Este trabajo fue financiado por el Instituto Max Planck de Psiquiatría y Marie de la Unión Europea Red de Curie de Formación Inicial (Contrato NINA 238 665).

1. Programación por la adversidad temprana de la vida Separación de la madre (EM) se lleva a cabo para inducir primeros años de vida el estrés (ELS) en las crías entregadas por los ratones C57BL/6N cronometrada embarazadas (después del día 0 (P0) en el día de nacimiento). <ol><li> Camadas individuales están colocados en jaulas limpias (con almohadilla térmica) durante 3 horas todos los días de P1-10. </li><li> Control (no-ELS), las crías permanecen inalteradas en el nido materno en todas partes. </li><li> Los cachorros se mantienen con sus madres hasta el destete (P21) después de lo cual se encuentra en grupos emparejados por sexo (3-5 ratones por jaula) en condiciones estándar de laboratorio de alojamiento de animales. </li></ol> 2. El aislamiento y la disección del tejido cerebral <ol><li> Los ratones mueren a edades más deseados por la dislocación del cuello uterino Nota:. Ya que este protocolo implica un paradigma de estrés, sin anestesia se administra antes de la dislocación cervical, para evitar interferir con la regulación fisiológica normal de las hormonas del estrés. Cráneos se abren ycerebros se retiran cuidadosamente e inmediatamente congelaron rápidamente por inmersión en hielo iso-pentano-seca, antes de ser almacenado a -80 ° C. </li><li> Los cerebros son cryosectioned (10 micras de espesor); secciones están montados sobre portaobjetos de vidrio Superfrost y se mantuvo a -20 ° C. La referencia a un estándar de ratón estereotáxica atlas (por ejemplo Paxinos 6) se utiliza para verificar la precisión anatómica y para garantizar la inclusión de la región de interés (por ejemplo, para las neuronas en el núcleo paraventricular - PVN - recoger las secciones que empiezan en el nivel de la rostral PVN, bregma -0,75 a -0,85). </li><li> Las secciones se tiñeron con violeta de cresilo para facilitar la identificación de las estructuras cerebrales diferentes. Punzones (0,8 mm) de las regiones de interés (por ejemplo NPV) se obtienen por microdisección en loco. </li></ol> 3. Extracción de ácidos nucleicos a partir de Golpes del cerebro Un protocolo optimizado para al mismo tiempo la extracción de ADN y el ARN de pequeño neuroanatómicamente definida registro cerebraliones para análisis de expresión génica y bisulfito se describe 7. Nota: Teniendo en cuenta que el ARN es menos estable que el ADN en el GTC-buffer, se recomienda el procesamiento del ARN en primer lugar. El homogeneizado utilizado para la purificación del ADN puede mantenerse a temperatura ambiente (TA) durante ese tiempo. <ol><li> Homogeneizar golpes utilizando una pipeta y vórtice en 400 l de tiocianato de guanidinio (GTC) tampón (4,5 M de tiocianato de guanidinio, 2% de N-lauroilsarcosina, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M de beta-mercaptoetanol, 0,2% antiespumante A) a temperatura ambiente, pasando varias veces a través de una jeringa hipodérmica (29G) (Figura 2). </li><li> Dividir lisado en partes iguales; tanto ARN y ADN puede ser extraído, al mismo tiempo o por separado, dependiendo de las necesidades particulares de experimentación. </li><li> Para la purificación del RNA añadir volumen 1/10 de NaOAc, 1 AquaPhenol volumen (Appligene) (pH 4) y el volumen 1/2 de cloroformo: isoamílico (24:1) para lisado. Vigorosamente en el vórtex después de cada paso yincubar en hielo durante 10 min, se centrifuga (20 min a 10.000 ga 4 ° C); añadir un volumen igual de 70% de EtOH a la fase aequous. </li><li> Transfiera la mezcla a una columna de giro de ARN (por ejemplo, Nucleospin II del RNA de Macherey-Nagel) y realizar los pasos en la columna DNasa digestión y lavado (seguir el protocolo del fabricante); eluyen RNA en 25 l de H 2 O. </li><li> Para la purificación del ADN de un protocolo optimizado de la Sangre Qiagen DNeasy Tissue Kit, y se utiliza. Equilibre el lisado con un volumen igual de tampón AL y 100% de EtOH, la carga en una centrífuga de columna de centrifugación (1 min a 10.000 g a temperatura ambiente) y deseche de flujo continuo. </li><li> Añadir 500 l tampón AW1 incluyendo 5 l RNasa (1 mg / ml) a la columna y se incuba 10 minutos a TA. Spin (1 min a 10.000 g, RT) y deseche de flujo continuo. </li><li> Lavar la columna con 500 l Buffer AW2, deseche el filtrado y centrifugado en seco columna vacía (1 min a 15.000 g). </li><li> Añadir precalentado (70 ° C) tampón AE y columnas incubar durante 10 min a 70 ° C. Eluir por centrifugación (1 minuto, 10.000 g), volver a aplicar el filtrado y repita el paso de la centrifugación. </li></ol> Utilizar un espectrofotómetro para determinar el ADN y las concentraciones de ARN. Un típico PVN punzón rendimientos ~ 600 ng de ADN y ARN ~ 400 ng. Para el análisis de la expresión de genes por PCR cuantitativa (qPCR), que suelen utilizar ~ 100 ng de ARN en la reacción de transcripción inversa. 4. Bisulfito de conversión Bisulfito de sodio se utiliza para convertir a los no metilados de citosinas uracilos. En contraste, citosinas metiladas están protegidos de la conversión. Por lo tanto, todas las citosinas que se detectan en la secuenciación final del bisulfito PCR amplicón representan citosinas metiladas. El bisulfito de conversión provoca la degradación del ADN sustancial que puede ser un factor limitante en el análisis de PCR. Optimizado condiciones de reacción que maximizan la conversión citosina, reducir la fragmentación del ADN y mantener una sola cadena de ADN incluso a temperaturas más bajas se puede lograr utilizandoKit de bisulfito de Epitect de Qiagen. En nuestras manos ~ 200 ng de ADN purificado de micropunches proporcionar una cantidad suficiente de material de partida para la reacción de bisulfito. Para evitar diferencias en la eficacia de la reacción de conversión, la cantidad de ADN molde debe mantenerse constante entre todas las muestras procesadas durante un experimento. Además, la secuencia se lee debe ser analizado para la eficiencia de conversión mediante el examen de la tasa de no-convertidos no CpGs. Esta tasa debería superar el 98%. Los valores más bajos indican la conversión de bisulfito incompleto o ineficiente y las secuencias subyacentes deben ser excluidos del análisis. 5. Bisulfito PCR <ol><li> Bisulfito de diseño cebadores de secuenciación que son específicos de ADN bisulfito convertido (véase la discusión); metilo software Primer Express ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ Es / EE.UU. / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602121) ayudará a esto y ayudar a determinar óptimas temperaturas de recocido en experiencias piloto. </li><li> Preparar PCR-Master-Mix (para una reacción) como sigue: 2,5 l tampón 10x PCR 0,5 l de 10 mM dNTPs 1 l de 10 mM Cebador 1 l 10 mM cebador inverso 0,125 l Qiagen Hotstart Taq Plus completar hasta 23 ml con H 2 O </li><li> Añadir 2 l bisulfito tratados con ADN de reacción. </li><li> Amplificar utilizando las siguientes condiciones: 1 ciclo de 6 min 95 ° C 45-50 ciclos de 1 min 95 ° C, 1 min a una temperatura óptima de recocido, 1 min 72 ° C Un ciclo de 5 minutos a 72 ° C </li></ol> Analizar 7 l de producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar el tamaño de la amplificación de la reacción y purificar restante de PCR para la posterior ligación con un disponible en el mercado de PCR kit de limpieza (por ejemplo, Macherey-NaNucleospin gel de extracto). En caso adicionales no deseados productos de PCR se obtienen, purificación en gel se recomienda. 6. La secuenciación de bisulfito De alta resolución perfiles de metilación del ADN se deducen de las lecturas solo clon puede detectar pequeños cambios en la metilación del ADN y la identificación de regiones reguladoras que responden al tratamiento (la programación del medio ambiente). El proceso de secuenciación de bisulfito se compone de tres pasos consecutivos de trabajo. En primer lugar, los productos de PCR obtenidos por bisulfito antes de PCR se ligó en un vector y se transforma en una bacteria. En segundo lugar, colonia PCR a partir de clones individuales se emplea para determinar el tamaño correcto del inserto. En tercer lugar, PCR positiva colonia se limpian y se someten a la reacción de secuenciación Big-Dye. Después de un paso de limpieza, productos se someten a electroforesis en un secuenciador capilar. 6.1 La ligadura y la Transformación Nota: Se utilizan de forma habitual el vector pGEM-T clcañoning kit (Promega). En nuestra experiencia, la eficiencia de la clonación depende críticamente de la inserción que se ligó. Vectores diferentes deben ser probados en el caso de un bajo número de clones recombinantes son repetidamente obtenido. <ol><li> Establecer reacción de ligación: 5 Buffer l Ligadura 2x 1 l vector pGEM-T 1 l de T4-ligasa 3 l limpiado en marcha del producto de PCR </li><li> Mezclar reacción pipeteando y se incuba durante la noche a 4 ° C. Nota: La ligación también puede llevarse a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente también. Para aumentar el número de clones recombinantes, sobre la ligadura de la noche a 4 ° C es la preferida. </li><li> La limpieza de productos de ligación por precipitación con etanol: <ol class="lalpha"><li> Añadir 1 l de glucógeno, 1 l NaAc 3M y 25 l de EtOH al 100% a la reacción de ligación y precipitado durante 1 minuto en nitrógeno líquido. </li><li> Centrífuga (15,0000 g durante 30 min a 4 ° C) y desechar el sobrenadante. </li><li> Lavar con 300 l70% de EtOH y se centrifuga (15.000 g durante 20 min a 4 ° C), desechar el sobrenadante y sedimento seco a temperatura ambiente (10 min). </li><li> Resuspender el precipitado en 10 l de H 2 O. </li></ol></li></ol> 6,2 Transformación de productos de ligación en bacterias electrocompetent <ol><li> Prerrefrigerar cubetas de electroporación (1 mm de ancho) en el hielo y el deshielo de parte alícuota de electrocompetentes DH5a bacterias en hielo. </li><li> Añadir 45 bacterias DH5a l a 10 l limpiado producto de ligación (véase más arriba) y transferir a la cubeta. </li><li> Transformar las bacterias a 1,5 kV, 200 Ω, 15 mF y añadir 1 ml de medio SOB precalentado directamente después de la entrega del pulso. </li><li> Recuperar bacterias durante 1 hora a 37 ° C, se extendió 100 l de suspensión en LB / ampicilina placas recubiertas con IPTG / X-Gal. </li><li> Incubar las placas durante la noche a 37 ° C. </li></ol> 6,3 colonia PCR Nota: la colonia PCR a partir de clones individuales se lleva a cabo para asegurar que los insertos sonde tamaño predicho. Retraso en el desarrollo del color de la investigación azul / blanco, los eventos no deseados de recombinación durante la ligadura, la incorporación de parejas de cebadores oligoméricos o truncados productos de PCR de lo contrario puede conducir a resultados erróneos de secuenciación. Habitualmente usamos cebadores T7 y SP6 para amplificar insertos clonados, este enfoque se traduce en secuencias de vectores adicionales de aproximadamente 150 pb. Cebador T7 se utiliza en la reacción de secuenciación en un paso posterior. <ol><li> Establecer la colonia reacción de PCR en placas de 96 pocillos. Para una reacción utilizar: 3 l 2,5 mM MgCl 2 2,5 l tampón 10x Taq 1,5 l de 10 mM dNTP 2 l 2,5 mM T7 cebador 2 l 2,5 mM SP6 cebador 1 l Fermentas Taq polimerasa llenar hasta 25 ml con H 2 O </li><li> Vierta 25 l / pocillo de mezcla maestra en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. </li><li> Elige positivo (blanco) en los clones de la placa con la punta de la pipeta y la inmersión en la reacción de PCR. </li><li> Amplificar utilizando FOLguientes condiciones: 1 ciclo de 4 min a 95 ° C 10 ciclos de 30 sa 94 ° C, 30 s a 56 ° C y 30 s a 72 ° C 30 ciclos de 30 sa 94 ° C, 30 s a 48 ° C y 30 s a 72 ° C Un ciclo de 5 min a 72 ° C </li><li> Cargar 5 l de colonia PCR sobre un gel de agarosa y determinar las reacciones que contienen el inserto de tamaño correcto. </li><li> PCR colonia que contiene los amplicones esperados se limpian utilizando un kit disponible comercialmente (Machery Nagel Nucleofast). </li></ol> 6.4 Big-Dye terminator reacción y la secuenciación <ol><li> Prepare la mezcla de Maestro de Big-Dye reacción. Para una reacción utilizar: 1 l de H 2 O 0,5 l Big-Dye reactivo 1.5 Secuencia de búfer l </li><li> Dispense 3 l / pocillo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, a cada pocillo añadir 2 l de colonia limpiado producto de PCR y ejecutar la reacción en un termociclador con los siguientes parámetros: 35 ciclos de 10 a 96 s ° C, 5 a 50 s ° C y 4 min a 60 ° C </li><li> La reacción de Big-Dye, se limpia utilizando un kit comercial (Millipore Montage 96 Secuenciación Clean-Up Kit) y se procesa en un secuenciador capilar (por ejemplo ABI 3100 DNA). </li><li> Las secuencias se analizaron con el analizador de BIQ ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) o la herramienta en línea BISMA ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) para derivar el patrón de metilación de la región de ADN investigado (Figura 4). </li></ol> 7. Los resultados representativos Para conocer mejor la influencia de ELS en la expresión de AVP y estado de metilación, los ratones C57BL/6N fueron procesadas según el flujo de trabajo se ha descrito anteriormente. Brevemente, un grupo de ratones fue C57BL/6N subjected a ELS, mientras que el grupo de control se quedó sin ser molestados. El PVN y el núcleo supraóptico (SON) fueron perforados y el ADN y el ARN se aislaron de forma simultánea desde los golpes simples. El ARN se transcribe inversa y los niveles de transcritos avp se midieron por análisis qPCR y normalizado para la expresión de los genes HPRT y Gapdh limpieza. ADN fue tratada bisulfito, amplificado con los cebadores específicos para el potenciador AVP (Figura 4a) y los productos de PCR fueron clonados y secuenciados. Al menos 20 clones recombinantes a partir de cada ratón / PCR se analizaron para determinar las frecuencias de metilación de los CpGs contenidas en la amplificación de PCR (Figura 4b). En comparación con los controles, ELS indujo una hipometilación significativo en CpG10, CpG12, CpG13 Cpg14 y potenciador de la AVP (p &lt;0.05, n = 6-8 animales) lo que sugiere epigenética marcado de esta región regulatorio a través de las primeras experiencias de la vida. En contraste con el PVN, la metilación deel potenciador Avp no fue afectada por ELS en la especificidad HIJO tejido que ilustra de epigenética marcado (Figura 4c). Análisis del estado de metilación de ADN en CpG10 y la expresión de genes Avp en los animales control (n = 6) se evidencia una correlación negativa que apunta a un papel de la metilación del ADN en el perfeccionamiento de la expresión del gen AVP (Figura 4d). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Micropunches Figura 1. Se obtienen a partir de cerebros disecados de control y principios de la vida los ratones estresados. Después de ADN y el aislamiento de ARN, la expresión génica está determinada por QRT-PCR mientras que el ADN bisulfito tratada es amplificada y productos purificados se clonó en un vector adecuado que permite la identificación de clones recombinantes por azul / blanco de selección. Tamaños correctos de inserción son verificadas porcolonia PCR antes de llevar a cabo Big-Dye reacción y el tratamiento en un secuenciador capilar. Patrón de metilación son visualizados por las herramientas de software adecuadas. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Figura 2. Línea de tiempo a partir del ADN / ARN de extracción para la secuenciación de bisulfito. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Figura 3. Flujo de trabajo para la extracción simultánea de ADN y ARN. El punzón del núcleo hipotalámico paraventricularis, un gen que expresa Avp pequeña región del cerebro, se coloca en 400 l tampón GTA, vortex hasta interrumpido y se homogeneiza más al pasar a través de una jeringa (29G). El homogeneizado se divide entonces para la purificación de ARN y ADN. La división puede ser de 1:1 o de diferentes proporciones, dependiendosobre la cuestión experimental particular. Los homogeneizados se debe procesar a las pocas horas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Figura 4. Metilación de CpG en el locus de control de la AVP en 6 semanas de edad y los animales ELS. (A) Esquema de la cola de los genes AVP y oxitocina orientada a la cola y separados por la región intergénica (IGR). Los exones son representados por abiertos (numerada) cajas. La distribución de los residuos CpG está indicada y el tamaño y la posición del respectivo amplificación de PCR que contiene CpG 10 a CpG14 está marcada por una línea gruesa. (B) La metilación del potenciador de AVP en el PVN en los animales control y ELS (n = 6-8). (C) La metilación del mejorador de la AVP en el Hijo en el control y los animales ELS (n = 8-10). (D) la expresión del gen se correlacionó Avpcon la metilación en CpG10 (n = 6). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

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No hay conflictos de interés declarado.

Programación epigenética es cada vez más reconocido como un importante mecanismo que subyace a la salud y la enfermedad. Aquí presentamos un método perfeccionado para el aislamiento simultáneo de ADN y ARN de micropunches y los pasos posteriores para obtener perfiles de metilación del ADN a través de la secuenciación de bisulfito. El flujo de trabajo optimizado permite el análisis práctico de la programación epigenética en el cerebro en respuesta a los estímulos ambientales. Por otra parte, este enfoque facilita la investigación de la relación funcional entre la metilación del ADN y la expresión de genes ya que ambos se analizan de la misma muestra. Finalmente, el número de animales necesarios para el experimento se puede reducir significativamente. Ciertas precauciones y directrices deben ser seguidas mientras se realiza el flujo de trabajo presentado. Considerando la extraordinaria complejidad y heterogeneidad del cerebro y desde patrón de metilación y expresión puede variar en una celda de manera específica de tejido y es de sumaimportancia que micropunching se realiza en una forma estandarizada. Como un ejemplo de ello, la programación epigenética de AVP es detectado en el paravaventriuclar, pero no en el núcleo supraóptico (Figura 4b-d), dos Avp expresando las regiones del hipotálamo 4. A este respecto, la disponibilidad de ADN y el ARN del punzón mismo tejido es ventajosa como la expresión del ARN de ciertos genes marcadores específicos de tejido se puede utilizar en algunos casos para certificar que el área correcta fue perforado. Aunque micropunching puede reducir la heterogeneidad celular, tiene que tenerse en cuenta que este enfoque no conduce al aislamiento de los tipos de células individuales o grupos. Los pasos adicionales de purificación puede ser considerado para hacer frente a este tema. Para la secuenciación de bisulfito primer diseño óptimo para el tratamiento de amplificación de PCR de bisulfito siguiente es esencial. Los productos PCR de más de 400 pb de longitud puede ser problemático debido a la degradación del ADN por el bisulfite tratamiento. Cabe señalar también que la PCR anidada puede dar resultados sesgados si sólo unas pocas plantillas intactas contribuir al proceso de amplificación. Pares de cebadores que son específicos para la amplificación modificada debe ser diseñado; sus secuencias no debe contener dinucleótidos CpG con el fin de evitar la metilación de polarización amplificación. Además, los cebadores deben contener no CpG citosinas para evitar la amplificación de ADN no modificado o convertidos incompletamente. La amplificación de algunas plantillas pueden beneficiarse de la realización de arranque en caliente de PCR. En cualquier caso, la idoneidad de parejas de cebadores deben ser verificada en experimentos piloto con el fin de prevenir el deterioro de valiosas muestras experimentales. Secuenciación bisulfito representa un método estándar para el análisis de metilación específica del sitio, ya que es capaz de detectar con fiabilidad y precisión la metilación de los residuos individuales CpG en una forma específica de alelo 8. La secuenciación directa del producto de PCR no se aconseja como metilación o mixtaFA residuos CpG aparece como un pico de C / T doble en el electroferograma, que puede impedir que la cuantificación de la metilación en el sitio en cuestión. Por esta razón un paso intermedio se lleva a cabo la clonación y varios clones se secuenciaron (~ 20-30) para determinar el grado de metilación. Pyrosequencing constituye un método alternativo para cuantificar la metilación del ADN. También utiliza conversión bisulfito y bisulfito PCR, pero en lugar de clonación y secuenciación del amplicón se somete a una reacción pirosecuenciación directa cuando se lee el estado de metilación de un residuo CpG como un C / T polimorfismo de un solo nucleótido que puede ser fácilmente cuantificado. Ambos métodos detectar niveles similares de metilación 9 pero dado que la clonación paso se puede omitir pirosecuenciación es más eficiente en el tiempo. Sin embargo, dependiendo de la plantilla de sólo 40-100 nucleótidos pueden ser secuenciados a la vez de manera que varias rondas de pirosecuenciación con cebador de secuenciación diferentes son necesarias. Esta es una limitación crítica, dado Thacantidades superiores t de ADN (aproximadamente 1 g por reacción) son necesarios, que previsible exceder las cantidades disponibles de diminutos golpes de tejido cerebral. Así, la digitalización inicial de las regiones en el intervalo de varias kilobases por pirosecuenciación aparece menos adecuado como lectura solo clon. Sin embargo, tras la identificación de una pequeña región de pirosecuenciación de interés debe ser considerado. En conjunto, el protocolo descrito anteriormente proporciona un enfoque preciso, eficiente y funcional para el análisis rápido y rentable de micropunches cerebro de los cambios epigenéticos. Múltiples muestras se pueden procesar en una única prueba y los métodos son adecuados cuando se ejecuta muestras de tamaño intermedio experimentos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sangre y DNeasy Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin II del RNA </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740,955.50 </td></tr><tr><td> Epitect Kit de bisulfito </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Extracto Nucleospin </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740,609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector de clonación de kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743,100.50 </td></tr><tr><td> Montaje de 96 Secuenciación de Limpieza </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> HotStar Taq Polimerasa </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq polimerasa </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimized analysis of dna methylation and gene expression from small, anatomically-defined areas of the brain

La exposición a la dieta, las drogas y la adversidad primeros años de vida durante las ventanas sensibles de la vida 1,2 puede dar lugar a cambios duraderos en la expresión de genes que contribuyen a la visualización de los fenotipos fisiológicos y de comportamiento. De programación del medio ambiente Tal es probable que aumente la susceptibilidad a las enfermedades metabólicas, cardiovasculares y mentales 3,4. Metilación del ADN y las histonas modificaciones se consideran los procesos clave en la mediación del diálogo gen-medio ambiente y también parecen subyacer programación del medio ambiente 5. En los mamíferos, la metilación del ADN comprende típicamente la adición covalente de un grupo metilo en la posición 5 de citosina en el contexto de dinucleótidos CpG. CpG metilación se produce en una forma altamente tejidos y células específicas por lo que es un desafío para estudiar regiones discretas, pequeñas del cerebro donde la heterogeneidad celular es alta y limita la cantidad de tejido. Por otra parte, bebido a la expresión de genes y la metilación están estrechamente vinculados eventos, mayor valor se puede obtener mediante la comparación de ambos parámetros en la misma muestra. En este caso, un protocolo de paso a paso (Figura 1) para la investigación de la programación epigenética en el cerebro se presenta utilizando el paradigma de la &quot;separación de la madre &#39;de la adversidad primeros años de vida con fines ilustrativos. El protocolo se describe la preparación de micropunches de cerebro de ratón diferencialmente en edad desde el cual el ADN y el ARN puede ser simultáneamente aisladas, permitiendo así metilación del ADN y análisis de expresión génica en la misma muestra.

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Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Un flujo de trabajo simplificado para estudiar la metilación del ADN y los cambios de expresión génica a principios del estrés de la vida se muestra. A partir de la separación materna de los ratones recién nacidos y el aislamiento de los tejidos cerebrales discretas, que representan un protocolo para aislar al mismo tiempo el ADN y el ARN de golpes de tejido cerebral para la secuenciación de bisulfito y posterior análisis de RT-PCR.

Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

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JoVE Journal

Neuroscience

18.7K vistas.  Max Planck Institute of Psychiatry. Un flujo de trabajo simplificado para estudiar la metilación del ADN y los cambios de expresión génica a principios del estrés de la vida se muestra. A partir de la separación materna de los ratones recién nacidos y el aislamiento de los tejidos cerebrales discretas, que representan un protocolo para aislar al mismo tiempo el ADN y el ARN de golpes de tejido cerebral para la secuenciación de bisulfito y posterior análisis de RT-PCR.

Video: Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Investigación

Neurociencias

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

La cirugía estereotáxica para la lesión excitotóxica de áreas específicas del cerebro en la rata adulta

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...