Hoy, demostraremos un método para evaluar una biblioteca de péptidos, contra un receptor maestro recientemente descubierto, que es el receptor de proteína G X2 relacionado con Mas, también conocido como receptor MRGPRX2. Los mastocitos son una parte integral del sistema inmunológico y desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los mastocitos son activados por el receptor Fc epsilon R1 unido al antígeno, o por el receptor X2 recientemente descubierto.
La activación del receptor X2 unido a la superficie, se ha relacionado con varias enfermedades inmunológicas e inflamadas y, por lo tanto, es importante comprender el mecanismo de unión de este receptor a sus ligandos. Para ello, hemos desarrollado una biblioteca de pequeñas moléculas peptídicas, y las hemos examinado contra receptores X2 sobreexpresados en hexis. En el estudio, se construyó una biblioteca de péptidos utilizando técnicas simples y versátiles de escaneo de alanina y truncamientos de aminoácidos.
Heck293 dice, la expresión de los receptores X2 cuando se activa con los péptidos y el hexis de tipo ancho se utilizaron como control. En la liberación de truncamiento tras la activación se monitoreó para estudiar la activación basada en X2. Experimentalmente, Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye se excita a 340 y 380 nanómetros, mientras que la emisión se registra a 510 nanómetros.
Tras la unión al calcio, la intensidad de la fluorescencia a 340 aumenta, mientras que la de 380 nanómetros, disminuye. El tinte se deposita entonces en la relación de la intensidad de fluorescencia a 340, a la de 380 nanómetros. El 340 de una relación 380, es proporcional al calcio intracelular, el valor del mismo, puede ser calculado, por la Ecuación de Grynkiewicz.
Se detecta la relación de tabulación de dos intensidades de fluorescencia, el efecto de factores experimentales como la dilución, el fotoblanqueo, la fuga de colorante y las densidades de olor. Así que, sin más dilación, comencemos el experimento. Identificar los ligandos del receptor MRGPR X2 de mastocitos, generador N-Truncado, C-Truncado y N+C-Truncado biblioteca de péptidos, truncando los aminoácidos N-terminal, C-terminal y N+C-terminal de la falta de proctividad pam-12.
Utilice la síntesis de péptidos en fase sólida para sintetizar los péptidos. Modifique el terminal final a un grupo de marea establecido y el terminal C a grupo amida. Generar y alaninas pueden biblioteca de péptidos, mediante la sustitución de los respectivos aminoácidos de pam-12 por alanina, uno a la vez.
Modifique el terminal final a un grupo setide y C-terminal a grupo amida. Preparar el medio de cultivo suplementando DMEM de glucosa alta, con 10% de suero fetal bovino, dos milimolares L-glutamina, cien unidades por ml de penicilina, y cien microgramos, por ml de una estreptomicina. Además de las células en cultivo tee sue traited, 375 cultivos matraz a 37 grados Centígrados, 5% CO2, hasta que son 75 a 80% confluentes.
Una vez que el 75% sea confluente, lave las células y agregue de dos a tres ml de Proof-C, para separar las células. Una vez que las células se hayan desprendido, recoja las células en Proof-C. Añadir de seis a nueve ml de medio fresco.
Centrifugar las células a 1620 g durante tres a cinco minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante para recoger el pellet. Resuspend las células en medio de cultivo fresco.
Diluya las células, según la concentración deseada. A 200 microlitros de la suspensión celular con la concentración de 200, 000 células, vierta el ambón en cada pozo para buscar 40, 000 células por pozo. Proteja las células durante 24 horas en la incubadora de 37 grados centígrados, 5% de CO2.
Utilice el tinte Fura-2 AM para el experimento. Agregue 50 microlitros DMSO en 50 microgramos fura-2 AM, para preparar una solución milimolar de tinte Fura-2 AM. Añadir un microlitro de un colorante milimolar Fura-2 AM por ml de medio fresco para preparar el medio diluyente de una concentración de colorante micromolar.
Retire la placa de 96 póyes de la incubadora y deseche el medio. Reemplace el medio con un medio de dilución fresco. Agregue 200 microlitros de medio diluyente en cada pozo.
Incubar las células durante 30-40 minutos en 37 grados centígrados, incubadora de 5% de CO2. Mientras se incuban las células, configure el lector de placas. Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados.
En configuración, seleccione Flex. Establezca el modo de lectura en fluorescencia y lectura inferior. En Longitudes de onda, establezca el número de longitudes de onda en dos.
Establezca la excitación en 340 nanómetros y 380 nanómetros. Establezca la emisión en 510 nanómetros. Deje la sensibilidad en Predeterminado.
En Temporización, establezca el intervalo en 3,9 segundos. Establezca el tiempo de ejecución en 94 segundos para obtener 25 números de lecturas. A continuación, seleccione el tipo de placa de ensayo.
A continuación, seleccione los pozos para leer. En Transferencia compuesta, establezca las transferencias en uno y el volumen inicial en cien microlitros. Establezca la altura de la pipeta en cien microlitros, el volumen en 50 microlitros y el punto de tiempo en 36 segundos para agregar el compuesto y cuidar la lectura.
A continuación, seleccione el tipo de placa fuente compuesta. Deje que Triturate no se use. Seleccione el diseño de puntas y puntas de pipeta.
Para las columnas compuestas y de punta, el compuesto se transferirá en la columna uno de la placa compuesta. Establezca la columna de punta en una y la columna compuesta en una. Deje AutoCalibrate en On.Haga clic en Aceptar. Después de 40 minutos de incubación, retire el medio.
Lave las celdas con el búfer XDB. Agregue cien microlitros de tampón XDB para la lectura de fluorescencia. Tome la placa para la lectura de fluorescencia.
Cuando el pritchett haya alcanzado los 37 grados centígrados, presione la cámara de lectura para colocar la placa de ensayo en el lector de placas de fluorescencia. Presione la fuente para colocar la placa compuesta. Prepare la placa compuesta agregando 200 microlitros de péptidos respetados yonomisina y EGTA para convertir X soluciones.
Presione la punta pratt para poner la caja de punta. Use la punta negra para evitar la autofluorescencia de la punta. Una vez guardadas las placas, y si utilizas los ajustes del software y pulsas Leer.
Determinar la concentración de calcio a partir de la relación de fluorescencia mediante la ecuación de Grynkiewicz. Se muestran los datos de fluorescencia del péptido pam bueno. Como se puede ver, después de la adición de péptidos a los 36 segundos, la fluorescencia a 340 nanómetros que es más luker aumenta en la de 380 nanómetros registra disminuciones.
Los datos se representan como la relación de 340, a la de la señal de 380. Muestran aumentos de las señales después de la adición de péptidos. Esta figura es el dato representativo de un péptido activador.
La Figura A muestra las señales de fluorescencia de un péptido activador. Los datos representativos corresponden a cram12 El péptido se agregó después de crear una línea de base para los ciclos de licitación, como se muestra en el ado. La Figura B muestra la relación entre la emisión de fluorescencia después de la excitación a 340 nanómetros, y la de la emisión de fluorescencia después de la excitación a 380 nanómetros.
Esta figura son los datos representativos para el espacio en blanco. La Figura A muestra las señales de fluorescencia para el espacio en blanco. HTB se agregó después de diluir una línea de base durante 10 ciclos de alimentación como se muestra en el ado.
La Figura B muestra la ración de la emisión de fluorescencia después de la excitación a 340 nanómetros a la de la emisión de florescencia después de la excitación a 380 nanómetros. Esta figura son los datos representativos de los estándares para la calibración de tintes. La Figura A muestra que la ionomicina se agregó en las 10ª lecturas, como lo muestra el ado para obtener la máxima fluorescencia en estado unido a cashem.
EGPA Tritón X cien se agregó después de 20 lecturas como lo muestra el ado que recibe la señal mínima. La Figura B muestra la relación entre la emisión de fluorescencia después de la excitación a 340 nanómetros y la de la emisión de fluorescencia después de la excitación a 380 nanómetros. Estos valores se colocan además en la ecuación de Grynkiewicz para obtener el caché intracelular de concentración.
Esta figura muestra la caracterización de un péptido representativo para confirmar la secuencia y la pureza. La Figura A muestra la masa vertical de la secuencia peptídica representativa WNK WAL fue de 857,90 colorantes de adelgazamiento. Lo que se muestra por la relación N sobre Zed en espectroscopia de masas.
La Figura B muestra una pureza peptídica del 99% confirmada por HPLC. Este péptido pertenece a la biblioteca de péptidos truncados N+C. En conclusión, el método descrito aquí es fácil y versátil que puede ser eficiente y brillante para la última escala de detección basada en calcio.
Sin embargo, hay varios factores que determinan la calidad de los datos y, por lo tanto, la composición debe optimizarse para un sistema de instrumentos celulares determinado. Gracias.
