This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.

NOTA: El protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de la Universidad Hebrea de Jerusalén. 1 Preparación de la solución de ACSF <ol><li> Preparar la solución de ACSF como se describe en la Tabla 1. Hacer 1 L en ddH 2 O (&gt; 18 mW de pureza), con lo que la osmolaridad a ~ 300 mOsm / L con la adición apropiada de agua o NaCl. </li></ol> 2. Equipo y distribución de la habitación Los equipos para el monitoreo de la conducta locomotora inducida por la cocaína consiste en cámaras de comportamiento (50 x 45 cm) de cable con una fuente de luz interior, el ventilador y la cámara (o sensores infrarrojos), y equipado con una caja de plexiglás interior (30 x 30 cm) en que los ratones se les permite moverse libremente mientras su locomoción es monitoreado. La prueba de comportamiento se debe realizar entre 1 hora después de las luces a 1 hora antes de las luces, en un ciclo de luz / oscuridad regular. Los animales deben ser entrenados constantemente a la misma hora cada día. <ol><li&gt; Conecte la cámara o sistema de infrarrojos de un sistema adecuado para el seguimiento y registro de la conducta locomotora de los ratones. </li><li> Limpiar las cámaras después de cada ensayo con desinfectante proporcionada por las instalaciones del ratón y / o eliminación del olor de reactivo, con el fin de prevenir el sesgo de referencia olfativa y para asegurar una desinfección adecuada. </li></ol> IMPORTANTE: Si bien el manejo de los ratones sean tranquilo, tranquilo y cuidado. 3. Preparación de los animales <ol><li> Casa 5 C57BL6 ratones macho (6-12 semanas de edad; ~ 25-35 g de peso) por jaula, en una habitación con una luz de 12 h / oscuridad ciclo y el acceso libre a comida y agua, de acuerdo con las normas y requisitos de animales local Cuidado orientación y protocolos Comité. Antes de iniciar el experimento, sopesar los ratones y registrar los datos. La cocaína se administra después de acuerdo con el peso de los ratones. </li><li> Transferir todas las jaulas que contienen los ratones en el comportamiento piezas 30 min antes de iniciar el primer ensayo. </li><li> Habituar a toda lalos ratones utilizados en el experimento para experimentador manipulación, inyecciones y controlar la configuración de la conducta. Esto se logra mediante 3 inyecciones intraperitoneales diarias consecutivas de 250 l de solución salina como se describe a continuación. </li><li> Administrar una inyección intraperitoneal de 250 l de solución salina. Inmediatamente después de la inyección, colocar el ratón en una cámara de comportamiento para supervisar la actividad locomotora durante 15 min. Repita esta acción durante 3 días consecutivos, a la misma hora cada día. </li><li> En el cuarto día, divida a los ratones en dos grupos. Preparar una solución madre de cocaína en 2 mg / ml en solución salina. Administrar una única inyección de solución de cocaína (final de 20 mg / kg) al grupo experimental de acuerdo con el peso del ratón (por ejemplo, para un ratón 25 g - inyectar 250 l, mientras que un ratón 30 g recibirá 300 l). Administrar solución salina al grupo de control. Inmediatamente después de la inyección, colocar el ratón durante 20 min en una cámara de comportamiento para el seguimiento de la actividad locomotora (typicaliado, los primeros 15 min se supervisan). </li><li> Después de la inyección de cocaína, sacrificar los ratones en diferentes puntos de tiempo (0, 1, 2, 4, 8 y 24 h después de la inyección). Es importante destacar que, asegúrese de que los ratones de referencia (0 punto de tiempo) no recibirán ningún tipo de inyección en el día de hoy. Debido a su importancia, es imperativo incluir repeticiones del grupo de referencia. </li></ol> 4. Disección del núcleo accumbens <ol><li> Anestesiar a los ratones con isoflurano en el momento apropiado después de la inyección de cocaína / solución salina. El isoflurano se debe ventilar directamente fuera de la habitación. Por lo tanto, el procedimiento se debe realizar en una campana para vapores químicos. </li><li> Monitorear la profundidad de la anestesia probando el reflejo del pie trasero. Pellizcar la pata para provocar una respuesta de retirada por el animal. Un animal que muestra un reflejo no está a un nivel quirúrgico de anestesia y no en un estado de eutanasia. </li><li> Extracción del cerebro: <ol><li> La eutanasia el ratón por decapitación. </li> &lt;li&gt; Retire la piel por encima del centro del cráneo y cortó el cráneo con unas tijeras afiladas. </li><li> Insertar las tijeras en el punto donde la médula espinal entra en el cerebro (foramen magnum) y hacer dos cortes laterales. </li><li> Desde el mismo punto, hacer un corte sagital de largo a lo largo de la sutura sagital. Al alcanzar el bulbo olfatorio, clip hacia la izquierda y hacia la derecha. </li><li> Con unas pinzas, quite cuidadosamente el cráneo, agarrando cada mitad del cráneo con firmeza y tirando hacia un lado, teniendo cuidado de no presionar sobre o dañar el cerebro. </li><li> Retire el cerebro, mientras que la ruptura de los nervios craneales utilizando un micro espátula cuchara invertida. </li></ol></li><li> Coloque el cerebro en una solución ACSF helada durante 1-2 minutos para enfriar y endurecer. </li><li> Eliminar cerebro desde el ACSF, Wick exceso de líquido con una toalla de papel, crear un corte coronal entre el cerebelo y el resto del cerebro y pegar el cerebro, con la parte rostral hacia arriba, en el escenario vibratome. </li><li> Cortar el NAc: <ol&gt; <li> Mantener soluciones ACSF a temperaturas heladas en la cámara de corte del vibratome. Sección a 200 micras hasta que el núcleo accumbens (NAC) se identifica claramente de acuerdo con la Paxinos y Franklin cerebro de ratón Atlas (aproximadamente 1,8 mm anterior al bregma; prestar atención a la forma del cuerpo calloso, la ubicación y la forma de la comisura anterior y los ventrículos, así como la morfología general de la sección de cerebro). En este punto, crear dos secciones 400 micras, de las cuales se diseccionó el NAc. </li><li> Bajo un estereoscopio, utilice una fina lámina de diseccionar la zona NAc fuera de las rodajas. La definición de la NAC es de acuerdo con el atlas del cerebro del ratón Paxinos y Franklin, y convenientemente puede ser diseccionado en las secciones apropiadas por cuatro pases rápidos de la cuchilla en el tejido. (Figura 2). </li><li> Coloque las secciones NAC inmediatamente en 900 l Trizol reactivo de lisis en un tubo de microcentrífuga y almacenar a -80 ° C hasta el ARN extracción. </li></ol></li></ol> Transcripción 5. Extracción de ARN y ADNc inversa <ol><li> Descongelar los tubos que contienen núcleo accumbens secciones en Trizol reactivo de lisis a temperatura ambiente y homogeneizar el lisado con una jeringa de 1 ml conectada a la aguja 25 G hasta que el tejido es totalmente homogeneizada (por lo menos 15-20 veces). Las primeras rondas son difíciles, y requieren empujar el tejido contra la pared del tubo con el fin de romper en pedazos pequeños que podrían entrar en la punta de la aguja. </li><li> Para asegurar la homogeneización, pipetear el lisado en una columna de centrifugación QIAshredder Mini y centrifugar a 12.000 xg durante 1 min. </li><li> Pipetear el lisado en un nuevo tubo de microcentrífuga y extraer el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Guarde el ARN a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Medir la concentración de ARN, analizar la integridad y la calidad mediante un Bioanalyzer o equipo equivalente. Utilice 100-500 ng de ARN para cada ronda de preparación de ADNc con rcebadores hexámeros Andom. </li></ol> 6. Diseño Primer y Pruebas Primer <ol><li> Elegir buenos cebadores: Para un par de cebadores óptimo para qPCR de transcripciones de ARNm, siga estos requerimientos (Figura 3): <ol><li> Cebadores de diseño ya no contienen de 17-28 bases. Evitar repeticiones de nucleótidos ya que promueven mispriming. </li><li> Cebadores de diseño con la temperatura de fusión (T m) entre 56-68 ° C (óptima 60-64 ° C). El T m dentro de la pareja de cebadores debe estar dentro de 1 ° C de la otra. </li><li> Tenga en cuenta que el tamaño del producto debe ser idealmente entre 80 y 150 pb. </li><li> Asegúrese de que al menos uno de los cebadores cubre una unión exón-exón, o el amplicón contiene un gran intrón (intrón-que abarca), para evitar la amplificación de contaminantes de ADN genómico. </li><li> Utilice un software fiable basado en Primer3 (para ejemplos véase el cuadro 2) con el fin de mejorar el diseño del cebador. </li></ol></li><li> Prueba de la prIMers: A fin de garantizar la especificidad y la eficiencia de los cebadores, una reacción de qPCR de control deben realizarse: <ol><li> Utilice una muestra positiva (que contiene cDNA plantilla para todos los pares de cebadores correspondientes) y valorar el ADNc (por ejemplo, ocho diluciones de tres veces a partir de una concentración inicial de ~ 10 ng) en reacciones paralelas duplicados. Incluir un control sin plantilla, que controla la contaminación dentro de las soluciones utilizadas para la reacción. </li><li> Calcular la eficiencia de imprimación mediante el uso de la fórmula: (10 (- 1 / pendiente) -1) × 100, de tal manera que la curva de la pendiente óptima es - 3.333 (es decir, 10 (- 1 / 3,333) = 2) (Figura 4). </li><li> Determinar la especificidad de la amplificación. Amplificación específica se demuestra por un único pico prominente común a todas las curvas de fusión de los productos amplificados, mientras que fuera del objetivo de amplificación aparecería como una desviación obvia from el pico individual grande. </li></ol></li></ol> 7. análisis qPCR <ol><li> Pre-amplificación: <ol><li> Análisis completo qPCR se basa en paralelo de consulta de limitar cantidades de ARN con un gran número de pares de cebadores. Por lo tanto, una etapa de pre-amplificación es esencial. En este paso, el ADNc se somete a 14-18 ciclos de pre-amplificación con una mezcla de todos los cebadores que se utilizarán para la consulta de la muestra en el futuro (hasta 800 pares de cebadores). </li><li> Diluir todos los cebadores en TE (bajo EDTA) a 50 m para Target Amplificación Específica (STA). </li><li> Piscina junto 1 ml de alícuotas de todo el primario 50 M establece para ser incluidos en la reacción de STA, de hasta 800 ensayos. </li><li> Preparar pre-mezcla y muestras para STA como se describe en la Tabla 3. Permitir para el error mediante la preparación de la mezcla para el 110% del número de muestras que deben ser amplificado. </li><li> Alícuota de 3,75 l STA pre-mezcla para cada muestra. Añadir 1,25 lde cDNA a cada uno. </li><li> Vortex para mezclar las reacciones y centrifugar durante 10 seg. </li><li> Colocar las reacciones STA en un ciclador térmico y el ciclo como se indica en la Tabla 4. </li></ol></li><li> Exonucleasa I (ExoI) de tratamiento: <ol><li> Diluir la Exo I como se indica en la Tabla 5. </li><li> Añadir 2 l de ExoI diluido (4 U / l) a cada reacción STA 5 l, vórtice, girar hacia abajo (&gt; 6.000 xg), y meterlo en un termociclador a 37 ° C durante 30 min y luego a 80 ° C durante 15 min. </li><li> Diluir los productos finales a una concentración apropiada para la prueba. Uso TE Buffer (añadir 43 l de tampón TE a la muestra TSA 7 l). </li><li> Almacene los productos STA diluidas a -20 ° C o utilizar de inmediato. </li></ol></li><li> Primer y configuración de ejemplo para qPCR: <ol><li> Preparar muestras como se muestra en la Tabla 6. Preparar la mezcla de acuerdo con el chip elegido para el experimento, y añadir muestras según sea apropiado. </li><li> Agilitar las soluciones Mezclar la muestra durante un mínimo de 20 segundos y centrifugar (&gt; 6.000 xg) durante al menos 30 seg. Reacciones preparados pueden almacenarse durante duraciones cortas a 4 ° C hasta que el chip está listo para la carga. </li><li> Preparar los ensayos tal como se describe en la Tabla 7. </li><li> Agite la mezcla de ensayo durante un mínimo de 20 segundos y centrifugar (&gt; 6.000 xg) durante al menos 30 segundos de girar todos los componentes. IMPORTANTE: Vortex y centrifugar a fondo todas las soluciones de muestras y ensayos antes de pipetear en las entradas de chips. El no hacerlo puede dar lugar a una disminución de la calidad de los datos. NOTA: La concentración final de cada cebador es 5 M en la entrada y 500 nM en la reacción final. </li></ol></li><li> Cebado y carga de la matriz dinámica IFC (circuito de fluido integrado) chip. El chip IFC tiene entradas para muestras y ensayos, así como entradas especificadas (acumuladores) para fluido de la línea de control (aceite mineral) que se utiliza para presurizar las cámaras de microfluidos (Figure 4A). <ol><li> Inyectar fluido línea de control en cada acumulador en el chip. </li><li> Retire y deseche la película protectora azul de la parte inferior de la ficha. </li><li> Coloque el chip en el controlador apropiado IFC (controlador MX para el 48,48 IFC matriz dinámica o la HX controlador de la CFI para la 96.96 matriz dinámica IFC), a continuación, ejecute la secuencia de comandos Prime (113x) para el 48,48 IFC matriz dinámica o el Prime (136x) guión de la 96.96 matriz dinámica IFC con el fin de preparar el chip. </li><li> Cuando el script haya finalizado, retire el chip imprimada desde el controlador de la CFI. </li><li> Pipetear 5 l de cada mezcla de ensayo y 5 l de cada Sample Mix en sus entradas. </li><li> Devuelva el chip para el controlador de la CFI. </li><li> Utilizando el software de controlador de la CFI, ejecutar la carga Mix (113x) guión para el 48,48 matriz dinámica IFC) o Cargar Mix (136x) guión para el 96.96 matriz dinámica IFC para cargar las muestras y los ensayos en el chip. Cuando el guión Mix carga ha terminado, quite la cargachip de ed desde el controlador de la CFI. </li><li> Cargue el chip en el termociclador, crear una nueva ejecución de chip (de acuerdo con las instrucciones del fabricante), incluyendo análisis de la curva de fusión. Usando el software termociclador, asegúrese de que las cámaras de reacción se reconocen correctamente, y permiten que la reacción se ejecute por completo. </li></ol></li></ol> Análisis de datos 8. <ol><li> Aseguramiento de la calidad: Con el fin de garantizar la calidad de los datos, verificar la calidad de los cebadores al abordar curvas de dilución (como se describió anteriormente). Monitor de la especificidad de la amplificación mediante la visualización de las curvas de fusión de los amplificados, los picos de los cuales deben estar bien alineados de forma óptima 29. </li><li> Visualización: Para la visualización de grandes cantidades de datos obtenidos por el alto rendimiento de qPCR, el uso de software generó mapas de calor, en el que la expresión es un código de color por intensidad. Además, mostrar la dinámica de la transcripción de los genes individuales como diagramas de dispersión alineados. </li><li> Publicación: En la publicaciónlos resultados de la expresión génica, se aconseja seguir las Directrices para la publicación de MIQE cuantitativos en tiempo real información experimentos de PCR, que detalla la información mínima que debe ser informada para un experimento de qPCR para asegurar su pertinencia, precisión, interpretación correcta, y la reproducibilidad. </li></ol>

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	<li>Amit, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+module+of+negative+feedback+regulators+defines+growth+factor+signaling.">A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling.</a> Nature genetics. 39, 503-512 (2007).</li><li>Citri, A., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF-ERBB+signalling:+towards+the+systems+level.">EGF-ERBB signalling: towards the systems level.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>Kleim, J. A., Jones, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+experience-dependent+neural+plasticity:+implications+for+rehabilitation+after+brain+damage.">Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage.</a> Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).</li><li>Kauer, J. A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+and+addiction.">Synaptic plasticity and addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).</li><li>Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+synaptic+plasticity+and+striatal+circuit+function+in+addiction.">Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).</li><li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse.">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).</li><li>Koob, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiological+mechanisms+in+the+transition+from+drug+use+to+drug+dependence.">Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence.</a> Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+addiction:+the+role+of+reward-related+learning+and+memory.">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).</li><li>Beurrier, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+inhibition+of+synaptic+transmission+by+dopamine+in+the+nucleus+accumbens+during+behavioral+sensitization+to+cocaine.">Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine.</a> The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).</li><li>Robinson, T. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psychology+and+neurobiology+of+addiction:+an+incentive-sensitization+view.">The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view.</a> Addiction. 95, S91-S117 (2000).</li><li>Boening, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+an+addiction+memory.">Neurobiology of an addiction memory.</a> Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).</li><li>Everitt, B. J., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+systems+of+reinforcement+for+drug+addiction:+from+actions+to+habits+to+compulsion.">Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).</li><li>Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addicted+human+brain:+insights+from+imaging+studies.">The addicted human brain: insights from imaging studies.</a> The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).</li><li>Carlezon, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cocaine+reward+by+CREB.">Regulation of cocaine reward by CREB.</a> Science. 282, 2272-2275 (1998).</li><li>Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+immediate+early+gene+expression+and+AP-1+binding+in+the+rat+nucleus+accumbens+by+chronic+cocaine.">Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).</li><li>Hope, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+long-lasting+AP-1+complex+composed+of+altered+Fos-like+proteins+in+brain+by+chronic+cocaine+and+other+chronic+treatments.">Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments.</a> Neuron. 13, 1235-1244 (1994).</li><li>Pulipparacharuvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine+regulates+MEF2+to+control+synaptic+and+behavioral+plasticity.">Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity.</a> Neuron. 59, 621-633 (2008).</li><li>Robison, A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+epigenetic+mechanisms+of+addiction.">Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addiction+and+the+brain:+the+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence.">Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).</li><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurobiology+of+cocaine+addiction.+Science+&amp;+practice+perspectives+/+a+publication+of+the.">The neurobiology of cocaine addiction. Science &amp; practice perspectives / a publication of the.</a> National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).</li><li>Robbins, T. W., Everitt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobehavioural+mechanisms+of+reward+and+motivation.">Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation.</a> Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).</li><li>Kaplan, G. B., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cognitive+enhancers+in+animal+models+of+fear+extinction.">The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction.</a> Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).</li><li>Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+on+the+incubation+of+cocaine+craving.">Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving.</a> Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).</li><li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+environments,+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system.">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li><li>Silingardi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+pathway+activation+bidirectionally+affects+visual+recognition+memory+and+synaptic+plasticity+in+the+perirhinal+cortex.">ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex.</a> Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84 (2011).</li><li>Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+synapses+in+vivo+correlate+with+functional+changes+during+experience-dependent+plasticity+in+visual+cortex.">Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex.</a> The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).</li><li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+wanting:+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior.">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li><li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells.">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Caracterización acertada de la expresión génica a partir de tejido cerebral después de paradigmas de comportamiento depende de: 1) El manejo cuidadoso de los ratones durante el paradigma de comportamiento; 2) la disección rápida y precisa de tejido de interés; 3) medidas de ARN de seguridad para garantizar la integridad de ARN; y 4) La planificación cuidadosa de los cebadores y el diseño experimental, así como la precisión y la atención al detalle en la preparación para el análisis qPCR. <p class="jove...

Organización dinámica del cerebro permite la flexibilidad cognitiva y conductual. Experiencias se codifican a través de modificaciones de la estructura y la fuerza de las conexiones entre las neuronas en el cerebro 3. Esta &quot;plasticidad dependiente de la experiencia&quot; es el resultado de la inducción de patrones específicos de expresión genética que proporciona las proteínas necesarias para la modificación de la estructura y la fuerza sináptica 4. La identificación de las redes reguladoras de genes mediar en la formación de recuerdos a largo plazo es un principio central de la neurociencia molecular, con la expectativa de que la identificación de los elementos dominantes de programas transcripcionales proporcionará información sobre los principios fundamentales que regulan la formación de la memoria, así como los objetivos de tratamiento de trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos. Programas transcripcionales se desarrollan en ondas definidas temporalmente-, cada uno de los cuales codifica genes de distinto carácter, que son importantes para el detapas ifferent en la aplicación de los resultados del evento de señalización 1,2. Por tanto, es importante para hacer frente a la dinámica de la transcripción en una escala de tiempo temporal detallada, a fin de identificar el complemento completo de genes inducidos, y obtener una perspectiva de su función potencial de acuerdo con la dinámica de su inducción. La drogadicción es una forma sólida de experiencia plasticidad dependiente causada por los efectos a largo plazo de las drogas de abuso en los circuitos neuronales en el cerebro 5,6. , La exposición aguda inicial a las drogas puede conducir al desarrollo de la adicción y la transición hacia el uso crónico. La información contextual es un elemento crucial en el desarrollo de la adicción. Señales ambientales fármacos relacionados se asignan gran importancia en la mente de los consumidores de drogas. La información contextual recordando a un adicto a las drogas de la experiencia drogas en el pasado puede inducir la recaída en el deseo de droga, incluso después de largos periodos de abstinencia de la exposición al fármaco 7,8.De ahí el gran reto clínico en la adicción - la propensión de los adictos a la recaída, incluso mucho tiempo después de los síntomas de abstinencia han disminuido 9. Comportamiento de sensibilización a la cocaína es un modelo simple de la experiencia de cocaína útiles en el estudio de los mecanismos de adicción a las drogas. En este modelo ampliamente estudiado para la sensibilización de larga duración inducida por la exposición crónica a drogas de abuso, los roedores son primero habituaron a inyecciones de solución salina (intraperitoneal, IP) en un nuevo entorno (una cámara de campo abierto en el que se controla su actividad locomotora) ; entonces, que reciben inyecciones diarias de cocaína en las cámaras de campo abierto, mientras que su actividad es monitoreada 10 (Figura 1). Este paradigma de comportamiento típicamente resulta en una sensibilización robusta de comportamiento locomotor (8-12 veces por encima de la actividad de línea de base) 11, que se mantiene durante un período de meses tras el cese de las inyecciones de cocaína, lo que demuestra la formación de un pervhuella de la memoria ASIVE de experiencia de la droga. Los circuitos neuronales de la recompensa, que participan de forma natural en reforzar las conductas esenciales para el éxito de una especie (por ejemplo, la alimentación, el sexo), es explotado por las drogas de abuso para reforzar los comportamientos asociados con la droga 12,13. Los mecanismos moleculares y celulares por el cual la experiencia de las drogas de abuso se mejora parecen ser similares a los mecanismos que subyacen a la formación de la memoria declarativa o semánticas en otras estructuras cerebrales 14. Por lo tanto, la robustez del modelo de sensibilización de comportamiento hace que sea un sistema de modelo atractivo para estudiar los mecanismos de la plasticidad dependiente de la experiencia. El núcleo accumbens (NAC) es un integrador central del circuito de recompensa del cerebro, y ha sido ampliamente asociado con el desarrollo de la adicción a 5,6. La formación de la adicción depende de la transcripción de nuevas proteínas en el núcleo accumbens, y robusto enproducción de programas de transcripción claramente estructurados se observa en el NAc siguiente experiencia cocaína 15-19. La respuesta transcripcional aguda de exposición a la cocaína es probable que funcione a múltiples niveles con el fin de adaptarse al fuerte estímulo de inducción y para dirigir la producción de nuevas proteínas que son responsables de los cambios estructurales y electrofisiológicos inducidos por la exposición a la droga 6,19-22. Con el fin de promover el estudio de los mecanismos moleculares de la plasticidad dependiente de la experiencia en el cerebro, un protocolo se describe para el análisis completo de la dinámica de transcripción en las muestras de tejido cerebral después de la manipulación del comportamiento. El protocolo se ilustra en el contexto de la experiencia de comportamiento estudiados en el laboratorio Citri - la sensibilización de comportamiento a la cocaína, la utilización de matrices dinámicas de microfluidos para el análisis transcripcional. El protocolo descrito obviamente no se limita a estudiar tque el núcleo accumbens en el contexto de la sensibilización de comportamiento, pero podría aplicarse a un gran número de paradigmas de comportamiento y regiones del cerebro. De hecho, este protocolo se podría aplicar a los tejidos del cuerpo fuera del cerebro, y una variedad de experiencias o manipulaciones del organismo estudiado. El protocolo se divide a grandes rasgos en cuatro pasos. En el primer paso, el animal se somete al paradigma de comportamiento; en la segunda etapa el tejido es microdissected; en la tercera etapa - ARNm se purifica, inverso-transcrito y sondeó, y en la etapa final se analizan los datos. En el contexto del estudio de la dinámica de la transcripción, el momento preciso y la definición de la experiencia son probablemente los parámetros experimentales más importantes a controlar. Por esta razón, nuestro modelo de comportamiento de elección es el de la sensibilización de comportamiento a la cocaína, un sistema que permite alto nivel de control del experimentador sobre los parámetros de la experience. Paradigmas de comportamiento adicionales que permiten la sincronización exacta y abordan diferentes modelos de experiencia-dependiente de la plasticidad o formación de la memoria están disponibles. Estos modelos incluyen el condicionamiento del miedo 23, enriquecimiento ambiental aguda 24,25, novela objeto de exploración 26 y la experiencia visual después de la cría de oscuridad 27. Aún así, la sensibilización conductual a la cocaína es una manipulación del comportamiento sólido y coherente, creando un rastro de memoria altamente generalizado que dura meses siguientes experiencia cocaína 28. El cerebro se secciona, seguido por microdisección manual de los núcleo accumbens. Ha sido nuestra experiencia que microdisección manual desde cortes de cerebro preparadas rápidamente proporciona el método más fiable y rápida de extraer el tejido correspondiente al paradigma de comportamiento, y con la experiencia, los límites del tejido hecho evidente y fácilmente reconocido. Alternativamente, rebanadas finas podrían ser prepared, seguido por láser de microdisección de captura. Aunque este método permite altamente definida la delimitación de la zona de interés, es lento (arriesgando así la pérdida de mRNA lábil), tedioso y requiere equipo especializado costoso (un microscopio equipado con una configuración de láser captura). El protocolo definido en este documento también podría ser adaptado para el análisis transcripcional de una sola célula, por aspiración manual de citoplasma de las células identificadas visualmente utilizando pipetas de parche 29. Es importante señalar que el protocolo descrito proporciona un promedio de la población, mientras que es muy probable que en la mayoría de los casos, sólo una subpoblación de las células dentro del tejido son en realidad implicado en la respuesta a la experiencia. Es de interés para el perfil de transcripción de una manera selectiva desde dentro de las poblaciones de células específicas que responden a la experiencia, pero la discusión de estos enfoques está más allá del ámbito actual. Para la purificación de ARNm, transcripción inversa y qPCR consulta, el tejidose interrumpe al pasarla a través de agujas finas, seguido de la utilización de los kits disponibles en el mercado (para más información, véase el Cuadro 8). La elección es informado por la experiencia con estas metodologías, que aseguran la extracción fiable de ARN de alta calidad y resultados sólidos de las aplicaciones posteriores. Mientras que el protocolo se describe para alto rendimiento qPCR utilizando matrices dinámicas, las muestras pueden probaron para la expresión génica usando PCR de punto final, de bajo rendimiento qPCR, microarrays de expresión de genes o la secuenciación de profundidad. La preferencia por qPCR de alto rendimiento utilizando matrices dinámicas es debido al hecho de que el ARNm obtenido a partir de núcleos cerebrales después de paradigmas de comportamiento es a menudo de cantidades limitantes. Las matrices dinámicas proporcionan una plataforma que permite el análisis global eficiente de las transcripciones de un gran número de muestras paralelas en un solo experimento. Después de la adquisición inicial del sistema de microfluidos (comúnmente un pu institucionalrchase), los experimentos son relativamente baratos para funcionar. A raíz de este análisis, además de consulta de las muestras se puede realizar utilizando las plataformas más costosas para buscar nuevas transcripciones (por microarrays o RNAseq) con las matrices dinámicas que proporciona una referencia completa para el aseguramiento de la calidad. Finalmente, para el análisis de datos, se utilizan enfoques estándar. Punteros específicos relativos a cuestiones que puedan surgir serán discutidos en el texto del protocolo. Este protocolo es el más apropiado para los investigadores interesados ​​en una investigación a fondo de su sistema de interés, el estudio de múltiples condiciones y repeticiones. El protocolo también es la más adecuada para los investigadores que ya han perfeccionado en (a través de microarrays o RNAseq experimentos) en un subgrupo de 50 a 500 genes de interés, que están interesados ​​en la consulta de forma repetida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="453">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Virusol</td>
			<td>Oriek Medical</td>
			<td>J29D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP 100%</td>
			<td>MINRAD INC</td>
			<td>NDC 60307-110-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy plus Universal Mini Kit</td>
			<td>QIAGENE</td>
			<td>73404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>QIAGENE</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>AB-4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>1355656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm)</td>
			<td>Self assembled</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inner Perspex box (30X30cm)</td>
			<td>Self assembled</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera and video recorder</td>
			<td>Campden Inst</td>
			<td>CMD-80051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Recorder software</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>NDS-NMR3-00M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>FST-14062-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagital Brain slicer with a 0.5mm section</td>
			<td>Brain Tree Scientific</td>
			<td>BS-AL-505S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>The Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microspun spatula</td>
			<td>Bochem Instrument GmbH</td>
			<td>3213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomark HD Reader</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMHD-BMKHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic array Chip for 96.96gene expression</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive analysis of transcription dynamics from brain samples following behavioral experience

La codificación de las experiencias en el cerebro y la consolidación de la memoria a largo plazo dependen de la transcripción de genes. La identificación de la función de genes específicos en la experiencia de codificación es uno de los principales objetivos de la neurociencia molecular. Por otra parte, la asociación funcional de genes definidos con conductas específicas tiene implicaciones para la comprensión de la base de los trastornos neuropsiquiátricos. Inducción de programas de transcripción robustos se ha observado en los cerebros de los ratones después de varias manipulaciones de comportamiento. Mientras que algunos elementos genéticos se utilizan recurrentemente siguiendo diferentes manipulaciones de comportamiento y en diferentes núcleos cerebrales, los programas transcripcionales son en general única a los estímulos que inducen la estructura y en el que se estudiaron 1,2. En esta publicación, se describe un protocolo para sólida y completa el perfil transcripcional de los núcleos cerebrales de ratones en respuesta a la manipulación del comportamiento. Elprotocolo se demuestra en el contexto del análisis de la dinámica de la expresión de genes en el núcleo accumbens siguiente experiencia aguda de cocaína. Con posterioridad a un definido en la experiencia vivo, el tejido neural objetivo se diseca; seguido por la purificación del ARN, transcripción inversa y la utilización de matrices de microfluidos para el análisis de qPCR integral de múltiples genes diana. Este protocolo está orientado a análisis exhaustivo (direccionamiento 50-500 genes) de limitar las cantidades de material de partida, tales como muestras de cerebro pequeñas o incluso células individuales. El protocolo es más ventajosa para el análisis paralelo de múltiples muestras (por ejemplo, células individuales, análisis dinámico siguiente farmacéutica, viral o perturbaciones de comportamiento). Sin embargo, el protocolo también podría servir para la caracterización y control de calidad de las muestras antes de los estudios de todo el genoma de microarrays o RNAseq, así como la validación de los datos obtenidos a partir de estudios de todo el genoma.

La calidad de los resultados obtenidos mediante la aplicación de este protocolo depende de manera crucial de una serie de parámetros. Planificación experimental adecuado resultará en una mínima perturbación a los ratones experimentales, de tal manera que la experiencia probada (en este ejemplo, el de la exposición a la cocaína) será la experiencia más dominante en su historia reciente, y por lo tanto resultará en una transcripción robusta y específica programa. Figura 1 describe el plan exp...

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Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Análisis Integral de Transcripción Dinámica del cerebro muestras Siguiendo Experiencia del Comportamiento

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

comprehensive-analysis-transcription-dynamics-from-brain-samples

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Behavior

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Motivation and Emotion

SCIENTISTS IN ACTION

11.5K vistas.  The Hebrew University of Jerusalem. This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays. 

Video: Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Investigación

Comportamiento

Compensatory Limb Use and Behavioral Assessment of Motor Skill Learning Following Sensorimotor Cortex Injury in a Mouse Model of Ischemic Stroke

Mouse models have become increasingly popular in the field of behavioral neuroscience, and specifically in studies of experimental stroke. As models advance, it is important to develop sensitive behavioral measures specific to the mouse. The present protocol describes a skilled motor task for use in mouse models of stroke. The Pasta Matrix Reaching Task functions as a versatile and sensitive behavioral assay that permits experimenters to collect accurate outcome data and manipulate limb use to mimic human clinical phenomena including compensatory strategies (i.e., learned non-use) and focused rehabilitative training. When combined with neuroanatomical tools, this task also permits researchers to explore the mechanisms that support behavioral recovery of function (or lack thereof) following stroke. The task is both simple and affordable to set up and conduct, offering a variety of training and testing options for numerous research questions concerning functional outcome following injury. Though the task has been applied to mouse models of stroke, it may also be beneficial in studies of functional outcome in other upper extremity injury models.

Mouse models have become increasingly popular in studies of behavioral neuroscience. As models advance, it is important to develop sensitive behavioral measures specific to the mouse. This protocol describes the Pasta Matrix Reaching Task, which is a skilled motor task for use in mouse models of stroke.

Compensatoria Limb Uso y Evaluación del Comportamiento de Aprendizaje de habilidad motora después de Lesiones de la corteza sensoriomotora en un modelo de ratón del ictus isquémico

Mouse models have become increasingly popular in the field of behavioral neuroscience, and specifically in studies of experimental stroke. As models ...

Transcranial Magnetic Stimulation for Investigating Causal Brain-behavioral Relationships and their Time Course

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a safe, non-invasive brain stimulation technique that uses a strong electromagnet in order to temporarily disrupt information processing in a brain region, generating a short-lived &#8220;virtual lesion.&#8221; Stimulation that interferes with task performance indicates that the affected brain region is necessary to perform the task normally. In other words, unlike neuroimaging methods such as functional magnetic resonance imaging (fMRI) that indicate correlations between brain and behavior, TMS can be used to demonstrate causal brain-behavior relations. Furthermore, by varying the duration and onset of the virtual lesion, TMS can also reveal the time course of normal processing. As a result, TMS has become an important tool in cognitive neuroscience. Advantages of the technique over lesion-deficit studies include better spatial-temporal precision of the disruption effect, the ability to use participants as their own control subjects, and the accessibility of participants. Limitations include concurrent auditory and somatosensory stimulation that may influence task performance, limited access to structures more than a few centimeters from the surface of the scalp, and the relatively large space of free parameters that need to be optimized in order for the experiment to work. Experimental designs that give careful consideration to appropriate control conditions help to address these concerns. This article illustrates these issues with TMS results that investigate the spatial and temporal contributions of the left supramarginal gyrus (SMG) to reading.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a technique for non-invasively disrupting neural information processing and measuring its effect on behavior. When TMS interferes with a task, it indicates that the stimulated brain region is necessary for normal task performance, allowing one to systematically relate brain regions to cognitive functions.

Estimulación magnética transcraneal para Investigar las relaciones causales Brain-conductuales y su Curso de Tiempo

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a safe, non-invasive brain stimulation technique that uses a strong electromagnet in order to temporarily ...

Combined Shuttle-Box Training with Electrophysiological Cortex Recording and Stimulation as a Tool to Study Perception and Learning

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the necessary equipment is now available by several commercial companies. This protocol provides a detailed description of a two-way shuttle-box avoidance learning paradigm in rodents (here Mongolian gerbils; Meriones unguiculatus) in combination with site-specific electrical intracortical microstimulation (ICMS) and simultaneous chronical electrophysiological in vivo recordings. The detailed protocol is applicable to study multiple aspects of learning behavior and perception in different rodent species.
Site-specific ICMS of auditory cortical circuits as conditioned stimuli here is used as a tool to test the perceptual relevance of specific afferent, efferent and intracortical connections. Distinct activation patterns can be evoked by using different stimulation electrode arrays for local, layer-dependent ICMS or distant ICMS sites. Utilizing behavioral signal detection analysis it can be determined which stimulation strategy is most effective for eliciting a behaviorally detectable and salient signal. Further, parallel multichannel-recordings using different electrode designs (surface electrodes, depth electrodes, etc.) allow for investigating neuronal observables over the time course of such learning processes. It will be discussed how changes of the behavioral design can increase the cognitive complexity (e.g. detection, discrimination, reversal learning).

Shuttle-box avoidance learning is well-established in behavioral neuroscience. This protocol describes how shuttle-box learning in rodents can be combined with site-specific electrical intracortical microstimulation (ICMS) and simultaneous chronical in vivo recordings as a tool to study multiple aspects of learning and perception.

Combinado de traslado-Box Entrenamiento con electrofisiológico corteza Grabación y estimulación como una herramienta para estudiar la percepción y aprendizaje

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Roedor cerebro microinyección para el Estudio de los sustratos moleculares de Comportamiento Motivado

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

La estimulación del nervio vago como una herramienta para inducir plasticidad en vías pertinentes para el Aprendizaje Extinción

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Assessing Working Memory in Children: The Comprehensive Assessment Battery for Children &#8211; Working Memory (CABC-WM)

The Comprehensive Assessment Battery for Children - Working Memory (CABC-WM) is a computer-based battery designed to assess different components of working memory in young school-age children. Working memory deficits have been identified in children with language-based learning disabilities, including dyslexia1,2 and language impairment3,4, but it is not clear whether these children exhibit deficits in subcomponents of working memory, such as visuospatial or phonological working memory. The CABC-WM is administered on a desktop computer with a touchscreen interface and was specifically developed to be engaging and motivating for children. Although the long-term goal of the CABC-WM is to provide individualized working memory profiles in children, the present study focuses on the initial success and utility of the CABC-WM for measuring central executive, visuospatial, phonological loop, and binding constructs in children with typical development. Immediate next steps are to administer the CABC-WM to children with specific language impairment, dyslexia, and comorbid specific language impairment and dyslexia.

Assessing Working Memory in Children: The Comprehensive Assessment Battery for Children &amp;#8211; Working Memory (CABC-WM)

Working memory predicts a significant amount of variance for a variety of cognitive tasks, including speaking, reading, and writing. However, few tools are available to assess working memory in children. We present an innovative, computer-based battery that comprehensively assesses different components of working memory in school-age children.

Evaluación de la Memoria de Trabajo en Niños: La Evaluación Integral de la Batería para Niños - Memoria de Trabajo (CABC-WM)

The Comprehensive Assessment Battery for Children - Working Memory (CABC-WM) is a computer-based battery designed to assess different components of ...

Detecting Behavioral Deficits in Rats After Traumatic Brain Injury

With the increasing incidence of traumatic brain injury (TBI) in both civilian and military populations, TBI is now considered a chronic disease; however, few studies have investigated the long-term effects of injury in rodent models of TBI. Shown here are behavioral measures that are well-established in TBI research for times early after injury, such as two weeks, until two months. Some of these methods have previously been used at later times after injury, up to one year, but by very few laboratories. The methods demonstrated here are a short neurological assessment to test reflexes, a Beam-Balance to test balance, a Beam-Walk to test balance and motor coordination, and a working memory version of the Morris water maze that can be sensitive to deficits in reference memory. Male rats were handled and pre-trained to neurological, balance, and motor coordination tests prior to receiving parasagittal fluid percussion injury (FPI) or sham injury. Rats can be tested on the short neurological assessment (neuroscore), the beam-balance, and the Beam-Walk multiple times, while testing on the water maze can only be done once. This difference is because rats can remember the task, thus confounding the results if repeated testing is attempted in the same animal. When testing from one to three days after injury, significant differences are detected in all three non-cognitive tasks. However, differences in the Beam-Walk task were not detectable at later time points (after 3 months). Deficits were detected at 3 months in the Beam-Balance and at 6 months in the neuroscore. Deficits in working memory were detected out to 12 months after injury, and a deficit in a reference memory first appeared at 12 months. Thus, standard behavioral tests can be useful measures of persistent behavioral deficits after FPI.

The goal of the behavioral tests presented here is to detect functional deficits in rats after traumatic brain injury. Four specific tests are presented that detect deficits in behaviors to reflect the damage to specific brain areas at times extending to one year after injury.

Detección de déficits conductuales en ratas después de la lesión cerebral traumática

With the increasing incidence of traumatic brain injury (TBI) in both civilian and military populations, TBI is now considered a chronic disease; however, ...

An Automated T-maze Based Apparatus and Protocol for Analyzing Delay- and Effort-based Decision Making in  Free Moving Rodents

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper understanding of the neurobiological causes underlying the decision-making problems. A cost-benefit based T-maze task is used for measuring decision making in which rodents choose between a high reward arm (HRA) and a low reward arm (LRA). There are two paradigms of the T-maze decision-making task, one in which the cost is a time delay and the other in which it is physical effort. Both paradigms require a tedious and labor-intensive management of experimental animals, multiple doors, pellet reward, and arm choice recordings. In the current work, we invented an apparatus based on traditional T-maze with full automation for pellet delivery, door management and choice recordings. This automated setup can be used for the evaluation of both delay- and effort-based decision making in rodents. With the protocol described here, our lab investigated the decision-making phenotypes of multiple genetically modified mice. In the representative data, we showed that the mice with ablated medial habenular showed aversions of both delay and effort and tended to choose the immediate and effortless reward. This protocol helps to decrease the variability caused by experimenter intervention and to enhance experiment efficiency. In addition, chronic silicon probe or microelectrode recording, fiber-optic imaging and/or manipulation of neural activity can be easily applied during the decision-making task using the setup described here.

This article introduces an automated T-maze apparatus that we invented, and a protocol based on this apparatus for analyzing delay-based decision making and effort-based decision making in free moving rodents.

Un T-laberinto automatizado basado en aparato y protocolo para el análisis de decisiones basado en el retraso y el esfuerzo en roedores en movimiento gratis

Many neurological and psychiatric patients demonstrate difficulties and/or deficits in decision making. Rodent models are helpful to produce a deeper ...

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive decline, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), have become a promising tool to elucidate the underlying mechanisms and promote the therapeutic advances. An important step is the validation and characterization of expected behavioral abnormality in the models, in the case of AD, cognitive decline. The long-term behavioral investigations of laboratory animals to study the effect of aging demand substantial efforts from researchers. The IntelliCage system is a high-throughput and cost-effective test battery for mice that eliminates the need for daily human handling. Here, we describe how the system is utilized in the long-term phenotyping of a genetic Alzheimer&#39;s disease model, specifically focusing on the cognitive functions. The experiment employs repeated battery of tests that assess spatial learning and executive functions. This cost-effective age-dependent phenotyping allows us to identify the transient and/or permanent effects of genes on various cognitive aspects.

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer&#039;s Disease, Using IntelliCage

This paper describes a protocol for cognitive assessments for genetic models of the Alzheimer&#39;s disease using the IntelliCage system, which is a high throughput automated behavioral monitoring system with operant conditioning.

Automatizado, ensayo conductual a largo plazo para las funciones cognitivas en múltiples modelos genéticos de la enfermedad de Alzheimer, utilizando IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive ...