazamiento de fluido en un capilar de vidrio unido a la respirómetro cerrado. La principal ventaja de esta técnica sobre otros es el costo. Estudios previos han medido la producción de CO2 por Drosophila utilizando analizadores de gases y sistemas de respirometría técnicamente avanzados 1,9. A pesar de el equipo más complejo, la sensibilidad del método descrito aquí es similar a los valores reportados (Tabla 1). Además, varios otros grupos han utilizado variaciones de esta técnica para determinar las tasas metabólicas relativas en Drosophila 4-6. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para generar reliable, datos reproducibles relevantes para el metabolismo de Drosophila sin la compra de equipo especializado que puede ser configurado en cualquier laboratorio y se puede utilizar con fines educativos. En general, las técnicas aceptadas para determinar el metabolismo de un organismo es medir el CO 2 producido, el O 2 consumido, o ambos 3,4,9. Aunque, se puede suponer que un equivalente de O 2 genera un equivalente de CO 2, la relación precisa de CO 2 generado es dependiente sobre el sustrato metabólico utilizado 10. Por lo tanto, para determinar con precisión la tasa metabólica en unidades de energía que es necesario medir ambos O 2 consumido y CO 2 producido. Debido a esto, el método descrito aquí es específicamente relevante para la comparación de las diferencias en la producción de CO 2 entre los animales y no el valor absoluto. Nuestra técnica se integra animales CO producción múltiple 2 durante un período de timE (1-2 horas) y por lo tanto devuelve un promedio de la actividad de los animales. Si hay razones para creer que los animales de experimentación son menos activos que los animales de control de la medición podría reflejar diferentes niveles de actividad y no necesariamente el metabolismo.

<table><tbody><tr><td>BlauBrand IntraMark 50 &amp;micro;l micropipettes</td><td>VWR</td><td>612-1413</td><td></td></tr><tr><td>Soda Lime</td><td>Wako</td><td>CDN6847</td><td></td></tr><tr><td>Eosine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>031M4359</td><td>Any dye that can create visible colorization of liquid can be used</td></tr><tr><td>Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber</td><td>VWR</td><td>21432-761</td><td>Any transparent glass chamber that can be closed with the lid</td></tr><tr><td>Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit</td><td>Flinn</td><td>FB1438</td><td></td></tr><tr><td>Power Gel Glue</td><td>Pritt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipett tips</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foam</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaesticine Putty</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of metabolic rate in drosophila using respirometry

Trastornos metabólicos son un problema frecuente que afecta a la salud humana. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos que regulan el metabolismo es una tarea científica fundamental. Muchos de los genes que causan enfermedades en los seres humanos tienen un homólogo mosca, haciendo Drosophila un buen modelo para estudiar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de diferentes trastornos. Además, la maleabilidad de Drosophila simplifica pantallas genéticos para ayudar en la identificación de nuevas dianas terapéuticas que puedan regular el metabolismo. Con el fin de realizar una pantalla de este tipo es necesario un método sencillo y rápido para identificar los cambios en el estado metabólico de las moscas. En general, la producción de dióxido de carbono es un buen indicador de los gastos de oxidación del sustrato y la energía que proporciona información sobre el estado metabólico. En este protocolo se introduce un método simple para medir el CO 2 de salida de las moscas. Esta técnica potencialmente puede ayudar en la identificación de las perturbaciones genéticos que afectan la tasa metabólica.

Con el fin de demostrar que el método es sensible que mide la producción de CO 2 de tipo salvaje (Oregon R) macho vuela a 18, 25 y 29 ° C y las moscas mutantes para Dg. Las moscas se elevaron a 25 ° C y luego se desplazan a la temperatura experimental durante 5 días antes de la medición. Como era de esperar para esta especie ectotérmico, la cantidad de CO 2 producido aumentó con la temperatura (Figura 2). Hemos en el pasado muestran que una dieta libre de azúcar reduce la tasa metabólica de ambos de tipo salvaje y mutante vuela Dg 7. La pérdida de Dg conduce a aumento de los niveles metabólicos (Figura 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Configuración para la medición de la producción de CO 2 en las moscas. A. Esquema que muestra tque la construcción de la respirómetro individual. B. La fotografía de la cámara durante la medición de CO 2. Cartas marcan la posición de respirómetros. Verticales indican los números de la escala en centímetros. C. Esquema que muestra los cambios durante el experimento. La línea verde indica punto de referencia (d1), el azul indica la posición final del líquido después de 2 horas (d2). Dd es la distancia que el líquido ha viajado en la micropipeta. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51681/51681fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Producción de CO 2 en las moscas a diferentes temperaturas y en los mutantes Dg. Temperatura del cuerpo se correlaciona positivamente con la producción de CO 2 en Drosophila y se incrementa de manera significativa en los mutantes Dg. Las barras de error indican SEM de cuatro experimentos individuales, *** p ≤ 00.01. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> (L / fly x horas) </td><td> Equipo utilizado </td><td> Referencia </td></tr><tr><td> 2-3 de CO 2 </td><td> CO 2 analizador de gas </td><td> (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) </td></tr><tr><td> 4,68 ± 1,04 CO 2 </td><td> CO 2 Sistema respirometría </td><td> (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) </td></tr><tr><td> 2.9 a 6.2 O 2 </td><td> Del mismo modo respirómetros diseñados </td><td> (Hulbert, Clancy et al. 2004) </td></tr><tr><td> 2,20 ± 0,15 O 2 </td><td> Descritos respirómetros aquí artesanales </td><td> (Kucherenko, Marrone et al. 2011) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> * Los valores de la tabla son los estudios que informan de los valores numéricos de las moscas de medida a 25 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Comparaciónde las diferentes técnicas que se utilizan para medir la producción de CO 2 por Drosophila.

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Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Los trastornos metabólicos se encuentran entre una de las enfermedades más comunes en los seres humanos. El modelo de organismo genéticamente manejable D. melanogaster se puede utilizar para identificar nuevos genes que regulan el metabolismo. Este artículo describe un método relativamente sencillo que permite el estudio de la tasa metabólica en las moscas de la medición de su producción de CO 2.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

measurement-of-metabolic-rate-in-drosophila-using-respirometry

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

19.6K vistas.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry.  Los trastornos metabólicos se encuentran entre una de las enfermedades más comunes en los seres humanos. El modelo de organismo genéticamente manejable D. melanogaster se puede utilizar para identificar nuevos genes que regulan el metabolismo. Este artículo describe un método relativamente sencillo que permite el estudio de la tasa metabólica en las moscas de la medición de su producción de CO 2. 

Video: Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Investigación

Biología

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Bioquímica

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neurociencias

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un método de alto rendimiento para la medición de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un método mejorado para la rápida y precisa medición de rendimiento en vuelo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

La medición de las larvas La actividad en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Actividad

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Medición y Análisis de la producción de ácido extracelular para Determinar glicolítica Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Adaptación de la microrrespirometría para Drosophila - Información sobre el metabolismo de los mutantes de CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Autor destacado: Influencia de la temperatura en Drosophila melanogaster y los escarabajos adaptados al desierto 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Medición del consumo de O2 en Drosophila melanogaster mediante microrrespirometría coulométrica

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

La medición de la tasa metabólica en

Resumen

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