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Declaración de Ética: NOTA: Todos los procedimientos discutidos en este manuscrito son de acuerdo con las directrices del NIH para la Investigación Animal (Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio) y son aprobados por el Comité CICUAL Escuela de Medicina de Harvard. Preparación 1. Pre-quirúrgico <ol><li> Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan mediante autoclave o bien mediante la limpieza con solución y / o etanol antiséptico según sea necesario. Siempre que sea posible, utilizar equipo desechable estéril tal como bisturís, agujas y jeringas. </li><li> Cubra la mesa de trabajo con paños quirúrgicos y asegúrese de que hay una eliminación de residuos de riesgo biológico disponible. </li><li> Pese la rata y el cálculo de la dosis de anestesia. Use una mezcla / xilazina ketamina (ketamina 75 mg / kg y xilazina 10 mg / kg) para anestesiar a las ratas. NOTA: Entre 200-250 g es el peso óptimo para la fijación adecuada del animal en el marco estereotáxico, así como para la orientación precisa de la ATN. Isoflurane también se puede utilizar como el agente anestésico. </li><li> Monte y dos electrodos estériles seguras (esterilizados en autoclave o con óxido de etileno) en el soporte de electrodo (Figura 2) de un bastidor quirúrgico estereotáctica y con la ayuda de un microscopio (magnificación 10-40x), inspeccionan las puntas del electrodo adecuado para alineación. Asegure los dos electrodos 3,0 mm de diferencia. NOTA: Tenga cuidado de no dañar la punta del electrodo tocando en superficies duras. </li></ol> 2. DBS Cirugía <ol><li> Inyectar la ketamina / xilazina mezclar intraperitoneal al animal y confirme que el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (comprobando el reflejo toe-pinch, la frecuencia respiratoria y la profundidad y la regularidad de la respiración). Quitar el pelo de la región del cuero cabelludo que se realiza una incisión y desinfectar el cuero cabelludo con 3 friega alternantes cada una de betadine y alcohol o solución salina estéril. Asegure y coloque el animal en el fram estereotácticae. </li><li> Utilice circulan pastillas de agua caliente para mantener la temperatura corporal del animal a un nivel óptimo. Aplicar lubricante ocular para los ojos del animal para protegerlo de un secado excesivo. </li><li> Utilice las siguientes coordenadas estereotácticas para dirigir la ATN (anterior núcleo talámico): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm y 5,2 mm dorsoventral 1. NOTA: Las coordenadas estereotáxica se basan en el Paxinos y Watson (6ª edición) rata cerebro atlas 36. </li><li> Hacer una incisión en el cuero cabelludo sagital para revelar el cráneo. El uso de un par de retractores asegurar el cuero cabelludo incisión para exponer el cráneo. Use una solución salina estéril para limpiar la incisión. Si la incisión es demasiado húmedo, utilizar hisopos de algodón estériles que se seque. Busque el bregma y marcar con un marcador negro. Para guiar la posición de los orificios de trepanación, hacen dos marcas más a aproximadamente 1,5 mm mediolateral en ambos lados de la sutura sagital y 1,6 mm posterior a la coronal sutura. </li><li> Use un taladro de mano para hacer los agujeros de trépano. Asegúrese de que la punta del orificio de trépano es estéril mediante la esterilización con etanol. Sostenga el taladro aproximadamente a un ángulo de 45 ° a la superficie del cráneo durante la perforación. Cambiar con frecuencia entre los dos agujeros de trépano para evitar el calor excesivo en el lugar de cualquier trepanación. </li><li> Continúa la perforación hasta que se vea la duramadre. Usando una aguja con su punta doblada asemeja la forma de una &quot;L&quot;, retire los trozos rotos de hueso que pudieran obstruir la inserción del electrodo. Tenga cuidado de no dañar la duramadre y / o tejido cerebral subyacente mientras se quita fragmentos de hueso con la aguja doblada. NOTA: El uso de una aguja roma o fórceps romos finas es también una opción. </li><li> Fijar el conjunto de electrodo dual a la empuñadura giratoria del marco estereotáxico y fijar el mango en un ángulo de 90 °. El uso de los ajustes en el marco estereotáxico, coloque el electrodo izquierdo exactamente encima del bregma. </li><li> Usando el equipo de músicaajustes táctica para posicionamiento mediolateral, se mueven con precisión el electrodo izquierdo 1,5 mm hacia el lado izquierdo de bregma de tal manera que ahora hay dos electrodos perfectamente alineadas a lo largo de la sutura coronal, pero separados en 1,5 mm mediolateral desde el bregma. </li><li> Usando los ajustes estereotácticas anterioposterior, mover los electrodos 1,6 mm posterior a la sutura coronal. </li><li> Utilice los ajustes dorsoventrales para bajar los electrodos a primera verificación si los agujeros de trépano se han hecho en el lugar adecuado de tal manera que los electrodos pueden insertarse con facilidad, sin tocar los bordes ásperos de las trepanaciones. Si es así, insertar los electrodos a una profundidad de 5,2 mm desde la superficie del cráneo. </li><li> Conectar los electrodos a través de cables a un estimulador fijado en 130 Hz, 2,5 V y 90 microsegundos pulsewidth 1. </li><li> Entregar la estimulación de alta frecuencia durante una hora (o durante un período de tiempo deseado según la configuración experimental). Durante el transcurso de la estimulación, recordar para asegurar pprofundidad de la anestesia Roper regularmente mediante la comprobación de la ausencia de retirada de la pata en respuesta a una pizca dedo del pie. Complementar la anestesia con aproximadamente la mitad de la dosis inicial utilizada para inducir la anestesia. Evite la contaminación de los guantes estériles al comprobar la profundidad anestésica y cambiarlos si es necesario. Realice la estimulación unilateral o bilateral basada en las necesidades experimentales de uno. Incluir controles tales como la estimulación de baja frecuencia (por ej., 10 Hz) y animales (sin estimular la inserción de electrodos sin estimulación posterior). </li><li> Después de la estimulación se realiza, retire los electrodos con cuidado y suturar la incisión con 3-0 suturas o con grapas quirúrgicas estériles. </li><li> Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por vía subcutánea como analgesia. Monitorear el animal hasta que vuelve a la actividad normal y luego regresar a su centro de vivienda. </li><li> Después de un período de tiempo basado en el diseño experimental (por ejemplo, 0, 3, 6 o 12 horas después de la cirugía de DBS), Sacrificar al animal con sobredosis de anestesia. Después de confirmar la ausencia de signos vitales, decapitar al animal. </li><li> Diseccionar el cerebro eliminando primero la piel con unas tijeras. Cortar el hueso largo de la sutura sagital con unas tijeras de disección. Hacer dos incisiones más (alrededor de una pulgada cada una) a través del hueso en ambos lados laterales. El uso de pinzas, levante la pieza cortada parcialmente de hueso de la parte superior del cráneo para exponer el cerebro. </li><li> Con unas tijeras o pinzas finas, desalojar el cerebro del cráneo y transferir a una placa de Petri con PBS frío en hielo. NOTA: Tenga cuidado de evitar daños en el cerebro, mientras que hacer las incisiones a través del hueso. </li></ol> 3. Hippocampus Aislamiento NOTA: Realice todos los pasos posteriores de esta sección en el hielo. <ol><li> Coloque el cerebro en una matriz de cerebro de acrílico pre-enfriado en hielo. Utilizando una hoja de afeitar, cortar el cerebro coronal en aproximadamente 7-8 mm de la anterior-más edge del cerebro. Hacer un segundo corte coronal y posterior a la primera corte de manera que un corte de cerebro de aproximadamente 5 mm de espesor podría ser eliminado. </li><li> Transferir el corte de cerebro a una placa Petri con PBS enfriado con hielo. El uso de hoja de afeitar, cortar las dos secciones semiesféricas y cuidar señalar que hemisferio corresponde a los lados izquierdo y derecho respectivamente. Esto es especialmente importante en el desempeño de estimulaciones unilaterales. </li><li> Utilizando pinzas finas y tijeras eliminar el hipocampo cuidadosamente. </li><li> Flash congelar el tejido del hipocampo en hielo seco y tienda en congelador a -20ºC hasta el momento de las etapas de extracción de ARN posteriores. NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, es recomendable almacenar tejido en un congelador a -80ºC. </li></ol> 4. La extracción de RNA y PCR cuantitativa <ol><li> Asegúrese de que el tejido se mantiene congelada en hielo seco hasta que esté listo para la homogeneización. </li><li> NOTA: Realice este paso en la campana. <ol><li> Añadir 1 ml de reactivo Tri a hippocampal tejido en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y homogeneizar por primera pipeteado varias veces hasta que el tejido se rompe en trozos más pequeños. Además homogeneizar el tejido pasando a través de una jeringa con una aguja de 25 G hasta que no haya tejido ininterrumpida visible. Realice los pasos de homogeneización en el hielo. </li><li> Después de homogeneizar el tejido, permite la suspensión de células en reposo a temperatura ambiente durante 5 min para permitir la lisis celular. NOTA: Después de este punto, la suspensión de células puede ser rápido congelado y almacenado en -70 ° C hasta su posterior procesamiento. </li></ol></li><li> Añadir 0,2 ml de cloroformo y se mezcla mediante agitación con vórtex durante 20 segundos y dejar el resto solución a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, quite los tubos cuidadosamente sin molestar a las tres capas separadas que serán visibles. NOTA: La fase inferior (rojo) contiene proteínas, fase nublado media contiene ADN y la fase clara superior contiene RN / A. </li><li> Transferir la fase clara superior (ARN) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml fresca (típicamente se obtienen 500 l de ARN que contiene la fase). Para este complemento 0,5 ml de isopropanol y mezclar mediante agitación. Para este complemento 2/3 l de glucógeno (20 mg / ml) como transportista por la ARN. Permita que la muestra para descansar sobre la mesa a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Asegúrese de que el sedimento de ARN es visible en la parte inferior del tubo. </li><li> Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento de ARN mediante la adición de 1 ml de etanol al 75% (hecho con agua libre de nucleasa). Invertir la muestra varias veces hasta que el pellet se desplaza desde el fondo del tubo y flota en la solución. Centrifugar la solución a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. NOTA: El sedimento en etanol al 75% se puede almacenar a -20 ° C hasta su posterior pasos. </li><li> Permitir que el sedimento de ARN se seque al aire dejando los tubos abierta durante 5 min a temperatura ambiente. Tome precauciones para evitar over secar el pellet ya que esto podría afectar a su disolución en agua en la etapa subsiguiente. </li></ol> 5. Extracción de ADN de la preparación de ARN <ol><li> Añadir 9 l de agua libre de nucleasa al sedimento de ARN y asegúrese de que el sedimento se disuelve antes de proceder suavemente vórtex el tubo. Para esta añada 1 l de 10x ADNasa I Buffer y 1 l de DNasa recombinante (del kit DNasa I), mezclar suavemente con un movimiento rápido de los tubos, brevemente girar los tubos e incubar a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos. </li><li> Añadir 2 l de reactivo de inactivación de ADNasa (del kit de DNasa I) a la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 2 min y se mezcla a menudo por agitando suavemente el tubo. Centrifugar a 12000 xg durante 10 min y la transferencia de aproximadamente 10 l del sobrenadante claro a un tubo de centrífuga de 1,5 ml frescos. </li><li> Medir la concentración de ARN usando un espectrofotómetro NanoDrop o. </li></ol> 6. Hacer ADNc a partir de ARN <ol><li> Añadir º volumen requeridoen contiene 1 g de ARN y llevar el volumen total a 8 l mediante la adición de agua libre de nucleasa. Para este complemento mM dNTP 1 l 10 mezclar y 1 l de hexámeros aleatorios del kit Superíndice primer capítulo de síntesis. Mezclar suavemente y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos, ya sea en un baño de agua o en un termociclador preprogramado. </li><li> Hacer una premezcla que contiene los siguientes reactivos: 2 l de 10x tampón de RT, 4 l de 25 M de MgCl 2, 2 l de 0,1 M DTT y 1 l de ARNasa OUT (40 U / l). NOTA: Los volúmenes dados son por reacción, el usuario tendría que aumentar la escala de acuerdo a las necesidades experimentales de uno. </li><li> Después de eliminar el ARN que contiene la muestra de 65 ° C, colocar el tubo a temperatura ambiente durante un minuto. Añadir la solución de premezcla 9 l e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Añadir 1 l de Superscript II enzima transcriptasa inversa (50 U / l) y luego se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Incubar las muestras a 42 ° C durante 50min para la transcripción inversa que se produzca. </li><li> Incubar las muestras a 70 ° C durante 15 min para terminar la reacción. </li><li> Colocar las muestras en hielo brevemente y añadir 1 l RNAseH (2 U / l) y se incuba a 37 ° C durante 20 minutos. </li><li> Brevemente centrifugar los tubos a 3000 xg para centrifugar el líquido condensado. NOTA: Este es el cDNA que se utilizará para la PCR cuantitativa. cDNA puede ser almacenado en congelador a -20ºC hasta que la instalación PCR. ADNc también se puede diluir con agua libre de nucleasa antes de proceder a PCR. </li></ol> 7. PCR cuantitativa <ol><li> Hacer una mezcla maestra que contiene los siguientes reactivos (volúmenes dados son por reacción): 6,3 l de 2x SYBR Green Mix, 0,6 l de Forward Primer (10 M), 0,6 l de cebador inverso (10 M) y 0,5 l de nucleasa agua libre . NOTA: Primer diseño se realizó utilizando la opción en la página secuencia de nucleótidos de NCBI &#39;Primers Pick&#39; para el gen de interés. </li><li> Añadir 10 l de mezcla maestra a cada pocillo de una placa de 96 PCR bien. Añadir 2,5 l de cDNA hechas anteriormente al pozo que contiene la mezcla maestra. Asegúrese de configurar las reacciones de PCR por triplicado para cada muestra. </li><li> Después de completar la adición de mezcla maestra y de ADNc, cubrir la placa de PCR usando una lámina adhesiva óptica para sellar los pocillos. Se centrifuga la placa brevemente durante 5 min a 500 xg en una centrífuga de mesa para resolver todo el líquido a la parte inferior del pozo. </li><li> Cargar la placa de PCR en una máquina RT-PCR pre-programado. Utilice los parámetros de PCR proporcionados en la Tabla 1. </li><li> Análisis de datos: Utilice los valores C t desde la salida qPCR para otros cálculos. Junto con el gen de la prueba, configurar las reacciones de PCR para los genes de control interno, 18S rRNA (para garantizar la igualdad de entrada) y β-actina (control negativo). Calcular cambios veces basadas en el método ΔΔCt 37. </li></ol>

The authors have no disclosures.

Siguiendo el trabajo de la señal por Benabid et al., En el uso de la estimulación cerebral profunda para tratar la enfermedad de Parkinson y temblor esencial, la técnica quirúrgica DBS ha sido investigado con mucho interés en la última década para tratar muchos trastornos neurológicos 6,10,43. Estudios DBS dirigidas a las distintas regiones neuro-anatómico de los circuitos cerebrales se realizan actualmente por muchos grupos para hacer frente a las principales enfermedades neuronales y se en...

La historia detrás del desarrollo de la estimulación cerebral profunda como técnica neuroquirúrgica se remonta a la década de 1870 cuando la posibilidad de la estimulación eléctrica de los circuitos cerebrales se exploró 2. El uso de estimulación de alta frecuencia crónica como tratamiento para trastornos neuronales se inició en la década de 1960 3. Más tarde, en la década de 1990 con el advenimiento de la implantación crónica de DBS electrodos 4-6, el número de trastornos neuronales que fueron tratados por DBS siguió aumentando. La estimulación cerebral profunda se utilizó por primera vez en los Estados Unidos como un tratamiento para el temblor esencial 6. Hoy en día la cirugía se utiliza ampliamente para el tratamiento de trastornos neuronales que están actualmente intratables por la intervención farmacológica. DBS se utiliza actualmente para tratar los trastornos del movimiento de la enfermedad de Parkinson y la distonía 7-9. Demencia de tipo Alzheimer, la enfermedad, la epilepsia, el dolor y enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión de Huntington, OCD, Tourette7; síndrome de adicción y s son algunas de las condiciones susceptibles de tratamiento por DBS 10-12. Si bien la cirugía DBS está aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, distonía y el temblor esencial, el uso de DBS para tratar otras condiciones mencionadas anteriormente están en diversas etapas de laboratorio y los estudios clínicos que ofrecen una gran promesa a los pacientes 13,14. Clínicamente, la cirugía de DBS se realiza en dos etapas. La primera etapa consiste en la colocación de los electrodos quirúrgicamente DBS en la ubicación anatómica objetivo utilizando una combinación de posicionamiento radiológica, CT, MRI, así como lecturas de microelectrodos para mejorar la precisión. La segunda etapa consiste en la implantación de un generador de impulsos en la parte superior del pecho del paciente y la extensión de instalar conduce desde el cuero cabelludo para el generador de impulsos. Sobre la base de la condición neurológica, los esquemas de programación varios para el generador de impulsos se han estandarizado y se pueden usar para suministrar la tensión deseada. El volumen final deTage se alcanza de una manera gradual a fin de recibir la mejor respuesta clínica con un mínimo de voltaje 15. Sin embargo, en nuestros estudios, a diferencia de los implantes crónicas DBS utilizado clínicamente, en aras de la simplicidad, hemos recurrido a estudiar una estimulación de alta frecuencia de una sola vez (durante 1 hora) en nuestros modelos animales. Parte de la investigación de nuestro grupo se centra en investigar el uso de la cirugía de DBS para la epilepsia refractaria al tratamiento. Abordajes quirúrgicos estereotácticos utilizando la estimulación de alta frecuencia ha sido explorado por muchos otros como una opción eficaz para tratar la epilepsia médicamente refractaria que constituye alrededor del 30% de todas las incidencias de la epilepsia 10,16,17. Estimulación cerebelosa la orientación de la superficie cortical, así como los núcleos cerebelares profundos se han utilizado en el pasado como dianas para tratar la epilepsia 10,18,19. Además, la estimulación del hipocampo también se ha intentado, pero con resultados mixtos 20,21. Algunos de los otros investigaronObjetivos de DBS para epilepsia incluyen la corteza cerebral, el tálamo, núcleo subtalámico y el nervio vago 8. Sin embargo, a raíz de los resultados de varios estudios en los últimos años, el núcleo talámico anterior (ATN) se ha convertido en el objetivo DBS más común para el tratamiento de la epilepsia 10,22. Sobre la base de conocimiento acerca de los circuitos neuroanatómicos y los resultados de los modelos animales, varios estudios se han centrado en el efecto terapéutico de la estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia 23-26. El ATN es parte del circuito límbico y se encuentra en la región del cerebro que afecta a la frecuencia de convulsiones. Los estudios realizados por Hamani et al., Han puesto a prueba la eficacia de ATN-DBS en un modelo de epilepsia inducida por pilocarpina y encontró que la estimulación bilateral ATN latencias para las convulsiones inducidas por pilocarpina y el estado epiléptico 24 prolonga. Por otra parte, se encontró la estimulación de alta frecuencia de la ATN para reducir la frecuencia de convulsiones en un modelo pentilentetrazol (PTZ) de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Han informado de una reducción media en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 75% a la crónica estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia parcial refractaria 30. Un estudio clínico reciente sobre la epilepsia refractaria al tratamiento ha mostrado resultados prometedores después de la cirugía de DBS dirigidas al núcleo talámico anterior (ATN) 22. Un ensayo clínico aleatorio multicéntrico con 110 pacientes sometidos a estimulación cerebral profunda bilateral del ATN para el tratamiento de la epilepsia refractaria (ensayo SANTE) indica una caída en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 40% 31. Los resultados de este estudio también dio a entender en un efecto antiepiléptico óptima retraso observado a los 2-3 meses después de la cirugía. Posteriores estudios de Toda et al., Corroboradas con estos hallazgos en la que demostraron neurogénesis ocurre en un puesto de tiempo después de DBS (días 3-5) en modelos animales 1. Además, Encinas et al., Han informado neurógena del hipocamposis en el ratón adulto giro dentado después de la estimulación de alta frecuencia de la ATN 32. Estudios previos han informado de la disminución de 33 a 35 neurogénesis del hipocampo, en algunos casos de epilepsia como la epilepsia del lóbulo temporal, crónica y una asociación con déficit de aprendizaje, trastornos de la memoria y espontáneos recurrentes crisis motoras. Además, hubo una reducción de los factores de células madre progenitoras neurales tales como FGF2 y IGF-1 en el hipocampo crónicamente epiléptico en modelos animales 33. Teniendo en cuenta esto, las estrategias intervencionistas como la DBS que muestran un aumento de la neurogénesis en el giro dentado son vías interesantes para la investigación. Estos resultados nos han animado a explorar más profundamente en el mecanismo subyacente tratamiento neurogénesis post-DBS para la epilepsia. Hemos apuntado a la ATN tanto unilaterales (datos no informados), así como de forma bilateral (en los resultados representativos) y visto neurotrofina elevada (BDNF) expresión en el giro dentado de ratas. Nuestra chipótesis urrent es que la expresión de BDNF inicia una cascada de expresión génica que culmina en la neurogénesis que se traduce en el efecto antiepiléptico de la cirugía de DBS. En este trabajo, presentamos nuestros métodos para la cirugía de DBS focalización del ATN en ratas, seguido de análisis de expresión génica como un enfoque atractivo para estudiar el mecanismo que subyace a los beneficios de la DBS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1211">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:236px;">Deep Brain Stimulation Surgery</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:604px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereotactic frame</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drill&#160;</td>
			<td>Dremmel</td>
			<td>7700, 7.2 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td>BD</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280</td>
			<td>Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical staples</td>
			<td>ConMed Corporation</td>
			<td>8035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sutures (3-0)&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1 ml, 29 1/2 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (3 ml, 25 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309570</td>
			<td>Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305761</td>
			<td>Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Use for general sterilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eye Lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-898-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stimulator</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>Model 3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DBS electrodes</td>
			<td>Rhodes Medical Instruments, CA</td>
			<td>SNEX100x-100mm</td>
			<td>Electrodes are platinum, concentric and bipolar</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Betadine (Povidone-Iodine)&#160;</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td>Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="2" height="25" style="height:25px;">&#160;Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylic Rodent Brain Matrix</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>175-300</td>
			<td>www.emsdiasum.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor Blade</td>
			<td>V W R</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guillotine Scissors</td>
			<td>Clauss</td>
			<td>18039</td>
			<td>For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Codman Classic</td>
			<td>34-4098</td>
			<td>Use for removing the brain from the skull</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72957-06</td>
			<td>Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="2" height="25" style="height:25px;">&#160;RNA Extraction and cDNA Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tri Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td>Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (3 ml, 25 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309570</td>
			<td>Use for tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase I Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superscript First Strand Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11904-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tabletop Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;Quantitative PCR</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Custom Oligos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10668051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Plates (96 wells)</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C18080-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical Adhesive Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease free Water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30538-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Real Time PCR Machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus

La estimulación cerebral profunda (DBS), la cirugía, apuntando a diferentes regiones del cerebro, como los ganglios basales, el tálamo y regiones subtalámico, es un tratamiento efectivo para varios trastornos del movimiento que no han respondido a la medicación. Los recientes progresos en el campo de la cirugía de DBS ha comenzado a extender la aplicación de esta técnica quirúrgica para otras condiciones tan diversas como la obesidad mórbida, la depresión y el trastorno obsesivo compulsivo. A pesar de estas indicaciones en expansión, se sabe poco sobre los mecanismos fisiológicos subyacentes que facilitan los efectos beneficiosos de la cirugía de DBS. Un enfoque a esta pregunta es para llevar a cabo análisis de expresión génica en las neuronas que reciben la estimulación eléctrica. Estudios anteriores han demostrado que la neurogénesis en el giro dentado de la rata se provoca en DBS focalización del núcleo anterior del tálamo 1. Cirugía de DBS focalización del ATN se utiliza ampliamente para el tratamiento de la epilepsia refractaria. Por tanto, es de mucho interest para nosotros para explorar los cambios transcripcional inducidos por la estimulación eléctrica de la ATN. En este manuscrito, describimos nuestras metodologías para estereotáctica guiada por cirugía de DBS focalización del ATN en ratas Wistar macho adultas. También se discuten los pasos subsiguientes para la disección de tejidos, el aislamiento de ARN, la preparación de ADNc y RT-PCR cuantitativa para medir los cambios de expresión génica. Este método podría aplicarse y modificarse para estimular los ganglios basales y en otras regiones del cerebro comúnmente clínicamente dirigida. El estudio de la expresión génica se describe aquí asume un enfoque objetivo de genes candidato para descubrir jugadores moleculares que podrían dirigir el mecanismo para DBS.

Figuras 1A y 1B muestran la expresión relativa de BDNF y GABRD en relación con el gen de control de β-actina. BDNF, una neurotrofina se asocia a menudo con efectos neuroprotectores en muchas enfermedades neuronales 38-41. Por tanto, es interesante analizar el perfil de expresión de BDNF en respuesta a la estimulación de la ATN que produce beneficios terapéuticos a pacientes epilépticos. En la Figura 1A que muestra el perfil de expresión génica de BDN...

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Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

analysis-gene-expression-changes-rat-hippocampus-after-deep-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K vistas.  Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School. The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Uso del protocolo Theta-Burst para explorar Mechasnism de plasticidad en los individuos con el síndrome de X frágil y el autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Investigación

Neurociencias

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

El dispositivo de TMS NeuroStar: Realización de la FDA aprobó el Protocolo para el tratamiento de la depresión

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La estimulación cerebral profunda con simultánea fMRI en roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Utilizando fluorescencia clasificación de células activadas para examinar Cell-tipo-específica la expresión génica en el tejido de cerebro de rata

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Microelectrodos guiada implantación de electrodos en el Subtalámico Núcleo de ratas de largo plazo estimulación cerebral profunda

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...