Los autores agradecen a la Fundación de Investigación de Flandes (FWO-Vlaanderen, Bélgica, G.0601.11) y la Universidad Católica de Lovaina Investigación Fundación GOA/11/002. IB, TJ y LT se benefician de una beca de la FWO-Vlaanderen.

Nota: Todas las acciones en las que las células están involucradas deben llevarse a cabo en un ambiente estéril, trabajando en un flujo laminar. 1. Mantenimiento de la línea celular HEK293T <ol><li> Cultivar las células HEK293T en un matraz T-75 a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% humidificado. </li><li> Pasaje de las células cuando se alcanza una confluencia de 80%. Nota: Esto toma normalmente de 3 a 4 días. Las células en cultivo continuo permiten 20-25 pasajes utilizables para la detección. <ol><li> Coloque salina tamponada con fosfato de la Dulbecco (PBS) sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, PBS--tripsina etilendiaminotetraacético ácido (EDTA) (500 ml de PBS suplementado con 10 ml de solución de tripsina-EDTA y 4,5 ml de 4% de EDTA) y medio de crecimiento (500 ml medio de Eagle modificado de Dulbecco - altos de glucosa [DMEM] suplementado con 10% de suero fetal bovino [FBS] y 1 mM de penicilina-estreptomicina [PS]) a temperatura ambiente media hora de antelación. </li><li> Eliminarel viejo medio de crecimiento de las células. Enjuague las células muertas con 3 ml de PBS y retire la PBS de nuevo. </li><li> Añadir 3 ml de PBS-tripsina-EDTA, se incuba durante 1 min a temperatura ambiente y eliminar la solución Nota: La morfología de las células cambiará de a en forma de esfera en forma de estrella. </li><li> Aflojar las células del fondo del matraz golpeando ligeramente y recoger las células por lavado la parte inferior varias veces con 10 ml de medio de crecimiento fresco. </li><li> Se transfiere 1 ml del cultivo de células en un nuevo T-75 frasco contiene 14 ml de medio de cultivo fresco y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% humidificado. </li></ol></li></ol> 2. Transfección transitoria de células HEK293T <ol><li> Cultivar las células HEK293T en un matraz T-75 3 días antes del ensayo real de movilización de calcio se lleva a cabo. Asegúrese de utilizar tres matraces T-75, uno para la transfección con la construcción del receptor, una para la transfección con un vector vacío de expresión, como control negativo, y oNE para el control de transfección. Nota: El paso de las células se realizó como se describe en el paso 1.2. Cuando varias placas de 96 pocillos tienen que ser controlados, matraces T-150 se puede utilizar para obtener un mayor rendimiento de las células (para ello, dobles, todas las cantidades que figuran en los pasos 1.2.5, 2.3, 3.1.3 y 3.1.4) . </li><li> Los frascos se incuban a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado 5% de 20 a 24 horas hasta que los cultivos celulares se acercan a un 50-70% de confluencia. </li><li> Co-transfectar una población de células con el vector de expresión que codifica el GPCR de interés y la Gα 16 constructo, el segundo matraz con el vector vacío y el constructo Gα 16, y el tercero con el control de transfección y la Gα 16 constructo. Nota: En este protocolo, el receptor de Drosophila sNPF fue clonado en un vector de expresión de mamífero pcDNA3.1 13. JetPRIME se utilizó para realizar la transfección, pero otros reactivos de transfección se puede utilizar también. <ol><li> Añadir aotal de 7,8 g de ADN (3,9 mg constructo receptor o vector vacío, y 3,9 mg Gα 16 construcción de expresión) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 500 l de la memoria intermedia JetPRIME. Mezclar bien por agitación del tubo y centrifugar brevemente. </li><li> Añadir 37,5 l de reactivo JetPRIME, vortex y centrifugar durante 1 min a 14.000 x g. Incubar la transfección mezcla 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir gota a gota la mezcla de transfección al medio de cultivo celular y asegúrese de pipeta directamente en el medio de evitar el contacto con las paredes del matraz de cultivo. Los frascos se incuban a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado 5% de 20-24 h. </li></ol></li></ol> 3. Ensayo de movilización de calcio <ol><li> Recoger las células transfectadas y sembrar en placas de 96 pocillos de paredes negras, claras inferior. <ol><li> Coloque el PBS, PBS-Tripsina-EDTA y el medio de transferencia de DMEM (500 ml de DMEM suplementado con 10% FBS dializadoy 1% PS) a temperatura ambiente media hora de antelación. </li><li> Escudo el 96 pocillos, placas de fondo transparente de paredes negras con 60 l de PBS con fibronectina (0,0025%) por pocillo (5,85 ml de PBS y 150 l de fibronectina [0,1%] por placa). Incubar las placas a temperatura ambiente durante 1 hora con la tapa puesta. Eliminar la solución de los pocillos y las placas se incuban de nuevo durante 1 hora sin la tapa en a temperatura ambiente. Alternativamente, es posible utilizar placas de pre-revestidos para mejorar la unión de las células. </li><li> Quítese el viejo medio de crecimiento de las células y las células muertas de enjuague con 3 ml de PBS y retire la PBS. </li><li> Añadir 3 ml de PBS-tripsina-EDTA, se incuba durante 1 min, a continuación, retire la solución. Nota: La morfología de las células cambia de forma de estrella con forma de esfera a. </li><li> Aflojar las células del fondo del matraz golpeando ligeramente y recogerlas por lavado varias veces con 10 ml de medio de transferencia de DMEM. Transferencia de las células en un tubo Falcon de 50 ml. </li><li> Cuente elnúmero de células por ml (realizó con un NucleoCounter aquí, pero de una cámara de Burker es aceptable). Añadir 100 l de cultivo celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 100 l de tampón de lisis y mezclar tocando el tubo. Añadir 100 l de tampón estabilizar y mezclar tocando. </li><li> Llenar un NucleoCassette con la suspensión de células y contar las células con el contador. Multiplicar el número de células por tres, como las células se diluyeron por un factor de tres, cuando la adición de la lisis y la estabilización de tampón en el paso 3.1.6. </li><li> Diluir las células hasta una concentración final de 600.000 células / ml y sembrar 150 l de las células por pocillo en las placas recubiertas para obtener una densidad celular de aproximadamente 90.000 células por / pocillo. Evite las burbujas de aire y toque la placa de difundir las células de manera uniforme con el fin de obtener una capa de células contiguas. Incubar las placas a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado 5% durante 16-24 horas. </li></ol></li><li> Cargar las células con el colorante fluorescente y preparar el coplaca mpound. <ol><li> Prepare una solución salina equilibrada de Hank (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / albúmina de suero bovino (BSA) de amortiguación: añadir 165 l de solución madre CaCl2 (1 M CaCl2 en agua destilada [DH 2 O] - guárdelo a temperatura ambiente), solución de 500 l HEPES acciones (1 M HEPES en dH 2 O, pH 7,4 - guárdelo a temperatura ambiente), y 0,05 g de BSA a 50 ml de HBSS. Tenga en cuenta que el ácido graso libre de BSA se utiliza para los ensayos de calcio, como ácidos grasos pueden activar los receptores específicos que afecte a la señal de calcio del receptor de interés. </li><li> Preparar la solución de probenecid (100x, 250 mM): disolver 0,71 g de probenecid en 5 ml de NaOH (1 M) y añadir 50 l HEPES solución madre y 5 ml de la / HEPES / Ca 2 + tampón HBSS / BSA - Siempre prepare solución fresca. Nota: El probenecid inhibe transportadores de aniones inorgánicos que se pueden desprender de Fluo-4 desde el citoplasma, reduciendo de este modo la señal fluorescente. Se recomienda llevar a cabo la carga de colorante enla presencia y ausencia de probenecid para determinar si los transportadores de aniones inorgánicos presentan un problema potencial en las líneas de células particulares bajo investigación, como probenecid puede incluso disminuir la señal mediada por el agonista. </li><li> Prepare el buffer de lavado: añadir 500 l de solución de probenecid a 50 ml HBSS / HEPES / Ca 2 + / tampón BSA, ajustar el pH a 7,4 y filtrar la solución tampón. Siempre prepare tampón fresco, y 50 ml de tampón por se requiere placa. </li><li> Preparar la solución de ácido plurónico 10%: mezclar 50 l de ácido plurónico (20% w / v en dimetil-sulfóxido [DMSO]) con 50 l de DMSO - si se produce la cristalización, el calor a 37 ° C y siempre preparar una solución fresca. </li><li> Preparar Fluo-4 AM solución (1 mM): añadir 44 l solución de ácido plurónico 10% a un vial que contiene 50 mg de Fluo-4 a.m. y agitar hasta que se disuelve completamente. Evite la exposición a la luz para evitar la decoloración del fluoróforo. </li><li> Prepare el tampón de carga: añadir 8,8 ml DMEM supplemented con HEPES 10 mM y probenecid 2,5 mM (pH 7,4) a la solución de Fluo-4 a.m. (44 l) y agitar. Utilice siempre tampón fresco. </li><li> Desechar medio de las células, se lavan las células con 200 l de PBS por pocillo, y eliminar PBS. </li><li> Añadir 55 l de tampón de carga por pocillo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Envolver la placa en papel de aluminio para evitar la exposición de la placa a la luz. </li><li> Asegúrese de secar los compuestos antes de la pantalla si se disuelven en disolventes que son perjudiciales (por ejemplo, acetonitrilo) para el sistema de expresión celular. </li><li> Solubilizar los péptidos en tampón de lavado en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga siliconados. Preparar una serie de diluciones para llevar a cabo un análisis de concentración-respuesta y para determinar el valor de CE 50 de un ligando. Añadir 70 l de ligando en el pocillo correspondiente de la placa de compuesto (placas de 96 pocillos en forma de V) e incluyen controles positivos (agonista endógeno) y negativos (tampón de lavado) en cada plato. No<html> E: Si un compuesto no es soluble en el tampón de lavado, se puede tratar de otros disolventes que no son perjudiciales para las células bajo investigación, tales como el agua o soluciones que emulsionan y solubilizar aceites y otras sustancias insolubles en agua (por ejemplo, Kolliphor EL) . </li><li> Mida todas las muestras por triplicado. Tenga en cuenta que 50 l de un ligando de la placa de compuesto se transferirán a un pozo con 100 l de tampón de lavado de la placa de la célula durante el ensayo, por lo que la preparación de los compuestos a 3 veces la concentración final deseada. </li><li> Desechar el tampón de carga de la placa de células y añadir tampón de lavado 100 l a cada pocillo. Incubar la placa 15 min a temperatura ambiente y evitar la exposición a la luz. </li><li> Deseche el tampón de lavado de la placa celular y añadir 100 nuevo buffer de lavado l a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa celular, la placa de compuesto, y un estante de la punta (96 pocillos, puntas de pipetas dispositivo de estación) durante 15 min a 37 ° C. </li></ol></li></ol>título &quot;&gt; 4. Ensayo sobre el dispositivo de la estación <ol><li> Crear y cargar el archivo de protocolo deseado con el software y activar la unidad de control de temperatura para la cámara de lectura. Aquí, medir las respuestas de calcio a 37 ° C durante 2 minutos una fila a la vez con 1.52 segundos de intervalo entre lecturas sucesivas (la medición de una placa de 96 pocillos completa tarda aproximadamente 25 min) a 525 nm. Establecer la excitación de Fluo-4 a 488 nm y transferir un volumen total de 50 l de compuesto a la placa de células, 18 seg después del inicio de lectura, con la velocidad de dispensación fijado en 26 mu l / s y una altura de pipeta de 135 l. </li><li> Coloque el compuesto y la placa de la célula, y la cremallera de punta en los cajones correspondientes del dispositivo de estación. </li><li> Lleve a cabo una sola lectura de la placa de la célula al mismo excitación y emisión de longitud de onda en el modo de punto final, antes de iniciar la pantalla real en modo FLEX. Nota: Esta medición da unidad de los valores de fluorescencia relativa (RFU) y permite la detección de la variabilidad entre noslls de la placa. Los valores entre 20000 y 40000 son considerados como aceptables. </li><li> Inicie el ensayo y análisis de los datos con el software. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de movilización de calcio basado en la fluorescencia se aplicó con éxito para confirmar la caracterización funcional del sistema de señalización peptidergic de Drosophila sNPF, que ya fue realizada por Mertens et al. con un ensayo de bioluminiscencia y por Feng et al. con un 13,15 ensayo electrofisiológico. Los valores de EC50 obtenidos con el ensayo de fluorescencia en las células HEK293T son alrededor de 10 veces menos que los obtenidos con el ensayo de bioluminiscencia realizado en células CHO (Drome-sNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drome-sNPF- 2: fluo = 5,89 nM, lumi = 42 nM; Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM; Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Estas variaciones se explican por diversos factores, como el hecho de que uno de los sistemas de expresión utilizados pueden ser más adecuados para la expresión funcional de un receptor dado, o el plegamiento de algunos receptores puede ser menos eficiente en ctipos de células Ertain. Los valores de EC50 de los cuatro péptidos Drome-sNPF están en el rango nanomolar cuando se prueba en su receptor con tanto la fluorescencia y el ensayo de bioluminiscencia, en general, el apoyo a la relevancia fisiológica de su interacción péptido-receptor in vivo. Tenga en cuenta que ningún control de la transfección con un receptor para el que se conoce el ligando activador se incluyó en la pantalla que se presenta aquí, debido a que el sistema de señalización de Drosophila sNPF es normalmente el control de transfección en configuraciones experimentales. El control positivo con un ligando endógeno de las células HEK293T (PAR 1) y el control negativo (tampón de lavado) se incluyeron en la pantalla. Los resultados de PAR 1 mostraron que las células estaban en un buen estado. El control negativo (tampón de lavado) no indujo una señal fluorescente, que indica que el medio en el que se disuelven los péptidos estaba libre de cualquier contaminante que podrían INFluence los resultados. Se utilizó el sistema de señalización de Drosophila sNPF caracterizado previamente aquí para explicar el ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia. Para este propósito, la serie de concentración de los ligandos activadores se ensayaron inmediatamente. Sin embargo, cuando un receptor huérfano se lleva a la sobreexpresión en un ensayo de cribado para probar una biblioteca que contiene cientos de compuestos, se recomienda primera pantalla con concentraciones finales relativamente altos de los ligandos (por ejemplo., 10 o 1 mM). Tras la detección de un compuesto activador, una serie de dilución de compuesto que se puede cribar con el fin de componer una curva de concentración-respuesta y para determinar el valor de CE 50. Una vez que se determina la activación de ligando de un receptor, la vía de señalización intracelular puede investigarse más a fondo mediante la adaptación del protocolo. El ensayo se puede realizar como se describe anteriormente, pero sin la co-transfección del G ^5; 16 subunidad. Cuando se mide una respuesta de calcio, que significa que las parejas receptor con una endógeno Gα q subunidad del sistema de expresión celular. Cuando no se observa ninguna señal fluorescente, los protocolos para medir los cambios en las concentraciones de otros mensajeros secundarios (p. ej., Camp) se pueden aplicar. Estudios de relación estructura-actividad (SAR) también pueden llevarse a cabo para definir secuencia central del péptido requerida para la activación del receptor. En primer lugar, secuencias truncadas se evalúan para definir la secuencia de aminoácidos mínima del péptido que todavía es capaz de activar el receptor. A continuación, los péptidos se pueden probar en el que sistemáticamente cada aminoácido ha sido sustituido por un residuo de alanina. Prueba de serie-la sustitución de alanina sintético en el receptor permite determinar la importancia de cada uno de los aminoácidos para la activación de los receptores 24,25. A pesar de su uso frecuente y eficiencia demostradascacia, se ha de destacar que el ensayo descrito aquí puede necesitar algunas adaptaciones para obtener resultados óptimos para los receptores específicos de interés. La subunidad Gα 16 tiene la ventaja de que se une a la mayoría de los GPCR, pero también puede tener un efecto dominante negativo sobre los receptores que endógenamente pareja a través de Gα Q 22. En este caso, puede ser útil para probar diferentes combinaciones de las proteínas G durante la optimización de un ensayo de calcio novela y para comparar los resultados para Gα receptores q acoplado en la ausencia o presencia de Gα 16. Ensayos alternativos que son independientes de la interacción de proteínas G para detectar la activación del receptor también se pueden realizar, tales como la translocación de arrestina GFP marcado, o la detección de cambios en el potencial de membrana (por ejemplo., Por el Kit de Ensayo de Potencial de Membrana FLIPR). Además de la Fluo-04 a.m. utiliza aquí, una amplia gama de otros fluoróforos sensibles al calcio, cada uno con su propia espectral y chemiccol propiedades, disponible. El fluoróforo más adecuado puede ser seleccionado basado en el GPCR, tipo de célula y el lector de placas disponibles, pero la verificación experimental es necesario. Las cantidades de ADN transfectadas y la necesidad de relación de reactivo DNA / transfección que se determine para cada combinación línea de células de reactivo receptor de la transfección. Por último, se debe tener en cuenta que las células en cultivo continuo sólo permiten 20-25 pasajes utilizables para llevar a cabo los ensayos de selección.

Receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) constituyen una de las familias más grandes y diversos entre todas las proteínas de la superficie celular. Su presencia en los vertebrados, invertebrados, plantas, levaduras y moho del lodo, así como en los protozoos y metazoos el primer diploblastic indica que los GPCR están entre las moléculas más antiguos vinculados con la transducción de señales 1. Sus ligandos activadores naturales comprenden una amplia diversidad de estímulos externos, incluyendo péptidos, aminas biogénicas, odorantes, glicoproteínas, y fotones 2. Como tal, estos sistemas de señalización de receptor-ligando están involucrados en una gran variedad de procesos fisiológicos. El amplio espectro funcional hace idealmente adecuado para el desarrollo de fármacos terapéuticos que cubren una amplia gama de enfermedades humanas. Acerca de 50-60% de los objetivos actuales de la droga están representados por GPCRs 3,4. Además de su gran importancia en la industria farmacéutica, los GPCR están también en el centro de atención para el desarrollo de unnueva generación de insecticidas específicos para cada especie 5,6 y plaguicidas en general. Debido a que los ligandos naturales de los GPCR son muchos aún sin identificar, que se clasifican como GPCR huérfanos. El deorphanization de estos receptores se mejorará la comprensión de sus funciones fisiológicas en los organismos y puede descubrir los supuestos objetivos para nuevas aplicaciones de medicamentos 7. Desde la era genómica, la estrategia de la farmacología inversa es ampliamente aplicada para el deorphanization de GPCRs 8. El enfoque implica que un receptor huérfano se utiliza como un &quot;gancho&quot; a &#39;pez fuera&#39; su ligando activando partir de un extracto biológico o a partir de una biblioteca de compuestos sintéticos. Por consiguiente, el GPCR de interés se clona y posteriormente se transfecta en un sistema de expresión celular. En los métodos más comúnmente utilizados, la activación del receptor se determina mediante la medición de los cambios en la concentración de moléculas de segundos mensajeros 9 </sup&gt;. Los principales ensayos de selección del receptor se basan en proteínas bioluminiscentes sensibles al calcio (por ejemplo, aecuorina) 10 o indicadores de calcio fluorescentes (por ejemplo, Fluo-4) 11. Los ensayos basados ​​en fluorescencia, en la que las células que expresan el receptor se cargan con un indicador de calcio fluorescente antes de la selección del ligando, tienen la ventaja de que permiten el cribado de alto rendimiento debido a su facilidad de uso, tiempo de lectura corta, y la flexibilidad de cribado múltiples receptores huérfanos en un plato único de 12. Aquí, el ensayo de movilización de calcio basado en la fluorescencia se describe y se ilustra por el proceso de deorphanization de la Drosophila melanogaster corto neuropéptido F del receptor (sNPF) a fondo. Este sistema de señalización neuropeptidérgico se caracterizó originalmente por Mertens et al. en 2002 13 con un ensayo de bioluminiscencia de calcio realizado en las células (CHO) de ovario de hámster chino14 y por Feng et al. En 2003 con un ensayo electrofisiológico utilizando Xenopus ovocitos 15. La presencia del sistema de señalización de sNPF parece estar limitada al filo de Arthropoda, donde está implicada en una amplia gama de procesos que incluyen la regulación de la alimentación, el crecimiento, las reacciones de estrés, la locomoción, y los ritmos circadianos 16. La investigación sobre los sistemas de señalización neuropeptidérgico en insectos no sólo puede conducir a nuevas dianas para el desarrollo de insecticidas, pero el conocimiento de su funcionamiento también puede ser extrapolado a otros organismos como muchos sistemas de señalización han sido generalmente bien conservadas durante la evolución 17. En la última década, se han hecho grandes avances en el proceso deorphanization de GPCRs neuropéptido insectos. A pesar de estos esfuerzos, sólo un pequeño número de receptores se han adaptado a su ligando afín, y las cargas de información de secuencia paranuevos GPCR huérfanos se ha convertido en disponible debido al auge de la genómica 18. La disponibilidad de enfoques / selección de alto rendimiento medianas, como el ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que ha demostrado ser una técnica ampliamente aplicado 9,18, por lo tanto, es de gran valor. El ensayo de movilización de calcio basado en la fluorescencia como se describe aquí se lleva a cabo en el 293T de riñón embrionario humano (HEK293T) línea celular y utiliza una sonda fluorescente para determinar los cambios en las concentraciones de calcio intracelular después de la activación del receptor. Para garantizar una alta expresión y los niveles de traducción del receptor, una secuencia de consenso de Kozak 19 se añade al extremo 5 &#39;de la secuencia del receptor-codificación, que posteriormente se clona en un vector de expresión (por ejemplo, serie del vector pcDNA para líneas celulares de mamífero). Como es difícil de predecir la proteína G de acoplamiento de un GPCR endógeno huérfano basado en información de la secuenciasolo, el segundo moléculas mensajeras (por ejemplo, calcio o cAMP) que se modulan después de la activación del receptor de frecuencia se desconocen antes de la identificación de ligandos. Para evitar este problema, las proteínas G promiscuas de la familia T q (por ejemplo, murino Gα 15 o Gα humano 16 [utilizado aquí]) o proteínas G quiméricas (por ejemplo, Gα qi5) que interactúan con la mayoría de los GPCR e inducen la liberación de calcio puede ser co-expresados ​​20,21,22. Tras la unión del ligando a su receptor, el GPCR sufre un cambio conformacional que conduce a la activación de las vías intracelulares específicas. La molécula de difosfato de guanosina (PIB), con destino en condiciones de reposo a la subunidad Gα 16, será reemplazado por un trifosfato de guanosina (GTP) molécula. Esto provoca la disociación de la proteína G heterotrimérica en un Gα 16 y Gβγ subunidad. El Gα 16 subunidad activa la fosfolipasa C &amp;# 946; (PLCß), que a su vez hidroliza el fosfatidilinositol bisfosfato unido a la membrana (PIP 2) resultante en diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP 3). IP 3 se extienda por todo el citoplasma y activa los canales de calcio de PI 3-dependientes presentes en la membrana del retículo endoplásmico, que induce la liberación de calcio en el citoplasma. La liberación de calcio a la activación del receptor se produce en cuestión de segundos y puede detectarse mediante la carga de las células antes de que el ensayo de cribado con un colorante sensible al calcio, Fluo-4 como acetoximetilo (AM) 11. El grupo éster AM permite que el fluoróforo de cruzar la membrana de la célula y se escinde por esterasas citoplásmicas una vez dentro de la célula. En consecuencia, las cargas negativas de el tinte fluorescente se desenmascarados, evitando que se difunda fuera de la célula y lo que le permite interactuar con iones de calcio. La señal o fluorescentef Fluo-4 es despreciable en las células en condiciones de reposo sólo contienen concentraciones de calcio en el rango nanomolar. Sin embargo, cuando el calcio se libera tras la activación del receptor, la señal puede aumentar dependiente de la concentración a más de un 100 veces, este medio asegurar una gran relación de señal a ruido. Fluo-4 también muestra un amplio rango dinámico para la presentación de informes [calcio] alrededor de una Kd (calcio) de 345 nM, lo que es adecuado para medir los cambios de calcio fisiológicamente relevantes en una amplia gama de células. La excitación de Fluo-4 se produce a 488 nm y la emisión de fluorescencia se mide a 525 nm 11. Fluorímetros como el lector de placas de imágenes de fluorescencia (FLIPR) 23, el Novostar, o la FlexStation (dispositivo de estación) 12 son sistemas de medio / alto rendimiento que permiten la adición del compuesto simultánea y la detección de la señal de Fluo-4 tras la activación del receptor para cada bien en una placa de ensayo. El ensayo de movilización de calcio descrito aquí se basa en la estacióndispositivo de sistema de microplaca de 96 pocillos. El software SoftMax Pro (software) se utiliza para operar el dispositivo de estación, así como para el análisis de datos. El programa muestra inmediatamente los resultados en forma de gráficos en formato de 96 pocillos. Los pozos pueden seleccionar varios al mismo tiempo para comparar los resultados de estos pozos en el mismo gráfico. Los valores de la unidad fluorescente relativa (RFU) de los pozos en cada columna se miden simultáneamente durante un período de dos minutos, comenzando antes de la adición de compuestos a los pocillos y continuando después de la medición de la señal fluorescente tras la activación del receptor. Típicamente, la tendencia de una curva para el agonista se alinea con la línea de base hasta un compuesto activador se añade a las células, lo que resulta en un rápido aumento de la señal fluorescente. La altura del pico se correlaciona con la concentración de agonista final en el pozo. Después de la cumbre, la señal fluorescente cae lentamente hacia el nivel basal. La mediciones RFU can puede convertir en curvas de concentración-respuesta para determinar el valor de CE 50 (concentración efectiva media máxima) de un ligando. En general, al menos tres pantallas independientes, cada uno con tres réplicas de una serie de concentraciones, se debe realizar para componer una curva concentración-respuesta fiable. Se recomienda incluir varios controles positivos y negativos en el diseño experimental. En primer lugar, un control de transfección, es decir, la aplicación de un receptor con un ligando conocido, debe ser probado. Esto permite comprobar si el agente de transfección estaba en funcionamiento. Incorporación de un experimento de control con un agonista de un receptor endógeno de la línea celular y un control negativo (por ejemplo, tampón de lavado) también se recomienda vigilar la salud y la viabilidad de las células y para excluir la posibilidad de que el tampón de lavado estaba contaminada con un factor que podría provocar una auto-Fluorerespuesta aroma. Agonistas utilizados frecuentes son un péptido derivado de la proteasa activado del receptor-1 (PAR 1), que actúa como un agonista de PAR 1 selectivo, o carbacol, que activa el receptor de la acetilcolina. Las células transfectadas con un vector de expresión vacío también deben ser probados para excluir que los compuestos activos interactúan con los receptores endógenos de la célula. La optimización de varios parámetros descritos en el protocolo a continuación puede ser necesario para sistemas de señalización diferentes. Una figura esquemática del ensayo de movilización de calcio basado en la fluorescencia completa se representa en la Figura 1. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" /> Mediciones de la Figura 1. Esquema general del ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia. Automatizado de manejo de líquidos y de fluorescencia simultánea se llevan a cabo con la estaciónlector de microplacas dispositivo, impulsado por el software. El dispositivo de la estación tiene tres cajones: uno para la placa celular, placa compuesta y de rack punta. Los compuestos transferencias de pipeteadores de construcción a partir de una columna de la placa de compuesto a la columna correspondiente de la placa de células (paso 1). Cada pocillo de la placa de la célula contiene una monocapa de células HEK293T que han sido co-transfectadas con el GPCR de interés y la promiscua Gα 16 subunidad. Cuando un compuesto activa el receptor, el PIB Gα 16 unida-se sustituye por GTP. El Gα 16 subunidad disocia posteriormente desde el complejo de Gβγ y activa la fosfolipasa Cβ (PLCß), que a su vez hidroliza bifosfato de fosfatidilinositol (PIP 2) resultante en diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP 3). IP IP 3 activa los canales de calcio dependiente de 3-presentes en la membrana del retículo endoplasmático, la inducción de la liberación de calcio into el citoplasma. La interacción de calcio con Fluo-4 (con la que las células se cargan antes de la adición del compuesto) da como resultado una señal fluorescente (paso 2). El software presenta los resultados como unidad fluorescente relativa valores (RFU) en función del tiempo, y alturas de pico se correlaciona con la concentración de ligando en una manera dependiente de la concentración. Estos datos pueden ser luego convertidos en una curva de concentración-respuesta para determinar el valor de CE 50 de un par ligando-receptor (paso 3).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypsin-EDTA solution (0.25%)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:109px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">195173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose&#160; (DMEM)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin (P-S)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:215px;">jetPRIME</td>
			<td style="width:109px;">Polyplus transfection</td>
			<td style="width:119px;">114-01</td>
			<td style="width:167px;">FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX &#38; Plus Reagent (Life technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0392</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent A100, Lysis buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Reagent B, Stabilizing buffer</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">910-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">CaCl2</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">HBSS buffer: Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Probenecid</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaOH (1 M)</td>
			<td>Vel</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pluronic acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dimethyl-sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td style="width:167px;">Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z707503 and Z707554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">FlexStation device</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:215px;">Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">655090</td>
			<td style="width:167px;">Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCassette</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;">941-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NucleoCounter NC-100</td>
			<td style="width:109px;">Chemometec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes, siliconized</td>
			<td style="width:109px;">BioCision</td>
			<td style="width:119px;">BCS-2470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Polystyrene V-shaped 96-well plates</td>
			<td style="width:109px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">96-Well, FlexStation Pipet Tips</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td>9000-0912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Soft Max Pro software</td>
			<td style="width:109px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of g protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay

Durante más de 20 años, la farmacología inversa ha sido la estrategia por excelencia para descubrir los ligandos activadores de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCR). El inicio de un ensayo de farmacología inversa es la clonación y la posterior transfección de un GPCR de interés en un sistema de expresión celular. El receptor heterólogo expresado se desafió a continuación, con una biblioteca de compuestos de ligandos candidatos para identificar el ligando (s) del receptor activador. La activación del receptor puede ser evaluada por la medición de cambios en la concentración de moléculas de segundo mensajero reportero, como el calcio o AMPc. El ensayo de movilización de calcio basado en la fluorescencia descrito aquí es un medio de rendimiento utilizado con frecuencia inversa ensayo de farmacología. El GPCR huérfano se expresa transitoriamente en células HEK293T) (293T de riñón embrionario humano y una promiscua Gα 16 constructo es co-transfectado. Tras la unión del ligando, la activación de la subunidad Gα 16 induce la liberación de calcio fesde el retículo endoplasmático. Antes de la exploración de ligandos, las células que expresan el receptor se cargan con un indicador de calcio fluorescente, Fluo-4 acetoximetilo. La señal fluorescente de Fluo-4 es insignificante en células bajo condiciones de reposo, pero se puede amplificar más de un 100 veces en la interacción con los iones de calcio que se liberan después de la activación del receptor. La técnica descrita no requiere el establecimiento que consume tiempo de las líneas celulares transfectadas de forma estable en el que el material genético transfectado se integra en el genoma de la célula huésped. En lugar de ello, una transfección transitoria, la generación de la expresión temporal del gen diana, es suficiente para llevar a cabo el ensayo de selección. La configuración permite la detección de mediano rendimiento de cientos de compuestos. La co-transfección de la promiscua Gα 16, que se acopla a la mayoría de los GPCR, permite a la vía de señalización intracelular para ser redirigido hacia la liberación de calcio, independientemente de la vía de señalización nativa en adoquín endógenareuniones. Las células HEK293T son fáciles de manejar y han demostrado su eficacia a lo largo de los años en los ensayos de deorphanization del receptor. Sin embargo, la optimización del ensayo para receptores específicos puede seguir siendo necesario.

Concentración series que van desde 50 M a 0,001 nM fueron probados para los cuatro péptidos Drosophila SNPF (Drome-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide) en células HEK293T que expresan transitoriamente el receptor de Drosophila sNPF y la promiscua Gα 16 subunidad. El GPCR se activó por todos los cuatro péptidos en concentraciones finales de hasta 0,1 nM, y la activación del receptor fue dependiente de la concentración. Figura 2 representa los gráficos correspondientes a uno de los tres réplicas de la serie de concentración Drome-sNPF-1. El control negativo (tampón de lavado) no indujo una señal fluorescente, mientras que el control positivo (PAR 1 - 1 M) provocó una fuerte activación de la proteasa activado del receptor-1, que conduce a una señal fluorescente de alta (± 30 000 RFU) endógena. Cabe señalar que una desviación dela curva típica puede indicar anormalidades. Por ejemplo, un aumento continuo de la curva sin volver a la línea de base podría estar relacionado con señales no mediadas por el receptor, tales como la presencia de ionóforos de calcio, o una bicapa de lípidos alterado causando fugas de calcio. El software permite entrar en fórmulas para determinar el porcentaje de activación o los errores estándar de las diferentes concentraciones entre otros. Los datos resultantes se utilizan para componer las curvas de concentración-respuesta preliminar para estimar los valores de CE 50, como se muestra para los cuatro péptidos Drome-sNPF en la Figura 3. Las curvas de la Figura 3 también incluyen los datos para el control negativo donde la serie de concentración de los péptidos Drome-sNPF fueron probados en células HEK293T transfectadas con un vector pcDNA3.1 vacío. Los resultados indican que la adición de los péptidos a estas células no tienen ningún efecto sobre los receptores endógenos, pero de hecho la actividadate el receptor de interés. A continuación, el ensayo de movilización de calcio basado en la fluorescencia se repitió tres veces de forma independiente. Basado en las curvas preliminares de concentración-respuesta de la pantalla inicial, las concentraciones ensayadas fueron adaptados para cubrir el rango dinámico de la curva (Figura 4). Los valores de EC50 de Drome-sNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [intervalo de confianza del 95%]), Drome-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drome-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) y Drome-sNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) son similares, lo que indica que son igualmente potentes para activar el receptor. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" /> Figura 2. Gráfica de salida del software para una respuesta de fluorescencia mediada por el receptor de una serie de concentraciones. Doce concentraciones finales (que van de 50 M a 0.001 nm) of péptido-Drome sNPF-1 fueron probados en el receptor-Drome sNPF. La activación se expresa en unidad de fluorescencia relativa (RFU) valores. El gráfico superior muestra los resultados de los seis concentraciones más altas y el gráfico inferior de las seis concentraciones más bajas. El control positivo (+) es PAR 1 (1 M) y el control negativo (-) es tampón de lavado. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" /> Figura 3. Curvas de concentración-respuesta preliminar de péptidos de Drosophila sNPF determinados por un único ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia. Las curvas de concentración-respuesta del receptor de Drosophila sNPF expresado transitoriamente en células HEK293T para los cuatro péptidos de Drosophila sNPF se muestran en azul. Para los controles negativos (en rojo), los péptidos fueron probados en HEK293Tcélulas transfectadas con un vector pcDNA3.1 vacío. Las respuestas fluorescentes se muestran como relativo (%) al valor más alto (100% de activación). Las curvas son el resultado de un experimento en el que se midió cada serie de concentración por triplicado. Las barras verticales representan los errores estándar de la media (SEM), que a veces son más pequeños que los símbolos utilizados (en ese caso, sólo los símbolos se representan). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" /> Figura 4. Curvas de concentración-respuesta y la correspondiente CE 50 valores de péptidos de Drosophila sNPF determinados por tres ensayos de movilización de calcio basado en fluorescencia independientes. Las curvas de concentración-respuesta del receptor de Drosopihla sNPF expresados ​​transitoriamente en células HEK293T para los cuatro péptidos de Drosophila sNPF son el resultado de tres me independientehicieron mediciones cada uno realizado por triplicado (n ≥ 9). Las respuestas fluorescentes se muestran como relativo (%) al valor más alto (100% de activación). Los asteriscos indican concentraciones para los cuales n ≤ 9. Las barras de error indican la SEM, que a veces son más pequeños que los símbolos utilizados (en ese caso, sólo los símbolos se representan). CE 50 valores se muestran con sus intervalos de confianza del 95%.

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Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

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In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Investigación

Biología

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

La cuantificación de la actividad agonista en el G receptores acoplados a proteínas

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. It is likely to play a role in preventing accumulation of recombinogenic intermediates that would otherwise accumulate at transiently stalled replication forks, consistent with a hyper-recombinant phenotype of cells lacking WRN. In humans, the exonuclease domain comprises an N-terminal portion of a much larger protein that also possesses helicase activity, together with additional sites important for DNA and protein interaction. By contrast, in Drosophila, the exonuclease activity of WRN (DmWRNexo) is encoded by a distinct genetic locus from the presumptive helicase, allowing biochemical (and genetic) dissection of the role of the exonuclease activity in genome stability mechanisms. Here, we demonstrate a fluorescent method to determine WRN exonuclease activity using purified recombinant DmWRNexo and end-labeled fluorescent oligonucleotides. This system allows greater reproducibility than radioactive assays as the substrate oligonucleotides remain stable for months, and provides a safer and relatively rapid method for detailed analysis of nuclease activity, permitting determination of nuclease polarity, processivity, and substrate preferences.

Exonucleases play critical roles in ensuring genome stability. Loss of WRN exonuclease function results in premature aging. Studying substrates and other requirements of the nuclease in vitro can help elucidate its role in vivo. Here we demonstrate a rapid and reproducible fluorescence-based assay to measure its nuclease activity.

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group developed an intra-molecular FRET sensor to detect the interaction between G&#945; subunits and GPCRs in live cells following agonist stimulation. Here, we detail the protocol for detecting changes in FRET between the &#946;2-adrenergic receptor and the G&#945;s C-terminus peptide upon treatment with 100 &#181;M isoproterenol hydrochloride as previously characterized1. Our FRET sensor is a single polypeptide consisting serially of a full-length GPCR, a FRET acceptor fluorophore (mCitrine), an ER/K SPASM (systematic protein affinity strength modulation) linker, a FRET donor fluorophore (mCerulean), and a G&#945; C-terminal peptide. This protocol will detail cell preparation, transfection conditions, equipment setup, assay execution, and data analysis. This experimental design detects small changes in FRET indicative of protein-protein interactions, and can also be used to compare the strength of interaction across ligands and GPCR-G protein pairings. To enhance the signal-to-noise in our measurements, this protocol requires heightened precision in all steps, and is presented here to enable reproducible execution.

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

Conformaciones GPCR Proteína G-selectivos mide usando sensores FRET en un fluorómetro Ensayo de suspensión de células vivas

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...