Agradecemos a R. Sun y otros estudiantes de laboratorio de Chen por su contribución a la generación de plantar material. También agradecemos al Dr. D. Green por su apoyo a la investigación universitaria en la Facultad de Tecnología e Innovación (CTI). Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones del NIH U01 AI075549 y 1R21AI101329 al P. Chen, y una donación de SSE de CTI, de la Universidad del Estado de Arizona a Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado y J. Stahnke son estudiantes universitarios apoyados por la concesión SSE.

1. Crecimiento de las Plantas <ol><li> Lugar 60 pastillas de turba en una bandeja de propagación. Añadir 4 L de agua del grifo y dejar que la turba pellets de absorber el agua durante 2 horas. </li><li> Añadir 2 N. benthamiana semillas en cada una turba de pellets con una sembradora, cubrir la bandeja con una cúpula de plástico transparente, y les permiten germinar en un C Humedad ambiente 25 °, el 84% con un ciclo día / noche de 16/8 horas (Figura 1). </li><li> Retire el domo dos semanas después de la siembra, drenar el agua de la bandeja, y añadir 2 litros de fertilizante de Jack a una concentración de 1,48 g / L (Figura 1B). Continuar para cultivar plantas en un entorno C Humedad 25 °, el 50% con una hr día / noche ciclo de 16/8. Suministro 2 L de fertilizante de Jack cada 2 días a la bandeja. </li><li> En la semana 4, transferir las plantas con pellets de turba a una nueva bandeja que aloja seis plantas para proporcionar un espacio adecuado para un mayor crecimiento (Figura 1C) hasta que estén listos para ser infiltrado a las 6 semanas de edad (figura1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Cultura Preparación 2.1 Preparación para la infiltración Jeringa <ol><li> Racha A. tumefaciens GV3101 cepas que contienen los vectores geminiviral p19, pREP110, pBYGFP, y pBYDsRed en placas de agar LB que contenían kanamicina (100 mg / ml). Racha de una cepa por placa y crecer a 30 º C durante 48 horas. </li><li> Del mismo modo, la raya y GV3101 crecer las cepas que albergan los vectores magnICON de la 5 &#39;módulo (pICH15879), el 3&#39; del módulo que contiene el gen diana de GFP o DsRed (Pich-GFP o Pich-DsRed), y la integrasa (pCH14011) en agar LB placas que contenían carbenicilina (100 mg / ml). </li><li> A partir de una sola colonia en la placa de agar LB, inocular GV3101 las cepas que albergan vectores geminiviral en 3 ml de YENB los medios de comunicación (0,75% de extracto de levadura Bacto, 0,8% Nutrient Broth, ajustar el pH a 7,5 con NaOH) + kanamicina (100 mg / ml) en un tubo de cultivo ml de fondo redondo de 15, crece el cultivo líquido a 30 ° C enun agitador durante la noche con una tasa de rotación de 300 rpm. </li><li> Del mismo modo, inocular GV3101 y crecer las cepas que albergan vectores magnICON en YENB medios + carbenicilina (100 mg / ml) durante la noche en un agitador a 30 ° C. </li><li> Los valores de medida y registro de DO 600 para cada cultivo líquido con un espectrofotómetro y utilizar la siguiente fórmula para calcular el volumen necesario (V sub) se subcultivaron para una nueva cultura con una OD de partida 600 de 0.025 en 10 ml de medio YENB con los antibióticos apropiados . Sub V (ml) = (10 ml) x (0.025) / OD 600 </li><li> Transferencia sub V (ml) del cultivo de una noche a (10 - V sub) ml de los medios de comunicación YENB con los antibióticos apropiados para cada cepa. Crecer el nuevo cultivo durante la noche a 30 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm hasta que el valor de la DO 600 está en el intervalo de 1,7-2,0. </li><li> Mida y registre OD 600 valores para cada cultivo líquido y utilizar la fórmula siguiente para calcular el volumen necesario (V inf) para ser diluido en 50 ml de tampón de infiltración para dar una DO600 final de 0,12 para cada cepa. Inf V (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Transferencia inf V (ml) de cada cultivo a un tubo de microcentrífuga y girar hacia abajo las células por centrifugación a 12.000 xg durante 2 min, a continuación, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de tampón de infiltración (MES 10 mM, pH 5,5; 10 mM MgSO 4) por agitación con vórtex brevemente. </li><li> Mezclar resuspendieron las células de pBYGFP pREP110 + + p19, girar las células hacia abajo a 12.000 xg durante 2 min, y volver a suspender en total de 50 ml de tampón de infiltración. Esta combinación es agrobacterias para la expresión de GFP geminiviral. </li><li> Del mismo modo, mezclar las siguientes combinaciones de células de Agrobacteria, girar hacia abajo y volver a suspender en 50 ml de tampón de infiltración. Estos incluyen (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 para la expresión geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 para geminiviral co-expresión de GFP y DsRed, (3) pREp110 + p19 como control negativo de la expresión geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 magnICON para la expresión de GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 para la expresión magnICON de DsRed, y (6) pICH15879 + pCH14011 como control negativo para la expresión magnICON. </li></ol> 2.2 Preparación para la infiltración al vacío <ol><li> Inocular y la cultura cada cepa GV3101 que contiene vectores geminiviral o vectores magnICON en 15 ml de medio de YENB con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 ml y esterilizado en autoclave crecer durante la noche como se describe para la infiltración por encima de jeringa. </li><li> Los valores de medida y registro de DO 600 para cada cultivo líquido con un espectrofotómetro y utilizar la siguiente fórmula para calcular el volumen necesario (V sub) se subcultivaron para una nueva cultura con una OD de partida 600 de 0.025 en 250 ml de medio YENB con los antibióticos apropiados . V sub </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0.025) / OD 600 </li><li> Transferencia sub V (ml) del cultivo de una noche a (250 - V sub) ml de los medios de comunicación YENB en un matraz de 1 L autoclavado con los antibióticos apropiados para cada cepa y crecer el nuevo cultivo durante la noche como se describe para la infiltración por encima de jeringa. </li><li> Medir y registrar OD 600 valores para cada cultivo líquido y utilizar la fórmula siguiente para calcular el volumen necesario (V inf) para ser diluido en 3 L de tampón de infiltración para dar una DO600 final de 0,12 para cada cepa. Inf V (ml) = (3.000 ml) x (0.12) / OD 600 </li><li> Precipitado y se resuspende V inf (ml) de cada cultivo en tampón de infiltración como se describe para la infiltración jeringa y mezclar las culturas resuspendidas de acuerdo con las combinaciones descritas para la infiltración jeringa. Repellet las células Agrobacteria mixtos y resuspender en 3 L de tampón de infiltración. </li></ol> 3.1 Jeringa infiltración <ol><li> Elija cuatro de 6 semanas de edad N. benthamiana plantas con 5 hojas cada uno. Las tres primeras hojas, contando desde la parte superior de cada planta se infiltraron en su totalidad con una de las combinaciones de A. tumefaciens cepas en tampón de infiltración. La cuarta hoja será spot-infiltrada con todas las combinaciones de cuatro cepas de expresión geminiviral o las tres combinaciones de expresión magnICON. La última hoja de cada planta se infiltró con combinaciones de controles negativos. </li><li> Crear un pequeño corte con una aguja en la epidermis en el lado posterior de la hoja (Figura 2A). Atención: asegurarse de no rayar tan duro como para perforar la hoja a través de ambos lados, como las células de Agrobacteria en la mezcla de infiltración pasarán a través de la punción para el otro lado de la hoja. </li><li> Tome un firme control de la parte frontal de la hoja y mientras se aplica suavela presión en contra de la nick con el pulgar de una mano, se inyectan las mezclas de Agrobacterium en tampón de infiltración en el nick con una jeringa sin aguja (Figura 2B). Nota: Como la mezcla de Agrobacterium que entra en el espacio intercelular de la hoja, el área infiltrada se volverá verde visiblemente más oscuro (Figura 2C). </li><li> Continuar para inyectar las mezclas de Agrobacterium en el nick hasta que el círculo verde más oscuro deja de expandirse. Cree otro nick y repita los pasos 3.1.2-3.1.4 hasta que toda la hoja se infiltra y toda la hoja se vuelve verde más oscuro para las tres primeras hojas y la última hoja. </li><li> Para la cuarta hoja de cada planta, todas las combinaciones de cuatro (vector geminiviral) o tres (magnICON vector) se infiltraron en ella. Haga un nick para cada combinación de cepas de Agrobacterium, y se infiltran cada nick con una combinación. </li><li> Después de la infiltración, mover las plantas de nuevo a la sala de crecimiento y moniexpresión de la proteína mediador entre 2-15 días después de la infiltración (dpi). </li></ol> 3.2 Vacío infiltración <ol><li> Coloque una bañera en un desecador de vacío y la transferencia de 3 l de tampón de infiltración que contiene las cepas de Agrobacterium a la bañera. Conectar el desecador a una bomba de vacío de diafragma de Vacuubrand (Figura 3A). </li><li> Coloque una planta boca abajo sobre la placa de desecador (Figura 3B) y bajar la placa con la planta hasta que todo el sistema de la hoja y tallo se sumergen en la memoria intermedia de la infiltración con la placa que descansa encima de la bañera. Coloque la junta tórica desecador a lo largo del borde y poner la tapa desecador de la cámara (Figura 3C). </li><li> Encienda la bomba de vacío y empezar a cronometrar cuando el vacío llega a 100 mbar. Abrir lentamente la válvula de descarga en el desecador después de 1 min a 100 mbar para permitir la entrada de Agrobacteria en los espacios intersticiales del tejido de la planta sumergida. Repita este paso uno addititiempo onal para asegurar una buena infiltración. </li><li> Después de la infiltración, tomar la planta del desecador y se puso de nuevo a su posición vertical. Mueva las plantas de nuevo a la cámara de crecimiento y expresión de proteínas de monitoreo entre 2-15 dpi. </li></ol> 4. Detección de la proteína fluorescente y fotografía <ol><li> A partir de 2 dpi, las plantas se mueven en el cuarto oscuro y brillar la luz UV en el envés de las hojas infiltradas con una lámpara UV de mano. </li><li> Observar la fluorescencia verde de GFP o la fluorescencia roja DsRed. GFP emite una señal más fuerte con la luz ultravioleta de onda larga, mientras DsRed es más fuerte a la luz ultravioleta de onda corta. </li><li> Tome fotografías de hojas fluorescentes con una cámara digital normal sin flash. </li><li> Mueva las plantas de nuevo a la cámara de crecimiento después de la observación o la fotografía. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

La creciente demanda de productos farmacéuticos basados ​​en proteínas en todo el mundo requieren de nuevas plataformas de producción que son robustas, escalables y de bajo costo y seguro. Las plantas han demostrado ser uno de los sistemas de producción alternativas más prometedoras para la producción de la proteína farmacéutica. En los últimos años, el desarrollo de vectores basados ​​en virus deconstruido ha permitido la expresión transitoria de proteínas en plantas, lo que mejora en gran medida la...

Desde la década de 1970, las plantas han sido explorados como alternativas a los cultivos de células de mamíferos, insectos, y bacteriana para la producción comercial de proteínas recombinantes y proteínas terapéuticas 1. Sistemas a base de plantas para la expresión de los productos biofarmacéuticos han demostrado ser prometedores en los últimos años varios nuevos tratamientos para enfermedades, como la enfermedad de Gaucher 2, y la gripe aviar H5N1 3, han demostrado tener éxito en los ensayos clínicos. El desarrollo de mecanismos competentes para la expresión de proteínas recombinantes en plantas en las décadas desde los primeros experimentos se ha creado el potencial para los sistemas basados ​​en plantas para alterar el paradigma actual de la producción de proteínas por tres razones principales. En primer lugar, hay una disminución notable en coste como biorreactores de mamíferos, insectos, y bacteriana requieren considerables costos de inicio, medios de cultivo costosos, complicados y procesos para la purificación aguas abajo 4. La creación de plantas transgénicas estableslíneas también les permite superan la escalabilidad de otros sistemas de expresión como las plantas que expresan proteínas podrían ser cultivados y cosechados a escala agrícola 5. En segundo lugar, los sistemas de expresión basados ​​en plantas reducen significativamente el riesgo de transmitir un patógeno humano o animal desde el host expresan la proteína a los seres humanos, lo que demuestra la superioridad en la seguridad pública 6. Por último, las plantas utilizan un sistema de endomembranas eucariota que es similar a las células de mamíferos, lo que permite apropiada modificación post-traduccional de proteínas, incluyendo glicosilación y el ensamblaje de las proteínas de la subunidad múltiple 7. Esta capacidad pone los sistemas a base de plantas por delante de los basados ​​en sistemas procariotas, tales como bacterias, ya que un número más amplio de proteínas farmacéuticas recombinantes, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAb), tienen una estructura más complicada y requerir extensas modificaciones posteriores a la traducción o de montaje 8. Hay dos grandes aprodolores de la expresión de proteínas recombinantes en plantas. El primero es el desarrollo de una línea transgénica de manera estable, donde el ADN que codifica para la proteína diana se clona en un casete de expresión y se introduce a cualquiera de los genomas nucleares o de cloroplastos. De este modo, el ADN extraño se convierte en heredables a través de las generaciones sucesivas y permite enormemente mejorado escalabilidad, mucho más allá de la de otros sistemas de expresión 1. La introducción de ADN exógeno al genoma nuclear se logra por lo general por la infección de Agrobacterium tumefaciens del tejido de la planta o, con menos frecuencia, por bombardeo con microproyectiles de los tejidos 9. Las hormonas vegetales se utilizan entonces para inducir la diferenciación y el crecimiento de tejido de la planta transgénica, tales como raíces y hojas. La transformación del genoma del cloroplasto no se puede lograr con A. tumefaciens, pero depende enteramente de oro o tungsteno recubiertas con ADN dispararon balísticamente en las células vegetales. El segundo método de expresión de recombinaciónproteína nt de plantas es a través de la expresión transitoria 10. En este escenario, los vectores derivados de virus que albergan el gen de interés se entregan a través de A. tumefaciens a plantas completamente desarrolladas a través de un proceso llamado agroinfiltration. En lugar de integrarse en el genoma de la planta, la construcción del gen entregado entonces comenzará a dirigir la producción transitoria de la proteína deseada, que se puede recoger y aislado después de un corto período de incubación. Expresión transitoria de genes ofrece la ventaja de una mayor acumulación de proteínas en general, así como una mejora del tiempo de producción de proteínas, como las plantas estarán listas para la cosecha de aproximadamente 1-2 semanas después de la agroinfiltración 11. Esto es significativamente más rápido que los procesos de generación, selección, y la confirmación de líneas estables de plantas transgénicas, que pueden tardar varios meses a un año. Sin embargo, esta es también la limitación del sistema de expresión transitoria, ya que no dará lugar a la planta genéticamente estable lines que se pueden utilizar para generar un banco de semillas para la producción comercial a gran escala. A pesar de esto, se han desarrollado enfoques para mejorar la expresión transitoria a gran escala. Aquí se demuestra un método de generación de proteínas que expresan plantas de Nicotiana benthamiana transitorios usando vectores virales deconstruidos entregados por A. tumefaciens. Dos métodos principales se están desarrollando para la entrega de A. tumefaciens en el tejido vegetal: Banco infiltración escala mediante una jeringa y la infiltración a gran escala a través de la cámara de vacío. Ambos protocolos se describen aquí usando N. benthamiana, que está estrechamente relacionado con la planta de tabaco común, ya que la planta huésped para la expresión transitoria de dos proteínas fluorescentes: la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa Aequorea victoria y la proteína fluorescente roja de Discosoma de coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana es la planta huésped más común paraproteína recombinante, ya que es susceptible de transformación genética, puede producir grandes cantidades de biomasa con rapidez, y es un prolífico productor de semillas para la producción de ampliación 14. Otra ventaja de la utilización de N. benthamiana como huéspedes para la expresión de la proteína es la disponibilidad de una variedad de vectores de expresión de 2,5. En este estudio, dos vectores virales deconstruido, uno basado en un virus del mosaico del tabaco (TMV) ARN replicón sistema (vectores magnICON) y la otra derivada del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) sistema de replicón de ADN (vectores geminiviral) 4,11, 15-18, se utilizan para llevar el gen GFP y DsRed y entregarlos en N. células benthamiana mediante A. tumefaciens. Tres construcciones de ADN serán utilizados para GFP o expresión DsRed con vectores magnICON. Ellos incluyen &#39;módulo (pICH15879) que contiene el promotor y otros elementos genéticos para la conducción de la expresión del gen diana, el 3&#39; del módulo 5 que contiene el gen de interés (PICH-GFP o Pich-DsRed), y el módulo de la integrasa (pICH14011) que codifica para una enzima que integra el 5 &#39;y 3&#39; módulos juntos tras la expresión 8,15. También se necesitan tres construcciones de ADN para la expresión con vectores geminiviral. Además de los vectores que contienen el replicón del gen diana (pBYGFP o pBYDsRed), se requiere un vector que codifica para la proteína de replicación (pREP110) para la amplificación de la diana replicón 11,14,16. Por otra parte, se desea la inclusión de un vector que codifica la p19 supresor de silenciamiento del virus del enanismo ramificado del tomate para la expresión del gen diana de alto nivel de 11,16. En general, existen tres pasos principales para la introducción de genes de proteínas recombinantes en células de plantas por agroinfiltration incluyendo el crecimiento de la planta, A. preparación de cultivo tumefaciens, y la infiltración. Se ofrece como cada paso es fundamental para el éxito final de este procedimiento, por lo tanto, una descripción detallada de cadatanto para la infiltración de jeringa y la infiltración al vacío a continuación.

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		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V353-20</td>
			<td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> See reference: Lico and Chen, et al 2008</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632152</td>
			<td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> See reference: Baird and Zacharias, et al 2000</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MagnICON Vector</td>
			<td>Icon Genetics</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Geminiviral Vector</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Chen and He, et al 2011</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>N. benthamiana</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Lai and Chen 2012</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin-100, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0418</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Kanamycin-50, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0543</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium sulfate hepa hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773-500 g</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difco Nutrient Broth</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 234000</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MES hydrate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-1kg</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1613-1ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70560-51-9</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's Fertilizer</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Jul-25</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-878-113</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuum Air Regulator Valve</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386590</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Desiccator 12 1/8" with O ring</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-594-15C </td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>3 L Tub</td>
			<td>Rubber-Maid</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>plate/shelf 230ML</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9489269</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peat Pellet</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-2370-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagation Tray Dome</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>132052</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagaiton Tray</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>138758</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Virbo Hand Seeder</td>
			<td>Gro-Mor INC</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank">www.gro-morent.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flora Cart 4 shelf</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>65-6924-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Round Bottom Culture Tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430172-500EA</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>223-9950</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>166-0602EDU</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator/Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank">www.eppendorf.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultraviolet Light Model#: UVGL-25</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0021-12</td>
			<td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins

Cultivo de células de mamíferos es la plataforma importante para la producción comercial de vacunas humanas y proteínas terapéuticas. Sin embargo, no puede satisfacer la creciente demanda mundial de productos farmacéuticos, debido a su limitada capacidad de ampliación y alto costo. Las plantas han demostrado ser una de las plataformas de producción farmacéuticas alternativas más prometedoras que son robustas, escalable, de bajo coste y seguro. El reciente desarrollo de vectores basados ​​en virus ha permitido la expresión transitoria rápida y de alto nivel de proteínas recombinantes en plantas. Para optimizar aún más la utilidad del sistema de expresión transitoria, se demuestra una metodología simple, eficiente y escalable para introducir objetivo-gen que contiene Agrobacterium en tejido de la planta en este estudio. Nuestros resultados indican que tanto agroinfiltración con jeringa de vacío y métodos han dado lugar a la introducción eficiente de Agrobacterium en las hojas y de producción robusta de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed. Por otra parte,demostramos las ventajas únicas que ofrece por ambos métodos. Infiltración de jeringa es simple y no necesita un equipo costoso. También permite la flexibilidad para infiltrarse ya sea toda la licencia con un solo gen diana, o para introducir genes de múltiples objetivos en una hoja. Por lo tanto, se puede utilizar para la expresión a escala de laboratorio de proteínas recombinantes, así como para la comparación de diferentes proteínas o vectores de rendimiento o expresión cinética. La simplicidad de la infiltración de la jeringa también sugiere su utilidad en la escuela secundaria y la educación universitaria para el tema de la biotecnología. Por el contrario, la infiltración de vacío es más robusto y puede ser mayor escala para la fabricación comercial de proteínas farmacéuticas. También ofrece la ventaja de ser capaz de agroinfiltrate especies de plantas que no son susceptibles para la infiltración jeringa como la lechuga y Arabidopsis. En general, la combinación de jeringa y agroinfiltración de vacío proporciona a los investigadores y educadores un simple, eficiente y robustometodología para la expresión de proteína transitoria. Además, facilitará en gran medida el desarrollo de proteínas farmacéuticas y promover la educación científica.

1. Expresión de proteínas fluorescentes por infiltración Jeringa Para demostrar la eficacia de la jeringa de la infiltración de Agrobacterium en el tejido de la planta, se probó la expresión de dos proteínas fluorescentes - GFP y DsRed - por dos vectores diferentes deconstruido de plantas virales - geminiviral y magnICON - en N. benthamiana. Por N. benthamiana hojas que fueron totalmente infiltrados con vectores que contienen geminiviral Agrobacteria, ...

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Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que contiene<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; En plantas para la expresión transitoria de proteínas.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

47.7K vistas.  Arizona State University. Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que contiene Agrobacterium tumefaciens En plantas para la expresión transitoria de proteínas.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expresión de proteínas recombinantes en la levadura metilotrófica Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Transformación transitoria de plantas de cacao utilizando Agrobacterium tumefaciens

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation rely on the use of Agrobacterium-mediated transformation. However, the protocols currently in use are standardized for small-sized plants due to the physical and economic constraints of submitting large-sized plants to a vacuum treatment. This work presents an effective protocol for localized vacuum-based agroinfiltration customized for large-sized plants. To assess the efficacy of the proposed method, we tested its use in cacao plants, a tropical plant species recalcitrant to genetic transformation. Our protocol allowed applying up to 0.07 MPa vacuum, with repetitions, to a localized aerial part of cacao leaves, making it possible to force the infiltration of Agrobacterium into the intercellular spaces of attached leaves. As a result, we achieved the Agrobacterium-mediated transient in planta transformation of attached cacao leaves expressing for the RUBY reporter system. This is also the first Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao. This protocol would allow the application of the vacuum-based agroinfiltration method to other plant species with similar size constraints and open the door for the in planta characterization of genes in recalcitrant woody, large-size species.

Autor destacado: Transformación mediada por agrobacterias sin cultivo de tejidos en grandes plantas leñosas

Here, we present the first protocol for localized vacuum infiltration for in vivo studies of the genetic transformation of large-sized plants. Using this methodology, we achieved for the first time the Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao.

Agroinfiltración forzada al vacío para la transformación in planta de plantas recalcitrantes: el cacao como caso de estudio

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...