Agradecemos al Dr. Martin Rosenberg, el Dr. Gary Tarpley, y el Dr. Keith Wood para el apoyo de este trabajo, y el Dr. James Cali para la lectura crítica del manuscrito. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, y MU son empleados de Promega Corporation. MF, RJ, RA, y DA son empleados de MS Bioworks, LLC.

Nota: El siguiente protocolo se puede utilizar con cualquier fusión HaloTag y en cualquier línea celular de elección de forma estable o transitoriamente transfectadas. Para estos ejemplos, le daremos los protocolos para la transfección transitoria de fusiones HaloTag en células HEK293T o HeLa. Para todos los experimentos, se recomienda el uso del único control de la proteína. 1. Fusión Protein Expression Prueba <ol><li> Obtener proteína de fusión construcción: <ol><li> Obtener pre-hechos vector de fusión HaloTag o construir usando vectores existentes. Para obtener más información acerca de construcciones disponibles, por favor consulte la Tabla de los reactivos específicos. </li><li> Si hacer cualquier clon, se recomienda para secuenciar verificar el ADN. </li></ol></li><li> Prueba de expresión de proteína de fusión y de control: <ol><li> Para cada muestra, preparar 250 l de 1X tampón de SDS colorante de carga (60 mM de Tris HCl pH 6,8, 0,75 mM de azul de bromofenol, 12,5% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, 0,5% de SDS). </li><li> Para cada proteína de fusióny el control, la placa 0,5 ml de HEK293T o células HeLa en su medio de comunicación adecuado a una densidad de 2-4 x 10 5 células / ml en una placa estándar de 24. </li><li> Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, a continuación, transfectar como se recomienda. </li><li> 24 horas después de la transfección, añadir 0,5 l de 5 mM tetra-metil rodamina (TMR) ligando a los medios de comunicación de cada pocillo y mezclar suavemente la placa. </li><li> Se incuban las células transfectadas que contienen ligando durante 15 min a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Aspirar los medios off que contiene el ligando y lavar cada pocillo de células suavemente con 1 ml de PBS RT. </li><li> Aspirar PBS y realizar un segundo lavado con 1 ml de PBS RT. </li><li> Retire PBS y añadir 200 l de 1X tampón SDS Cargando tinte directamente a las células. </li><li> Pipeta lisado de placa en 1,5 ml tubo Eppendorf. </li><li> Hervir lisado durante 5 min a 95 ° C. </li><li> Eliminar 5-10 l de la reacción y de la carga en gel de SDS-PAGE. </li><li> Utilice un escáner de detección fluorescente(TMR de excitación: 555 nm, emisión: 585 nm) para detectar bandas. Utilice los marcadores de proteínas fluorescentes como estándares. </li><li> Si un escáner de detección fluorescente no está disponible, realizar transferencias de Western utilizando anticuerpos contra cualquiera de la proteína cebo o etiqueta de la proteína de fusión para detectar la expresión de la proteína de fusión. </li></ol></li></ol> 2. Pulldowns de proteínas <ol><li> Preparación de las células transfectadas de forma transitoria: <ol><li> Para cada fusión o control preparan un plato de 15 cm con 30 ml de células a 3-4 x 10 5 células / ml o 1 a 1,2 x 10 7 células totales por constructo. </li><li> Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, a continuación, transfectar construir como se recomienda. </li><li> Después de 24 a 48 horas después de la transfección, extraiga el soporte y suavemente lavar la capa de células con 20-25 ml de PBS helado. </li><li> Retire lavado PBS, a continuación, añadir 25-30 ml de 4 ° C enfriada PBS y raspar suavemente las células de la placa. </li><li> Recoger las células en tubos cónicos y centrifuge durante 5-10 minutos a 2000 xg y 4 ° C. </li><li> Desechar el sobrenadante y colocar sedimento celular a -80 ° C durante un mínimo de 30 minutos o un máximo de 6 meses. </li></ol></li><li> La equilibración de la resina HaloLink: <ol><li> Para cada muestra de fusión o de control, preparar 12 ml de tampón de equilibración de la resina / de lavado (100 mM de Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, y 0,005% de Igepal CA-630) Nota:. Es muy importante para realizar y utilizar la Resina Tampón equilibrador dentro de 12 horas tan diluida IGEPAL CA-630 no es estable o efectiva más allá de este marco de tiempo. </li><li> Agite suavemente o mezclar la resina para obtener una suspensión uniforme. </li><li> Para cada experimento desplegable, dispense 200 l de resina en un 1,5 ml tubos de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar durante 1 min a 800 xg (por ejemplo, 3.000 rpm en una microcentrífuga), a continuación, quitar cuidadosamente y descartar el sobrenadante (etanol) sin perturbar la resina en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 800 l de resina de equilibración / Wash tampón y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. </li><li> Se centrifuga durante 2 minutos a 800 xg, a continuación, retire con cuidado y deseche el sobrenadante. </li><li> Repita los pasos 2.2.5 y 2.2.6 de dos veces más para un total de 3 lavados. </li><li> No quite el lavado final o el sobrenadante hasta el momento de añadir los lisados ​​celulares se describen a continuación (Paso 2.3.8) para evitar que la resina se seque. </li></ol></li><li> Encuadernación y lavado de complejos de fusión: <ol><li> Para cada muestra, preparar 500 l de Tampón de Lisis de mamíferos (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% desoxicolato de Na) y 1 ml de tampón 1X TBS (100 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y NaCl 150 mM). </li><li> Descongele los gránulos de las células y resuspender en 300 l de tampón de lisis de mamíferos mediante la pipeta hacia arriba y hacia abajo o brevemente vórtex. </li><li> Añadir 6 l de 50X inhibidor de la proteasa Cocktail (800 mg / ml de benzamidina HCl, 500 mg / ml fenantrolina, 500 mg / ml de aprotinina, 500 mg / ml leupeptina, 500 &amp; #. 181; g / ml de pepstatina A, 50 mM de PMSF) Nota: cócteles que incluyen la proteasa AEBSF no se pueden utilizar ya que estos interfieren con la etiqueta de fusión proteína de unión. </li><li> Añadir 3 l RQ1 DNasa e invertir durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Dounce homogeneizador de vidrio con 2,0 ml de tamaño; . 25-30 golpes en el hielo, o pasar las células a través de una aguja de calibre 25 o 27 5-10 veces para completar la lisis Nota: La sonicación no se recomienda como complejos pueden desmoronarse y el sobrecalentamiento pueden afectar a la actividad de la proteína de fusión de etiquetas. </li><li> Centrifugar a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C para borrar el lisado. </li><li> Transfiera el lisado claro, aproximadamente 300 l volumen total, al nuevo tubo y colocar en hielo. </li><li> Añadir a borrar lisado un adicional de 700 l de tampón 1X TBS y mezclar bien pipeteando arriba y abajo. </li><li> Tome tubos de resina equilibradas preparado en la etapa 2.2.8 y eliminar de lavado final / sobrenadante de resina sin molestar a la resina en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir a cada maser de resina, los 1 ml de lisado diluido. </li><li> Incubar con la mezcla en un mezclador de tubo (o mezclador suave) durante 15 min a 22 ° C. Nota: La sedimentación de la resina durante este tiempo reduce la eficiencia de unión. Si se desea la unión a 4 º C, lo hacen mediante la mezcla durante 1 hora. </li><li> Tubos de resina Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de tampón de equilibrado Resina / Wash hechas en el Paso 2.2.1 y mezclar bien invirtiendo el tubo de resina con la mano varias veces. </li><li> Tubos de resina Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg y deseche el lavado. </li><li> Repita los pasos 2.3.12 2.3.14 seguidos por tres veces más. </li><li> Añadir 1 ml de tampón de equilibración de la resina / Wash y se incuba a 22 ° C durante 5 minutos con rotación constante. </li><li> Tubos de resina Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg y deseche el lavado. </li><li> Dependiendo de la aplicación final (véase la Introducción para una explicación más detallada), proceda a la Sección ya sea 2.4 o 2.5. </li></ol></li><li> SDS elución de geles desnaturalizantes, transferencias Western, o espectrometría de masas: <ol><li> Resuspender la resina de cada muestra en 50 l de tampón de elución de SDS (1% de SDS y 50 mM de Tris-HCl pH 7,5) </li><li> Agitar los tubos a TA durante 30 min. </li><li> Centrifugar durante 2 min a 800 xg y de transferencia de los eluidos a tubos nuevos para el análisis. </li><li> Por western blot o gel tinción de plata, carga 5-10 l en un gel desnaturalizante SDS. </li><li> Por espectrometría de masas, guardar 40 l de cada muestra a -20 ° C. </li></ol></li><li> VET proteasa de elución para ensayos funcionales, transferencias Western, o espectrometría de masas: <ol><li> Después de quitar el último lavado, resuspender la resina en 50 l ProTEV tampón de disociación y 30 unidades de la enzima de TEV. </li><li> Incubar a 25 ° C con agitación durante 1 hora. </li><li> Centrifugar durante 2 min a 800 x g. </li><li> Transferencia eluato a tubos nuevos. </li><li> Conserve la muestra a 4 ° C para su uso inmediato en ensayos funcionales. </li></ol></li></ol> 3.Imaging Celular de forma fluorescente etiquetadas proteínas de fusión Usando un citoplasmática y nuclear Permeable Ligando <ol><li> Transfectar, etiqueta, y celdas de imagen: <ol><li> En un cubreobjetos bien calibrada 8 para cada proteína de fusión o control, placa de 400 l de células HeLa en su soporte adecuado en cada pocillo a una densidad de 1-2 x 10 5 células / ml. </li><li> Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, a continuación, transfectar como se recomienda. </li><li> 18-24 horas después de la transfección, diluir TMR ligando 1:200 en medios celulares apropiadas, a continuación, añadir 100 l de esta solución a cada pocillo y mezclar suavemente. </li><li> Se incuban las células transfectadas que contienen ligando durante 15 min a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Aspirar los medios off contienen ligando y reemplazar con 500 l de medio de comunicación adecuado que carecen de la proteína de fusión ligando etiqueta, que ha sido pre-calentado a 37 ° C. </li><li> Repetir dos veces para un total de tres lavados. </li><li> Ponga las células de nuevo en la incubadora (376; C y 5% de CO 2) durante 30 min. </li><li> Aspirar fuera de los medios de comunicación y reemplazar con 500 l de los medios adecuados, que ha sido pre-calentado a 37 ° C. </li><li> La imagen en el microscopio utilizando parámetros de adquisición apropiados (TMR excitación: 555 nm, emisión: 585 nm). </li></ol></li></ol>

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Tasas de publicación de este artículo son patrocinados por Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy y Marjeta Urh son empleados de Promega Corporation, el dueño comercial por la cesión de las patentes de la tecnología HaloTag y sus aplicaciones. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama, y ​​David Allen son empleados de MSBioworks, que proporciona servicios de espectrometría de masas que se describen en este manuscrito.

Aquí se presentan dos proteínas de fusión, Halo-Halo-BRD4 y HDAC1, caracterizado en células de mamíferos eucariotas para la expresión de proteínas, el aislamiento y la actividad compleja y localización celular. Al trabajar a través de estos distintos protocolos, hay varios pasos importantes para el éxito de cada experimento. Como es el caso con cualquier proteína de fusión, el nivel de expresión y la colocación de la etiqueta en sí mismo puede ser crítico para el mantenimiento de la fisiología. Por tanto, es importante tener en cuenta que será necesario fusiones C-terminales N-y / o que diseñarse si el conocimiento previo o trabajar con otra etiqueta no se ha demostrado para la proteína particular de la elección. En cuanto a la expresión, si el nivel es demasiado alto, la dilución de ADN puede llevarse a cabo durante la transfección o el uso de vectores con promotores más débiles son posibles para alcanzar el nivel que sea apropiado. Trabajos anteriores han sido realizados mostrando el aislamiento eficiente de complejos macromoleculares en endógena levels de expresión 8, lo que permite trabajar a niveles muy bajos de expresión. Si es posible, los estudios de localización celular también serían capaces de proporcionar información en cuanto a la posición óptima colocación de la etiqueta, así como el nivel de expresión relativa necesaria para la fisiología adecuada. Una vez que las proteínas de fusión están listos para experimentos desplegables, para obtener el máximo éxito con el protocolo es muy importante seguir los plazos recomendados en la lisis, la unión, y las secciones de lavado, como una de las mayores ventajas es la velocidad del complejo de aislamiento proceso. Si cualquiera de estos pasos se alargan en el tiempo, tal como se requiere para un método de captura basada en anticuerpos, hay un riesgo de disociación complejo o el aumento de la unión no específica 8. Del mismo modo, si los tiempos se acortan durante la lisis celular o de unión, las células pueden no ser completamente lisadas o de manera eficiente capturados respectivamente. Si el número de lavados es decralivió o un buen mezclado de la resina no ocurre durante los lavados o de unión, a continuación, se aumentaron los niveles de fondo de proteínas no específicas. Además, los medios de lisis es muy importante en relación con la eficacia de la unión a la resina. Los intentos de Sonicar las muestras, quitar el detergente recomendado, añadir SDS u otro detergente fuerte, y / o incluir el AEBSF inhibidor de la proteasa se traducirá en una reducción o pérdida de la unión de las proteínas de fusión y sus complejos a la resina. Los métodos existentes para el aislamiento del complejo a partir de células de mamíferos y lucha análisis proteómicos humanos con el reto de reducir el fondo en el análisis por espectrometría de masas 16. Esto ha sido tan significativo que un depósito de proteínas contaminantes ha sido creado por los numerosos grupos de espectrometría de masas 16. Antecedentes en muestras desplegables espectrometría de masas puede ser definido como cualquier cosa que impide la identificación de losverdaderos interactores de la proteína cebo. Como tal, el fondo puede surgir de proteínas contaminantes no específicos o también grandes concentraciones de proteína cebo o anticuerpos utilizados para precipitar las proteínas de cebo. Un trabajo significativo se hizo en la optimización tanto el protocolo desplegable que aquí se presenta, así como la resina para reducir al mínimo el nivel de las proteínas contaminantes no específicos en el proceso de despliegue. Esto es evidente en los geles con tinción de plata y el análisis de espectrometría de masas del control (Figura 2). Para hacer frente a los altos niveles de proteína cebo o anticuerpos que pueden ser igualmente perjudiciales como contaminantes y con la que otras metodologías de lucha, se recomienda el desplegable con SDS elución (Protocolo de la sección 2.4). Debido a la unión covalente a la resina, este proceso dejará la mayoría de la proteína de fusión de partida unido covalentemente a la resina. Un pequeño porcentaje de cebo se observa en el análisis de espectrometría de masas, que se creea ocurrir a través de la hidrólisis, pero no presentar un problema para la detección de otras interacciones más débiles o transitorios 8. Como se mencionó en la introducción, los avances significativos en la proteómica se han habilitado por los avances significativos en 1,7 espectrometría de masas. Por lo tanto, es importante resaltar parámetros importantes de la elección de los análisis de espectrometría de masas para deconvolucionar la mezcla de proteínas obtenidas en los jalones. Instrumentación debe ser robusto y capaz de forma rutinaria y eficientemente el análisis de muestras que contienen una pequeña cantidad de proteína, a menudo menos de &lt;1 mg. Cromatografía nanoescala implica 50-75 micras columnas de HPLC de diámetro interno con velocidades de flujo en el rango de 100 a 300 nl / min se emplea típicamente para la compatibilidad con los pequeños tamaños de las muestras y para maximizar la sensibilidad del espectrómetro de masas. Para maximizar la información obtenida en un estado o Análisis solaf los espectrómetros de masas de arte capaces de adquirir espectros de masas de alta resolución en escala de tiempo compatible con separaciones nanoescala antes mencionados, ≥ 10 Hz, se emplean normalmente. Estos instrumentos tienen niveles attomolar de sensibilidad y se pueden adquirir de forma rutinaria datos con precursor ppm sub e iones producto tolerancias de error de masas. Estas características de rendimiento sirven para aumentar el rendimiento de el número de proteínas identificadas y la confianza asociada con las identificaciones. Con estos datos nos demuestran la localización fisiológica celular, proteínas adecuado: las interacciones proteína junto con el potencial para el descubrimiento de nuevas interacciones, y el aislamiento de complejos activos todo utilizando una única construcción. De hecho tecnologías alternativas se pueden utilizar para cada uno de estos diferentes aspectos, pero probablemente no para todos 23,24. Con la tecnología HaloTag, un enfoque multifuncional puede ser utilizado, avanzando proteomics estudios y obtener una comprensión más completa de la función de proteínas en células de mamífero.

La comprensión de la función celular, la respuesta a los estímulos, y los cambios en el desarrollo y / o estados de enfermedad está estrechamente ligada a de-convolución del proteoma largo de estos diferentes estados dinámicos 1,2. Mucho se ha hecho para entender el proteoma de los organismos inferiores, sin embargo, dado el número de proteínas y todas las posibles interacciones, esto ha sido muy difícil hacer frente a la proteoma humano 1,3-7. Los avances en la espectrometría de masas han permitido en gran medida la capacidad de realizar estos estudios, y aquí presentamos un avance adicional y significativa con el desarrollo de la tecnología HaloTag tanto para la captura eficiente de los complejos de proteínas y caracterización funcional de las proteínas humanas a partir de células de mamíferos 8-10. Esta tecnología ha sido demostrado recientemente en varios estudios a ser un factor crítico para el descubrimiento de interacciones importantes, lo que permite para la penetración en la novela función de la proteína y understanding de la enfermedad 11-13. La proteína de fusión HaloTag fue inicialmente desarrollado para hacer frente a varios desafíos de las etiquetas y los anticuerpos en relación con la captura de proteínas, purificación y etiquetado 8-10 afinidad tradicionales. Dentro de casi todos los métodos para la captura y purificación de proteínas, hay una etapa de interacción no covalente que se utiliza para el enriquecimiento de una proteína particular 14. Durante este paso, la proteína y / o complejos pueden disociarse debido a la difusión, especialmente si el proceso requiere horas en lugar de minutos para completar. Para abordar esta preocupación, la proteína de fusión fue específicamente diseñado para interactuar rápida e irreversiblemente con sus ligandos, que pueden ser o bien partículas, superficies o fluoróforos 9. Por lo tanto, una vez que se une a su ligando, que permanece unido, que es uno de los factores más diferenciador en comparación con otras etiquetas de afinidad. También se ha demostrado aquí, es la capacidadpara hacer frente a diferentes cuestiones biológicas con una única construcción, lo cual es posible por ligandos 9 (Figura 1) alterna. Por ejemplo, para interrogar a las interacciones de proteínas o de la función, ligandos de la superficie se utilizan para la captura de proteínas o complejos (Figura 1). En un experimento separado, la misma proteína de fusión puede ser marcado con fluorescencia para estudiar la localización celular, el tráfico, o rotación de proteínas (Figura 1). Es importante recordar, sin embargo que una vez que un ligando está unido, si se trata de una superficie o un fluoróforo, es irreversible y por lo tanto otros ligandos no puede entonces ser ligado posteriormente en el mismo experimento. Análisis de las tecnologías existentes para mapear las interacciones proteína revela la dificultad de aislar de manera eficiente las interacciones específicas, incluidos los que son más transitoria o están en menor abundancia 1,6,7,14,15. Además, el trabajo reciente realizado por numeroso grupos muestra la preocupación de que dentro de los métodos de aislamiento tradicionales, particularmente en el área de la proteómica humanos, hay un número significativo de contaminantes proteicos que pueden enmascarar las señales de los verdaderos interactores en el análisis de espectrometría de masas 16. Las propiedades desarrolladas para la proteína HaloTag y su dirección resina de co-desarrollado bien estas preocupaciones. En el protocolo para jalones complejos (Figura 1), la unión de los complejos se puede lograr en 15 min, tanto la promoción de captura compleja y reducir los niveles de unión no específica 8. Además, la unión irreversible permite para la captura eficaz de las proteínas de baja abundancia y permite el uso de un número mucho menor de células, reduciendo de nuevo el fondo 8. Una vez que se estableció la captura de los complejos, el protocolo incluye condiciones de lavado suaves para mantener la integridad del complejo. La elución de los complejos capturados se puede realizar por dos métodos y la elección de qué método es dictado por el objetivo de la anal aguas abajolisis. Si el deseo es analizar o descubrir proteínas que interactúan por Western blot o espectrometría de masas, entonces se recomienda para eluir complejos con desnaturalizantes tales como SDS o urea (Figura 1). Esto es particularmente ventajoso para la espectrometría de masas como la proteína originalmente fusionado a HaloTag, denominado la proteína cebo, permanecerá detrás unido a la resina y por lo tanto no va a dominar la población de péptidos detectados en la espectrometría de masas. Esto también significa sin embargo que la proteína cebo probablemente no será visible en el análisis por Western blot, una diferencia significativa en comparación con otras purificaciones de afinidad no covalentes o compañeros de inmunoprecipitaciones. Si el objetivo es para purificar un complejo intacto para ser utilizado para los estudios funcionales, la elución se puede realizar utilizando TEV (Tobacco Etch Virus) de la proteasa, que reconoce su secuencia de escisión cognado codificada entre la proteína de fusión y la proteína cebo (Figura 1). Tstos muestras también podrían ser analizados mediante espectrometría de masas, pero como se muestra más adelante, que contendrán una cantidad significativa de proteína de cebo que pueden impedir la detección de baja abundancia, interactores específicos. Aquí presentamos los protocolos desplegables y de imagen aplicadas a dos proteínas terapéuticas importantes, la proteína bromodomain BRD4 y una histona deacetilasa, HDAC1 17. Hemos demostrado con estos ejemplos, la interacción con los socios esperados según lo determinado por espectrometría de masas, la actividad enzimática tras el aislamiento complejo de HDAC1, y localización celular adecuada para ambos. Juntos, estos resultados demuestran la naturaleza multifuncional y la fuerza de la tecnología para la caracterización de interacciones de proteínas eucarióticas y función.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">HeLa Cells</td>
			<td style="width:204px;">ATCC</td>
			<td style="width:103px;">CCL-2</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellular growth media</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - tissue culture certified</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Control Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6591</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-BRD4</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC11882</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-HDAC1</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC02563</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Clones containing content</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">http://www.promega.com/FindMyGene/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">Choose based upon expression level and HaloTag orientation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag TMR Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18896</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6500</td>
			<td style="width:280px;">Contains HaloTag TMR ligand</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6504</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protease Inhibitor Cocktail, 50X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6521</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9381</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Monoclonal Antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProTEV Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloLink Resin</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>G1912</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HDAC-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6420</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS + 0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture vessels and dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable cell lifter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-773-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K885300-0002</td>
			<td style="width:280px;">25-to 27- gauge needle could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator such as Labquake</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4002110Q</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for binding and washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovering protein interactions and characterizing protein function using halotag technology

La investigación en proteómica se ha disparado en los últimos años con los avances en las capacidades de espectrometría de masas que han llevado a la caracterización de numerosas proteomas, incluidos los de los virus, bacterias y levaduras. En comparación, el análisis del proteoma humano va a la zaga, en parte debido a la gran cantidad de proteínas que deben ser estudiadas, sino también la complejidad de las redes e interacciones estos presentes. Para abordar específicamente los desafíos de la comprensión del proteoma humano, hemos desarrollado la tecnología para el aislamiento de proteínas HaloTag, particularmente fuerte para el aislamiento de complejos multiproteicos y permitiendo la captura más eficiente de las interacciones y / o proteínas débiles o transitorios de baja abundancia. HaloTag es una etiqueta codificada genéticamente la proteína de fusión, diseñado para covalente, específica, y la inmovilización rápida o etiquetado de proteínas con diversos ligandos. Aprovechando estas propiedades, numerosas aplicaciones para células de mamíferos se desarrollaron con el carácterize función de las proteínas y aquí presentamos metodologías que incluyen: proteínas desplegables utilizados para el descubrimiento de nuevas interacciones o ensayos funcionales y localización celular. Nos encontramos ventajas significativas en la velocidad, la especificidad, y la captura covalente de proteínas de fusión a las superficies para el análisis proteómico en comparación con otros enfoques tradicionales no covalentes. Demostramos estos y la amplia utilidad de la tecnología que utiliza dos proteínas epigenéticas importantes como ejemplos, la proteína humana bromodomain BRD4 y HDAC1 histona deacetilasa. Estos ejemplos demuestran el poder de esta tecnología para permitir el descubrimiento de nuevas interacciones y caracterización de la localización celular en eucariotas, que lo haremos juntos una mayor comprensión de la proteómica funcional humanos.

Al trabajar con cualquier nueva proteína de fusión, es importante primera prueba para la expresión de esa proteína después de la transfección y también validar que se está produciendo una proteína del peso molecular adecuado. Como proteínas de fusión HaloTag pueden ser fluorescentemente y marcado de manera covalente con, ligandos impermeables o permeables, dependiendo de la localización, es posible determinar rápidamente la expresión mediante la aplicación de lisados ​​celulares para electroforesis en gel desnaturalizante seguida de escaneado en un FluorImager. Utilizando el protocolo descrito en la Sección 1.2, la expresión de Halo-BRD4 (189 kD) y el control de solo HaloTag (CTRL) es observado (34 kD, Figura 2A). Como se ha mencionado en el protocolo, la expresión de proteínas de fusión también se puede detectar usando transferencias Western tradicionales con anticuerpos anti-HaloTag, o si están disponibles, los anticuerpos para la proteína cebo. Si es posible, se recomienda utilizar el ligando fluorescente en lugar ya que es más específica, más rápido, más fácil y Tla detección de anticuerpos han, y también cuantitativa 10. Después de verificar la expresión de la proteína de fusión de larga duración adecuada, jalones de proteínas se pueden realizar. Se muestra en la Figura 2B son los de plata manchada geles de réplicas biológicas de Halo-BRD4 y Ctrl pulldowns eluidas mediante SDS (Protocolo de la sección 2.4) que demuestran una alta reproducibilidad. Los geles con tinción de plata muestran un número significativo de proteínas se encuentran para interactuar con la proteína BRD4 y muy bajo fondo en el control (Figura 2B). Como se mencionó en la introducción, en este proceso de elución, el Halo-BRD4 no se eluye de la resina y cuando se mantenga unido covalentemente. Por lo tanto, no hay una banda significativa en este peso molecular de ser detectado en la tinción de plata (Figura 2B) o western blot (datos no mostrados). Para determinar si estas proteínas son específicas de BRD4, espectrometría de masas cromatografía de líquidos (LC-MS/MS) se realizó en la complex mezcla obtenida después de SDS elución. Se muestra en la figura 2C son recuentos espectrales y normalizada factor de abundancia espectral valores (NSAF) para interactores conocidas de BRD4 18-20 se encuentran en el análisis de espectrometría de masas de Halo-BRD4. La alta abundancia de los componentes de pTEFb 18,20 y también la proteína BRD9 19 confirmar la captura específica de los complejos BRD4. Como se predijo por los geles con tinción de plata (Figura 2B), numerosas otras proteínas también fueron identificados como potenciales interactores de BRD4 que no se observaron en el control (datos no mostrados). Como estos son hasta ahora desconocido, que necesitan para ser verificada independientemente por otras metodologías para confirmar si la proteína es un verdadero interactor, y si es así, si es directa o indirectamente asociados con BRD4. Complejos aislados también se pueden estudiar para la actividad; se recomienda para eluir complejos usando la proteasa TEV (Protocolo Sección 2.5) para que mantengan functy. En la Figura 3A, un gel de tinción de plata de los complejos desplegables Halo-HDAC1 liberados de la resina usando la proteasa TEV se muestra. Como la proteasa TEV escindirá en una región de unión entre la etiqueta de la proteína de fusión y su compañero de fusión, cantidades significativas de la proteína cebo, en este caso HDAC1, se observó (Figura 3A). Para determinar si esta fracción contenía la actividad de HDAC1, muestras de TEV eluidas se ensayaron en un ensayo de HDAC luminiscente, HDAC-Glo 21. Como se muestra en la Figura 3B, las muestras desplegables HDAC1 mostraron altos niveles de actividad HDAC1 (columna 1), que fue inhibida específicamente por un inhibidor de HDAC conocido, SAHA 22 (columna 2). Como controles para demostrar aún más la especificidad, no se observó inhibición de HDAC con un inhibidor de la familia de las sirtuinas relacionada, EX-527 22 (columna 3) y ninguna señal se detectó usando tampón solo y sin la muestra desplegable HDAC1 añadido (Columna 4). Un componente significativo de la funcióncol proteómica y complejos de entender, también es comprender la localización de proteínas y / o el tráfico. Como estas construcciones misma fusión pueden ser etiquetados con fluorescencia dentro de las células, que supervisó su localización utilizando la imagen confocal. Siguiendo el protocolo en la Sección 3, las células HeLa transfectadas transitoriamente con Halo-BRD4 (Figura 4A) y Halo-HDAC1 (Figura 4B) fueron marcadas fluorescentemente con el ligando TMR y la imagen. Como se muestra en las Figuras 4A y 4B, tanto localizado en el núcleo como se esperaba 17. Estos datos demuestran que la presencia de la etiqueta no alteró localización celular fisiológica de sus parejas de fusión. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Esquema de pulldown proteínas y aplicaciones de imagen confocal. Utilizando como<html> ingle construir varias aplicaciones para la comprensión de la función de proteínas en células de mamífero son posibles. Para todo, una construcción de fusión Halo es ya sea estable o transitoriamente expresado en células de mamífero adherentes o de suspensión. Para proteínas pulldowns complejas, las células se lisan, complejos son capturadas de forma covalente en la resina, y se eluyeron a través de cualquiera SDS elución (vía izquierda) o TEV división (vía derecha). Se recomienda SDS elución para proceder a análisis de espectrometría de masas, mientras TEV división es óptimo para realizar el análisis funcional. Para la caracterización de la expresión, localización celular, eventos de tráfico, o rotación de proteínas, células vivas que expresan proteínas de fusión se marcaron fluorescentemente y analizados en geles de SDS-PAGE o el uso de imágenes confocal. Ambos ligandos fluorescentes permeables o impermeables celulares están disponibles dependiendo de la localización o la presentación de la proteína de fusión dentro de la célula. igura 2 &quot;fo: content-width =&quot; 6 pulgadas &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 2. Expresión Halo-BRD4 proteínas, desplegable, y el análisis de espectrometría de masas. Geles (A) Una SDS PAGE que muestran la expresión de la proteína de Halo-BRD4 de fusión, 189 kD, y Halo etiqueta de la proteína de fusión sola, 34 kD, de control (Ctrl) dentro de un lisado celular HEK293T etiquetados con TMR ligando (Protocolo Sección 2.1). Los geles fueron escaneados con fluorimager para la detección y se utilizó un marcador fluorescente peso molecular. (B) geles de plata mancha de repeticiones biológica para jalones de muestras Halo-BRD4 y Ctrl eluidas con SDS. Tamaños peso molecular se indican para el gel. (C) recuentos espectrales (panel izquierdo) y factores de abundancia espectral normalizada valores (NSAF) (panel derecho) que representan la proteína de peso molecular de las proteínas identificadas en el análisis de espectrometría de masas de réplicas biológicas de Halo- BRD4 y Ctrl. Se muestran las proteínas conocidas para interactuar wITH BRD4, incluyendo componentes de pTEFb (CDK9 y Ciclina T) 18,20, así como BRD9 19. No hay péptidos de estas proteínas se identificaron en el Ctrl. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Halo-HDAC1 aislamiento compleja y análisis de la actividad. (A) geles Plata manchas que muestran el aislamiento de complejos de Halo-HDAC1 y de fondo de las teclas Ctrl después de TEV división (Protocolo de la sección 2.5). La legendaria banda de HDAC1 (55 kDa) y la banda de la proteasa TEV están etiquetados. La HDAC1 libre se genera por TEV división dentro de un enlazador optimizado entre la secuencia de fusión HaloTag y HDAC1 después de la captura en la resina (Figura 1). (B) Gráfico que muestra la actividad de HDAC1 aislamientos complejos muestras en un ensayo de histona desacetilasa luminiscente, HDAC- Glo 21. Columna 1 de la gráfica muestra una alta levels de actividad HDAC contenidas con las muestras desplegables Halo-HDAC1 (HDAC1). Columna 2 revela esta actividad se puede disminuir específicamente por la adición del inhibidor de HDAC, SAHA 22, a las muestras desplegables HDAC1. Como controles, Columna 3 demuestra un inhibidor de la histona específica a la familia sirtuin, pero no las HDAC, EX-527 22, no inhibe la actividad HDAC1 y Columna 4 muestra no se observa actividad utilizando tampón solo. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Halo-BRD4 y Halo-HDAC1 imagen confocal. Vivo de células de imagen confocal de células HeLa transfectadas con Halo-BRD4 (A) o halo-HDAC1 (B) marcado fluorescentemente con TMR ligando. (A) expresión de Halo-BRD4 está restringido al núcleo y (B) expresión de Halo-HDAC1 es predominantemente nuclear. El lado izquierdo de los paneles es el canal de fluorescencia y el lado derecho es una superposición del canal de fluorescencia con el canal de la CID para cada uno. Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio confocal equipado con un 37 º C + CO 2 cámara ambiental usando conjuntos de filtros apropiados. Las barras de escala = 20 m.

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Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Tecnología HaloTag es una tecnología multifuncional que ha mostrado un importante éxito en el aislamiento de pequeñas y grandes complejos de proteínas a partir de células de mamíferos. Aquí destacamos las ventajas de esta tecnología en comparación con las alternativas existentes y demostrar su utilidad para el estudio de numerosos aspectos de la función de las proteínas dentro de las células eucariotas.

El descubrimiento de las interacciones de proteínas y caracterización de la función de proteínas utilizando HaloTag Tecnología

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

discovering-protein-interactions-characterizing-protein-function

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K vistas.  Promega Corporation.  Tecnología HaloTag es una tecnología multifuncional que ha mostrado un importante éxito en el aislamiento de pequeñas y grandes complejos de proteínas a partir de células de mamíferos. Aquí destacamos las ventajas de esta tecnología en comparación con las alternativas existentes y demostrar su utilidad para el estudio de numerosos aspectos de la función de las proteínas dentro de las células eucariotas. 

Video: Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...