Agradecemos ao Dr. Martin Rosenberg, Dr. Gary Tarpley, e Dr. Keith Madeira para o apoio a este trabalho, e Dr. James Cali para a leitura crítica do manuscrito. DLD, JM, HB, NM, AN, JC, e MU são funcionários da Promega Corporation. MF, RJ, RA, e DA são funcionários da MS BioWorks, LLC.

Nota: O protocolo seguinte pode ser utilizado com qualquer fusão HaloTag e em qualquer linha celular escolhida de forma estável ou transientemente transfectadas. Para estes exemplos, vamos dar protocolos de transfecção transiente de fusões HaloTag em células HEK293T ou HeLa. Para todos os experimentos, recomendamos o uso do único controle proteína. 1. Fusão Protein Expression Teste <ol><li> Obter fusão construção de proteínas: <ol><li> Obter pré-fabricados vetor fusão HaloTag ou construir usando vetores existentes. Para mais informações sobre construções disponíveis, por favor, consulte a Tabela de reagentes específicos. </li><li> Se fazer qualquer clone, é recomendado verificar sequenciar o ADN. </li></ol></li><li> Testando expressão da proteína de fusão e controle: <ol><li> Para cada amostra, preparar 250 mL de tampão corante 1X SDS (60 mM de Tris HCL, pH 6,8, 0,75 mM de azul de bromofenol, 12,5% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, SDS a 0,5%). </li><li> Para cada proteína de fusãoe controlo, placa 0,5 ml de HEK293T ou células HeLa em seus meios de comunicação apropriada para uma densidade de 2-4 x 10 5 células / ml numa placa de 24 poços padrão. </li><li> Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, depois transfectar como recomendado. </li><li> 24 horas após a transfecção, adicione 0,5 mL de 5 mM de tetra-metil rodamina (TMR) ligante para a mídia de cada poço e misture delicadamente prato. </li><li> Incubar as células transfectadas contendo ligando durante 15 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Aspirar mídia off contendo ligando e lavar cada poço de células cuidadosamente com 1 ml de PBS temperatura ambiente. </li><li> Aspirar off PBS e realizar uma segunda lavagem com 1 ml RT PBS. </li><li> Remover PBS e adicionar 200 mL de 1X SDS carregando corante tampão directamente às células. </li><li> Pipeta lisado a partir de chapa em 1,5 ml tubo eppendorf. </li><li> Ferver lisado durante 5 min a 95 ° C. </li><li> Retirar 5-10 ul da reacção e da carga em gel de SDS-PAGE. </li><li> Use um scanner de detecção fluorescente(TMR Excitação: 555 nm, emissão: 585 nm) para detectar bandas. Utilizar marcadores de proteínas fluorescentes como padrões. </li><li> Se um scanner de detecção fluorescente não estiver disponível, realizar transferências Western usando anticorpos contra a proteína ou o isco ou marcação da proteína de fusão para detectar a expressão da proteína de fusão. </li></ol></li></ol> 2. Pulldowns Proteína <ol><li> Preparação de células transfectadas de forma transiente: <ol><li> Para cada fusão ou controlo preparar um prato de 15 centímetros, com 30 ml de células a 3-4 x 10 5 células / ml ou 1-1,2 x 10 7 células construção total por. </li><li> Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, depois transfectar construir como recomendado. </li><li> Após 24-48 horas pós-transfecção, remova a mídia e lavar cuidadosamente a camada de células com 20-25 ml de PBS gelado. </li><li> Remover lavagem PBS, em seguida, adicionar 25-30 ml de 4 ° C refrigerados PBS e raspe as células fora do prato. </li><li> Coletar as células em tubos cônicos e centrifuge durante 5-10 min a 2000 x g e 4 ° C. </li><li> Elimine o sobrenadante e coloca sedimento celular a -80 ° C durante um mínimo de 30 minutos ou, no máximo de 6 meses. </li></ol></li><li> Equilíbrio da resina HaloLink: <ol><li> Para cada fusão ou controlo de exemplo, preparar 12 ml de tampão de Equilibration Resina / lavagem (100 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM e 0,005% IGEPAL CA-630) Nota:. Isso é muito importante para fazer e utilizar a resina Tampão de Equilíbrio dentro de 12 horas como diluído IGEPAL CA-630 não é estável ou eficaz para além deste período de tempo. </li><li> Gentilmente agite ou misture resina para obter uma suspensão uniforme. </li><li> Para cada experimento suspenso, dispensar 200 mL de resina em um 1,5 ml microtubos. </li><li> Centrifugar durante 1 minuto a 800 xg (por exemplo, 3000 RPM numa microcentrífuga), em seguida, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante (etanol), sem perturbar a resina na parte inferior do tubo. </li><li> Adicionar 800 ul de Resina de Equilíbrio / Wash tampão e misture bem, invertendo o tubo várias vezes. </li><li> Centrifugar durante 2 min a 800 x g, então, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. </li><li> Repita os passos 2.2.5 e 2.2.6 mais duas vezes para um total de 3 lavagens. </li><li> Não remova a lavagem final ou sobrenadante até que esteja pronto para adicionar lisados ​​celulares descritos abaixo (Passo 2.3.8) para evitar que a resina de secar. </li></ol></li><li> Encadernação e lavagem de complexos de fusão: <ol><li> Para cada amostra, preparar 500 mL de tampão de lise de mamíferos (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% de Na Desoxicolato) e 1 ml de tampão 1X TBS (100 mM Tris-HCl pH 7,5 e NaCl 150 mM). </li><li> Descongele as pelotas de células e ressuspender em 300 mL de tampão de lise de mamíferos por pipetagem cima e para baixo ou brevemente vortex. </li><li> Adicionar 6 ul de 50X Protease Inhibitor Cocktail (800 ug / ml de cloridrato de benzamidina, 500 ug / ml fenantrolina, 500 ug / ml de aprotinina, 500 ug / ml de leupeptina, 500 &amp; #. 181; g / ml de pepstatina A, 50 mM de PMSF) Nota: cocktail de protease que incluem AEBSF não pode ser usado como estes interferem com a ligação de marcação de proteínas de fusão. </li><li> Adiciona-se 3 ul de ADNase RQ1 e inverter durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Dounce com homogeneizador de vidro de 2,0 ml de tamanho; 25-30. Golpes no gelo, ou passar as células através de uma agulha G 25 ou 27 5-10 vezes para completar a lise Nota: Sonication não é recomendado como complexos podem desmoronar e sobre-aquecimento pode afetar a atividade tag proteína de fusão. </li><li> Centrifugar a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C para limpar o lisado. </li><li> Transferir lisado claro, cerca de 300 mL volume total, para novo tubo e colocar no gelo. </li><li> Adicionar para limpar lisado um adicional de 700 mL de tampão TBS 1X e misture bem por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Tome tubos de resina equilibrada preparadas no Passo 2.2.8 e remover final de lavagem / sobrenadante a partir da resina, sem perturbar a resina na parte inferior do tubo. </li><li> Adicione a cada tuser de resina, o 1 ml de lisado diluído. </li><li> Incubar, com mistura, em um tubo de rotor (ou misturador suave) durante 15 min a 22 ° C. Nota: A sedimentação da resina durante esse tempo reduz a eficiência de ligação. Se ligação a 4 ° C é desejável, tanto pela mistura durante 1 hora. </li><li> Tubos de resina Centrífuga para 2 min a 800 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de Resina Equilíbrio / Wash feitos no Passo 2.2.1 e misture bem, invertendo o tubo de resina com a mão várias vezes. </li><li> Tubos de resina Centrífuga para 2 min a 800 xg e descartar a lavagem. </li><li> Repetir Passos 2.3.12 2.3.14 seguido por três vezes adicionais. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de Equilibration Resina / Wash e incubar a 22 ° C durante 5 minutos, com rotação constante. </li><li> Tubos de resina Centrífuga para 2 min a 800 xg e descartar a lavagem. </li><li> Dependendo da aplicação final (ver Introdução para mais explicações), de avançar para a Seção 2.4 ou 2.5. </li></ol></li><li> SDS eluição de géis desnaturantes, as transferências Western, ou espectrometria de massa: <ol><li> Ressuspender a resina de cada amostra em 50 ul de tampão de eluição de SDS (SDS a 1% e 50 mM Tris-HCl pH 7,5) </li><li> Agitar os tubos a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 800 xg e transferência de produtos de eluição para tubos frescos para análise. </li><li> Para western blot ou gel prata mancha, carga 5-10 mL em um gel desnaturante SDS. </li><li> Para a espectrometria de massa, salvo 40 ul de cada amostra a -20 ° C. </li></ol></li><li> Protease TEV eluição para os ensaios funcionais, as transferências Western, ou espectrometria de massa: <ol><li> Após a remoção da última lavagem, ressuspender a resina em 50 mL de tampão de clivagem ProTEV e 30 unidades da enzima de TEV. </li><li> Incubar a 25 ° C com agitação durante 1 hora. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 800 x g. </li><li> Transferir fluido para tubos frescos. </li><li> Amostra Armazenar a 4 ° C para utilização imediata em ensaios funcionais. </li></ol></li></ol> 3.Imagem de celular fluorescente Labelled Proteínas de Fusão Usando um citoplasmática e nuclear Permeável Ligand <ol><li> Transfecção, etiqueta, e células de imagem: <ol><li> Em uma lamela 8 bem compartimentado para cada proteína de fusão ou de controlo, a placa 400 uL de células HeLa em seus meios de comunicação apropriada em cada poço a uma densidade de 1-2 x 10 5 células / ml. </li><li> Incubar durante 18-24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, depois transfectar como recomendado. </li><li> 18-24 h após a transfecção, diluir TMR ligando 1:200 em meios celulares adequadas, em seguida adicionar 100 ul desta solução a cada poço e misturar suavemente. </li><li> Incubar as células transfectadas contendo ligando durante 15 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Aspirar a mídia off contendo ligante e substituir por 500 mL de mídia apropriada falta de fusão da proteína ligante tag, que foi pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Repita duas vezes para um total de três lavagens. </li><li> Coloque as células de volta em incubadora (376; C e 5% CO 2) durante 30 min. </li><li> Aspirar off mídia e substitua-o por 500 mL de meios de comunicação adequados, que foi pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Imagem em um microscópio utilizando parâmetros de aquisição apropriados (TMR de excitação: 555 nm; emissão: 585 nm). </li></ol></li></ol>

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	<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+proteomics:+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics.">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).</li><li>Tyers, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genomics+to+proteomics.">From genomics to proteomics.</a> Nature. 422, 193-197 (2003).</li><li>Coulombe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+networks+of+the+molecular+machines+that+decode,+replicate,+and+maintain+the+integrity+of+the+human+genome.">Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome.</a> Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).</li><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+survey+reveals+modularity+of+the+yeast+cell+machinery.">Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.</a> Nature. 440, 631-636 (2006).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Sardiu, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+assembly+of+human+protein+interaction+networks+from+label-free+quantitative+proteomics.">Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li><li>Daniels, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+the+complexity+of+human+RNA+polymerase+complexes+using+HaloTag+technology+coupled+to+label+free+quantitative+proteomics.">Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics.</a> J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).</li><li>Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dehalogenase-based+protein+fusion+tag+capable+of+rapid,+selective+and+covalent+attachment+to+customizable+ligands.">Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands.</a> Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).</li><li>Ohana, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag-based+purification+of+functional+human+kinases+from+mammalian+cells.">HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells.</a> Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).</li><li>Black, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KDM4A+Lysine+Demethylase+Induces+Site-Specific+Copy+Gain+and+Rereplication+of+Regions+Amplified+in+Tumors.">KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors.</a> Cell. 154, 541-555 (2013).</li><li>Deplus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+and+TET3+regulate+GlcNAcylation+and+H3K4+methylation+through+OGT+and+SET1/COMPASS.">TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS.</a> EMBO J. 32, 645-655 (2013).</li><li>Galbraith, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1A+Employs+CDK8-Mediator+to+Stimulate+RNAPII+Elongation+in+Response+to+Hypoxia.">HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia.</a> Cell. 153, 1327-1339 (2013).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nat Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Jang, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain+protein+Brd4+is+a+positive+regulatory+component+of+P-TEFb+and+stimulates+RNA+polymerase+II-dependent+transcription.">The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription.</a> Mol Cell. 19, 523-534 (2005).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Brd4+extraterminal+domain+confers+transcription+activation+independent+of+pTEFb+by+recruiting+multiple+proteins,+including+NSD3.">The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3.</a> Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+P-TEFb+for+stimulation+of+transcriptional+elongation+by+the+bromodomain+protein+Brd4.">Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4.</a> Mol Cell. 19, 535-545 (2005).</li><li>Halley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminogenic+HDAC+activity+assay:+validation+and+screening.">A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening.</a> J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).</li><li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+selectivity+and+beyond.">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotechnol. 28, 1259-1266 (2010).</li><li>Daniels, D. L., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+protein--DNA+complexes+using+HaloCHIP,+an+antibody-free+alternative+to+chromatin+immunoprecipitation.">Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).</li><li>Urh, M., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag+a+Platform+Technology+for+Protein+Analysis.">HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis.</a> Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).</li></ol>

Taxas de publicação para este artigo são patrocinados pela Promega Corporation. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy e Marjeta Urh são funcionários da Promega Corporation, o proprietário comercial, através de cessão de patentes da tecnologia HaloTag e suas aplicações. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama e David Allen são funcionários da MSBioworks, que fornece serviços de espectrometria de massa descritos neste manuscrito.

Apresentado aqui são duas proteínas de fusão, Halo-BRD4 e Halo-HDAC1, caracterizada em células de mamíferos eucarióticas para a expressão de proteínas, isolamento e atividade complexa e localização celular. No trabalho através destes vários protocolos, existem vários passos importantes para o sucesso de cada experimento. Como é o caso com qualquer proteína de fusão, o nível de expressão e a colocação da etiqueta propriamente dito pode ser crítico para a manutenção da fisiologia. Por conseguinte, é importante ter em conta que as fusões de C-terminal N-e / ou necessita de ser concebido, se o conhecimento prévio ou trabalhar com outra marca não tem sido demonstrado para a proteína particular de escolha. No que se refere a expressão, se o nível for muito alto, a diluição do DNA pode ser realizada durante a transfecção ou a utilização de vectores com promotores mais fracos são possíveis para alcançar o nível que é apropriado. Os trabalhos anteriores foram realizados mostrando eficiente isolamento de complexos macromoleculares em endógena levels de expressão 8, permitindo o trabalho em níveis muito baixos de expressão. Se possível, estudos de localização de celular também seria capaz de fornecer informações sobre a tag posição ótima colocação, bem como o nível de expressão relativa necessária para a fisiologia adequada. Uma vez que as proteínas de fusão estão prontos para experiências suspensos, para obter o máximo de sucesso com o protocolo que é muito importante para seguir os intervalos de tempo recomendados na lise, de ligação, e as secções de lavagem, como um dos maiores vantagens é a velocidade do isolamento complexo processo. Se qualquer um destes passos são prolongadas no tempo, tal como é exigido para um método de captura com base em anticorpo, existe um risco de dissociação ou complexo aumentou ligação não específica 8. Da mesma forma, se os tempos são encurtados durante a lise celular ou ligação, as células podem não ser completamente lisadas ou eficientemente capturados respectivamente. Se o número de lavagens é decrfacilitado ou boa mistura da resina não ocorre durante as lavagens de ligação ou, em seguida, os níveis de proteínas não-específicos de fundo será aumentada. Além disso, os meios de lise é muito importante, relacionada com a eficiência de ligação à resina. Tentativas para sonicar as amostras, remover o detergente recomendado, adicionar SDS ou outro detergente forte, e / ou que contém o inibidor de protease AEBSF irá resultar na redução ou perda de ligação de proteínas de fusão e os seus complexos para a resina. Métodos para isolamento complexo de células de mamíferos e luta análise proteômica humano com o desafio de reduzir a fundo na análise por espectrometria de massa 16 existentes. Este tem sido tão significativa que um repositório de proteínas contaminantes foi criado por numerosos grupos de espectrometria de massa 16. Fundo em amostras de espectrometria de massa suspensos pode ser definida como qualquer coisa que impede a identificação deverdadeiros interagentes da proteína isca. Como tal, o fundo pode surgir a partir de proteínas contaminantes não-específicos ou também grandes concentrações de proteína isco ou anticorpos utilizados para precipitar proteínas isco. O trabalho significativo foi feito em optimizar o protocolo suspenso aqui apresentada, bem como a resina de minimizar o nível de proteínas contaminantes não-específicos do processo suspenso. Isto é evidente nos géis de mancha de prata e análise de espectrometria de massa do controlo (Figura 2). Para lidar com os altos níveis de proteína isca ou anticorpos que podem ser igualmente prejudiciais como contaminantes e com que outras metodologias lutam, o menu suspenso com SDS eluição é recomendada (Protocolo Seção 2.4). Devido à ligação covalente à resina, este processo vai deixar a maior parte da proteína de fusão de partida de forma covalente ligado à resina. Uma pequena percentagem de isca é observada na análise por espectrometria de massa, o qual se acreditaa ocorrer através de hidrólise, mas que não apresentam um problema para a detecção de outras interacções fracas ou transientes 8. Como mencionado na introdução, avanços significativos em proteômica têm sido ativado por avanços significativos em 1,7 espectrometria de massa. Portanto, é importante realçar os parâmetros importantes da escolha de análise de espectrometria de massa para deconvolute a mistura de proteínas obtidas nas puxadas. Instrumentação deve ser robusto e capaz de rotina e eficiente de analisar amostras que contêm uma pequena quantidade de proteína, frequentemente menos do que &lt;1 pg. Cromatografia em nanoescala envolvendo 50-75 mM colunas de HPLC de diâmetro interno com caudais 100-300 nl / min gama é normalmente empregado para fins de compatibilidade com as amostras de pequenas dimensões e de maximizar a sensibilidade do espectrômetro de massa. Para maximizar a informação adquirida em um estado único de análise of os espectrômetros de massa de arte capaz de adquirir espectros de massa de alta resolução em uma escala de tempo compatível com separações em nanoescala acima mencionados, ≥ 10 Hz, são normalmente empregadas. Estes instrumentos têm níveis attomolar de sensibilidade e pode rotineiramente adquirir dados com precursor ppm sub e tolerâncias de erro massa de íons produto. Estas características de desempenho servem para aumentar o rendimento do número de proteínas identificadas e a confiança associada com estas identificações. Com esses dados podemos demonstrar localização fisiológica celular, proteína adequada: interações proteína, juntamente com potencial para a descoberta de novas interações, e isolamento de complexos ativos tudo usando um único construto. Com efeito tecnologias alternativas podem ser usadas para cada um destes diferentes aspectos, mas não provável para todos 23,24. Com a tecnologia HaloTag, uma abordagem multifuncional pode ser usado, avançando proteomics estudos e obter uma compreensão mais completa da função das proteínas em células de mamíferos.

Compreensão da função celular, resposta a estímulos e mudanças no desenvolvimento e / ou doença estados está intrinsecamente ligada à de-convolução do proteoma ao longo destes diferentes estados dinâmicos 1,2. Muito tem sido feito para entender o proteoma dos organismos inferiores, no entanto, dado o número de proteínas e todas as interações possíveis, este tem sido um grande desafio para enfrentar o proteoma humano 1,3-7. Avanços em espectrometria de massas permitiram grandemente a capacidade de realizar esses estudos, e aqui apresentamos um avanço adicional e significativa com o desenvolvimento da tecnologia HaloTag tanto para captura eficiente de complexos de proteínas e caracterização funcional de proteínas humanas a partir de células de mamíferos 8-10. Esta tecnologia foi recentemente demonstrado em vários estudos como um fator crítico para a descoberta de importantes interações, permitindo a visão sobre a função da proteína novela e understanding de doença 11-13. A proteína de fusão HaloTag foi inicialmente desenvolvido para resolver vários desafios de marcas tradicionais e afinidade anticorpos como relacionados à captura de proteínas, purificação e rotulagem 8-10. Dentro de quase todos os métodos de captura e de purificação de proteínas, há um passo de interacção não covalente que é utilizado para o enriquecimento de uma proteína particular 14. Durante esta etapa, a proteína e / ou de complexo podem dissociar devido à difusão, especialmente se o processo requer horas em vez de minutos. Para resolver esta preocupação, a proteína de fusão foi especificamente concebido para interagir de forma rápida e irreversivelmente com os seus ligandos, que podem ser ou partículas, superfícies ou fluoróforos 9. Portanto, uma vez que está ligada ao seu ligando, que permanece ligado, que é um dos factores mais diferenciador relativamente a outras marcas de afinidade. Também demonstrado aqui, é a capacidadepara abordar questões biológicas diferentes com uma construção única, que é possível por ligantes 9 (Figura 1) alternadas. Por exemplo, para interrogar as interacções proteína ou função, os ligandos da superfície são usadas para a captura de proteínas ou complexos (Figura 1). Em uma experiência separada, a mesma proteína de fusão pode ser marcada por fluorescência para estudar a localização celular, tráfico, ou retorno da proteína (Figura 1). É importante lembrar, contudo, que uma vez que um ligando está ligado, se se trata de uma superfície ou um fluoróforo, é irreversível e, por conseguinte, outros ligandos não pode, então, ser subsequentemente ligado no mesmo experimento. Análise das tecnologias existentes para mapear as interações proteína revelam a dificuldade de isolar eficientemente interações específicas, incluindo aquelas que são mais transitória ou estão em menor abundância 1,6,7,14,15. Além disso, trabalhos recentes de numeroso grupos mostra a preocupação de que os métodos de isolamento dentro tradicionais, especialmente na área de proteómica humanos, há um número significativo de contaminantes de proteínas, que podem mascarar os sinais de verdadeiros interactores em análise por espectrometria de massa 16. As propriedades desenvolvidos para a proteína HaloTag e seu endereço resina co-desenvolvido bem estas preocupações. No protocolo para pulldowns complexos (Figura 1), a ligação dos complexos pode ser alcançada em 15 min, ambos promovendo a captura complexa e reduzir os níveis de ligação não específica 8. Além disso, de forma irreversível ligação permite a captura eficiente de proteínas de baixa abundância e permite a utilização de muito menos células, reduzindo de novo o fundo 8. Uma vez que a captura dos complexos é estabelecida, o protocolo inclui condições suaves de lavagem para manter a integridade do complexo. A eluição de complexos capturados podem ser realizados por dois métodos e a escolha de qual o método é ditada pelo objectivo da anal jusanteysis. Se o desejo é o de analisar ou descobrir proteínas que interagem por Western blot ou espectrometria de massa, então recomenda-se a eluição com complexos de desnaturantes, tais como o SDS ou ureia (Figura 1). Isto é particularmente vantajoso para a espectrometria de massa como a proteína inicialmente fundida com HaloTag, denominada proteína isca, irá permanecer atrás ligado à resina e, portanto, não irá dominar a população de péptidos detectados em espectrometria de massa. Isto também significa, porém, que a proteína isca provavelmente não será visível na análise por western blot, uma diferença significativa em relação a outras purificações afinidade não covalentes ou colegas de imunoprecipitações. Se o objectivo é o de purificar um complexo intacto para ser utilizado para estudos funcionais, a eluição pode ser realizada utilizando TEV (Tobacco Etch Vírus) da protease, a qual reconhece a sua sequência de clivagem cognato codificado entre a proteína de fusão e da proteína de isco (Figura 1). Tamostras stes também podem ser analisados ​​por espectrometria de massa, mas, como mostrado mais tarde, irão conter uma quantidade significativa de proteína isco, que pode impedir a detecção de baixa abundância, interactores específicos. Apresentamos aqui os protocolos de imagiologia e de pulldown aplicados a duas proteínas terapêuticas importantes, a proteína bromodomain BRD4 e uma histona-desacetilase, HDAC1 17. Mostrámos com estes exemplos, a interacção com os parceiros esperados, conforme determinado por espectrometria de massa, a actividade enzimática após o isolamento complexo para HDAC1, e localização celular adequada para ambos. Juntos, estes resultados demonstram a natureza multifuncional e força da tecnologia para a caracterização de proteínas interacções eucarióticas e função.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">HeLa Cells</td>
			<td style="width:204px;">ATCC</td>
			<td style="width:103px;">CCL-2</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellular growth media</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - tissue culture certified</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Control Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6591</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-BRD4</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC11882</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-HDAC1</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC02563</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Clones containing content</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">http://www.promega.com/FindMyGene/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">Choose based upon expression level and HaloTag orientation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag TMR Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18896</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6500</td>
			<td style="width:280px;">Contains HaloTag TMR ligand</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6504</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protease Inhibitor Cocktail, 50X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6521</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9381</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Monoclonal Antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProTEV Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloLink Resin</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>G1912</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HDAC-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6420</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS + 0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture vessels and dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable cell lifter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-773-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K885300-0002</td>
			<td style="width:280px;">25-to 27- gauge needle could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator such as Labquake</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4002110Q</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for binding and washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovering protein interactions and characterizing protein function using halotag technology

Pesquisa em proteômica explodiu nos últimos anos com os avanços na capacidade de espectrometria de massa que levaram à caracterização de inúmeros proteomas, incluindo os de vírus, bactérias e fungos. Em comparação, a análise do proteoma humano fica para trás, em parte devido ao grande número de proteínas que devem ser estudados, mas também a complexidade das redes e interações destes presentes. Para abordar especificamente os desafios de compreender o proteoma humano, desenvolvemos tecnologia HaloTag para o isolamento de proteínas, particularmente forte para o isolamento de complexos multiprotein e permitindo a captura mais eficiente de interações fracas ou transitórios e / ou proteínas de baixa abundância. HaloTag é uma tag geneticamente codificado proteína de fusão, projetado para covalente, específico, e imobilização rápida ou rotulagem de proteínas com vários ligantes. Aproveitando essas propriedades, inúmeras aplicações para as células de mamíferos foram desenvolvidos para personagemize a função da proteína e aqui apresentamos metodologias incluindo: proteína pull-downs utilizados para a descoberta de novas interações ou ensaios funcionais e localização celular. Encontramos vantagens significativas na rapidez, especificidade e captura covalente de proteínas de fusão de superfície para análise proteómica, em comparação com outros métodos tradicionais não covalentes. Demonstramos estes e a ampla utilidade da tecnologia que utiliza duas proteínas epigenética importantes, como exemplos, a proteína humana bromodomain BRD4, e histona deacetilase HDAC1. Estes exemplos demonstram o poder desta tecnologia para permitir a descoberta de novas interações e caracterizar localização celular em eucariotos, o que, em conjunto, uma maior compreensão da proteômica funcionais humanos.

Quando se trabalha com qualquer nova proteína de fusão, que é importante para o primeiro ensaio para a expressão dessa proteína, após a transfecção e também validar que uma proteína de peso molecular correcto está a ser produzido. Como proteínas de fusão HaloTag pode ser fluorescente e covalentemente marcada com ligantes, permeáveis ​​ou impermeáveis, dependendo da localização, pode-se determinar rapidamente a expressão pela aplicação de lisados ​​celulares a electroforese em gel desnaturante seguido por varrimento sobre um fluorimager. Usando o protocolo descrito na Seção 1.2, a expressão de Halo-BRD4 (189 kD) e só o controle HaloTag (Ctrl) é observada (34 kD, Figura 2A). Como mencionado no protocolo, a expressão de proteínas de fusão também pode ser detectada utilizando Western blots tradicionais com anticorpos anti-HaloTag, ou se eles estiverem disponíveis, os anticorpos para a proteína de isco. Se possível, é recomendável usar o ligando fluorescente em vez disso, uma vez que é mais específica, mais rápida, mais fácil e than detecção de anticorpos, e também quantitativa 10. Após a expressão do correcto comprimento total da proteína de fusão é verificado, puxadas da proteína pode ser realizada. Mostrado na Figura 2B são os géis de prata manchadas de repetições biológicas de Halo-Brd4 e Ctrl pulldowns eluídas por SDS (Protocolo Seção 2.4) que demonstram alta reprodutibilidade. Os géis de mancha de prata mostram um número significativo de proteínas encontram-se a interagir com a proteína BRD4 e muito baixo fundo no controlo (Figura 2B). Como mencionado na introdução, no presente processo de eluição, o halo-BRD4 não ser eluída a partir da resina, uma vez que continua a ser ligado de forma covalente. Portanto, não há uma banda significativa a este peso molecular a ser detectada em mancha de prata (Figura 2B) ou Western blot (dados não mostrados). Para determinar se estas proteínas são específicas de BRD4, espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS/MS) foi realizada sobre o complex mistura obtida após SDS eluição. Mostrado na Figura 2C são contagens espectrais e normalizado fator abundância espectral valores (NSAF) para interagentes conhecidos de BRD4 18-20 encontrados na análise de espectrometria de massa Halo-BRD4. A elevada quantidade de componentes de pTEFb 18,20 e também a proteína 19 BRD9 confirmar captura específica dos complexos Brd4. Como previsto pelos géis de mancha de prata (Figura 2B), numerosas outras proteínas também foram identificados como potenciais interactores de BRD4 que não foram observados no controlo (dados não apresentados). Como estes são previamente desconhecido, eles precisam ser verificadas de forma independente por outras metodologias para confirmar se a proteína é um verdadeiro interator, em caso afirmativo, se está direta ou indiretamente associada a BRD4. Isolado complexos pode também ser estudado para a actividade; é recomendável para eluir complexos utilizando protease TEV (Protocolo Seção 2.5), de modo que eles mantenham functionality. Na Figura 3A, um gel de coloração de prata de complexos pulldown Halo-HDAC1 libertados a partir da resina utilizando protease de TEV é mostrado. Como protease TEV vai clivar numa região ligante entre o tag de proteína de fusão e do seu parceiro de fusão, uma quantidade significativa de proteína isco, neste caso, HDAC1, sejam observados (Figura 3A). Para determinar se esta fracção continha actividade de HDAC1, TEV amostras eluídas foram testadas num ensaio luminescente de HDAC, HDAC-Glo 21. Como mostrado na Figura 3B, as amostras de HDAC1 pulldown mostrou níveis elevados de actividade HDAC1 (coluna 1), o qual foi especificamente inibida por um inibidor de HDAC conhecidos, SAHA 22 (Coluna 2). Como controlos para demonstrar ainda mais a especificidade, nenhuma inibição de HDAC foi observada com um inibidor da família SIRTUINA relacionada, EX-527 22 (coluna 3) e nenhum sinal foi detectado utilizando tampão sozinha, sem a amostra HDAC1 suspenso adicionado (Coluna 4). Um componente significativa da funçãoproteômica ai e compreensão complexos, também é o entendimento de localização e / ou tráfico de proteína. Como essas construções mesmo de fusão pode ser fluorescente etiquetado no interior das células, acompanhámos a sua localização utilizando imagens confocal. Seguindo o protocolo na Seção 3, as células HeLa transfectadas transitoriamente com Halo-BRD4 (Figura 4A) e Halo-HDAC1 (Figura 4B) foram fluorescente etiquetado com o ligante TMR e fotografada. Como mostrado nas Figuras 4A e 4B, tanto localizadas ao núcleo 17 como esperado. Estes dados demonstram que a presença de etiqueta não alterou a localização celular fisiológica dos seus parceiros de fusão. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Esquema de suspenso proteínas e aplicações de imagem confocal. Usando como<html> ingle construir várias aplicações para entender a função da proteína em células de mamíferos são possíveis. Por tudo, uma construção de fusão de halo ou é expressa de forma transiente ou de forma estável em células de mamífero aderentes ou em suspensão. Para proteína pulldowns complexos, as células são então lisadas, complexos são covalentemente capturado em resina, e eluída através de eluição ou SDS (via da esquerda) ou de clivagem TEV (via direita). SDS eluição é recomendado para proceder à análise por espectrometria de massa, enquanto que a clivagem de TEV é ideal para a realização de análise funcional. Para caracterizar expressão, localização celular, os eventos de tráfico, ou turnover de proteína, as células vivas que expressam proteínas de fusão são fluorescente etiquetado e posteriormente analisado em SDS PAGE ou usando imagens confocal. Ambas as células ligantes fluorescentes permeáveis ​​ou impermeáveis ​​estão disponíveis, dependendo da localização ou a apresentação da proteína de fusão no interior da célula. igura 2 &quot;fo: Content-width =&quot; 6 pol &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Expressão Figura 2. Halo-BRD4 proteína, suspenso, e análise de espectrometria de massa. Géis (A) A SDS página que mostra a expressão da proteína Halo-BRD4 fusão, 189 kD, e só o Halo tag proteína de fusão, 34 kD, controle (Ctrl) dentro de um lisado celular HEK293T rotulados com TMR ligante (Protocolo Seção 2.1). Os géis foram escaneados com fluorimager para detecção e um marcador fluorescente peso molecular foi usado. (B) géis de prata mancha de repetições biológicas para pulldowns de Halo-Brd4 e Ctrl amostras eluídas com SDS. Tamanhos de peso molecular são indicados para o gel. (C) contagens espectrais (painel esquerdo) e normalizados factores abundância espectrais valores (NSAF) (painel da direita), que representam a proteína de peso molecular de proteínas identificadas na análise por espectrometria de massa de réplicas biológicas de Halo- BRD4 e Ctrl. Mostram-se as proteínas conhecidas por interagirem wom BRD4, incluindo componentes de pTEFb (CDK9 ciclina e t) 18,20, bem como BRD9 19. Nenhum destes péptidos a partir de proteínas foram identificadas no Ctrl. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig3highres.jpg" width="600" /> Halo-HDAC1 isolamento Figura 3. Complexo e análise da atividade. (A) géis de prata mancha mostrando o isolamento de complexos de Halo-HDAC1 e fundo do Ctrl após TEV clivagem (Protocolo Seção 2.5). O destaque HDAC1 banda (55 kDa) ea banda protease TEV são rotulados. O HDAC1 livre é gerada por clivagem TEV dentro de um ligante optimizado entre a sequência de fusão HaloTag e HDAC1 após captura sobre a resina (Figura 1). (B) O gráfico mostra a actividade de HDAC1 amostras isolations complexos num ensaio de histona deacetilase luminescente, HDAC- Glo 21. Coluna 1 do gráfico mostra alta levels de atividade HDAC contidos com as amostras suspensos Halo-HDAC1 (HDAC1). A coluna 2 revela que esta actividade pode ser especificamente diminuída pela adição do inibidor de HDAC, a SAHA 22, para as amostras de pulldown HDAC1. Como controles, Coluna 3 demonstra um inibidor da deacetilase específico para a família sirtuin, mas não HDAC, EX-527 22, não inibe a atividade HDAC1 e Coluna 4 mostra nenhuma atividade é observada utilizando tampão sozinho. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Halo-BRD4 e Halo-HDAC1 imagem confocal. Vivo de células de imagem confocal de células HeLa transfectadas com halo-BRD4 (A) ou do halo-HDAC1 (B) marcado por fluorescência com TMR ligando. (A) a expressão halo-BRD4 é restrito para o núcleo e (B) a expressão halo-HDAC1 é predominantemente nuclear. O lado esquerdo de painéis é o canal fluorescente e do lado direito é uma sobreposição do canal fluorescente com o canal de DIC para cada um. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal equipado com um + CO2 câmara ambiental a 37 ° C por meio de filtros adequados. Barras de escala = 20 um.

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Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Tecnologia HaloTag é uma tecnologia multifuncional que demonstrou o sucesso significativo no isolamento de pequenas e grandes complexos de proteínas a partir de células de mamíferos. Aqui destacam-se as vantagens desta tecnologia em relação às alternativas existentes e demonstrar a sua utilidade para estudar vários aspectos da função da proteína dentro das células eucarióticas.

Descobrindo Interações proteína e caracterização da função das proteínas Usando HaloTag Tecnologia

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.8K visualizações.  Promega Corporation.  Tecnologia HaloTag é uma tecnologia multifuncional que demonstrou o sucesso significativo no isolamento de pequenas e grandes complexos de proteínas a partir de células de mamíferos. Aqui destacam-se as vantagens desta tecnologia em relação às alternativas existentes e demonstrar a sua utilidade para estudar vários aspectos da função da proteína dentro das células eucarióticas. 

Vídeo: Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...