We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

1. Cultura de ovario líneas celulares de cáncer (adherentes Condiciones) NOTA: Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril <ol><li> Preparar medios de cultivo celular tradicional. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + 15 mM HEPES) y suplementar con suero fetal inactivado por calor al 10% de bovino y 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar la solución usando 0,45 micras filtro de vacío. </li><li> Preparar una tradicional poliestireno 75cm frasco de cultivo de tejido 2 etiquetada con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular de interest.Remove el vial de células de ultra baja congelador o nitrógeno líquido. Descongele colocando en baño a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Suspensión Traslado del vial en un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 3 ml de medio de cultivo celular tradicional (preparado anteriormente). La suspensión se centrifuga a 4 ° C durante 5 min a 400 x g. Mientras tanto, añadir 16 medios de cultivo celular tradicionales ml al matraz. </li><li>Aspirar el sobrenadante. El uso de 2 ml de cultivo celular células pipeta medios tradicionales hacia arriba y abajo para aflojar pellet y suspensión traslado al frasco. Suavemente frasco roca para distribuir uniformemente frasco cells.Place en humidificado incubadora de cultivo celular se establece en 37 ° C y 5% de CO 2. Monitorear las células diariamente hasta que se alcanzó el 80% de confluencia. </li><li> Una vez que las células son 80% confluentes dividió el cultivo 1: 2 en campana de cultivo celular. Aspirar el sobrenadante y lavar con solución salina tamponada con fosfato caliente (sin calcio y magnesio) (PBS). Añadir 1,5 ml de tripsina al 0,25% EDTA y se incuba 3-5 min a TA. </li><li> Prepare 2 nuevos 75cm 2 frascos de poliestireno y añadir 16 ml de medio de cultivo celular tradicional a cada matraz. Resuspender las células tratadas con tripsina en 4 ml de medios tradicionales de cultivo celular y alícuotas volúmenes iguales de cada uno de los nuevos matraces. </li><li> Colocar en frascos humidificado incubadora de cultivo celular ponen a 37 ° C y 5% de CO 2. Monitorear las células diariamente hasta que se alcanzó el 80% de confluencia. Continúe dividir celdas yla cultura o la congelación y almacenar a -80 o en nitrógeno líquido. </li></ol> 2. Generación de esferoides multicelulares de ovario líneas celulares de cáncer Uso de células flotantes o adherentes NOTA: Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril. Después de cultivar las líneas celulares bajo los métodos de cultivo tradicionales para 2-3 pasajes (sección 1) continuar con los siguientes pasos. <ol><li> Preparar los medios de comunicación de células madre. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + 15 mM HEPES) y suplementar con 1% de penicilina / estreptomicina (a una concentración final de 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina), 1% de reemplazo de suero knockout , 0,4% de albúmina de suero bovino y 0,1% de insulina-transferrina-selenio. Filtrar la solución usando 0,45 micras filtro de vacío. </li><li> Medios de células madre Suplemento con el factor recombinante humano de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (FGF) para una concentración final de 20 ng / ml y 10 ng / ml, respectivamente. NOTA: Los factores de crecimiento se deben agregar fresco a los medios de comunicación de células madre justo antes de su uso. </li><li> Crear cultura flotador TIC. Retire frasco de 80% de células confluentes cultivadas en condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Recoger medios de comunicación y todas las células flotantes (individuales y agregados), dejando a la población adherente detrás, y la transferencia a 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno. La suspensión se centrifuga a 4 ° C durante 5 min a 400 x g. NOTA: Las células flotantes y agregados son evidentes 24-72 horas después de células adherentes se unen al matraz en la cultura tradicional. Desde un 80% de recuperación de la placa confluente de aproximadamente 1.0 - 5.0 x 10 5 células flotantes viables se puede esperar, dependiendo de la línea celular. En este estudio, el número medio de células flotantes recogidas de un cultivo adherente confluentes 80% fue: 5,0 x 10 5 para ACI-23, 4,8 x 10 5 para OVCAR5, 3,5 x 10 5 para Caov3, y 1,0 x 10 5 para TGS- 3. Tras la transferencia, multicelularla formación de esferoides ular en cultivo tradicional y TIC flotador se produce dentro de unos pocos días aunque esto es algo dependiente línea celular. Por ejemplo, ACI-23 células forman agregados más fácilmente que las células Caov3. </li><li> Mientras tanto, prepare un ultra bajo apego poliestireno superficie 75 cm 2 frasco de cultivo de tejido etiquetado con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular. Añadir 10 ml de células madre medios suplementados con factores de crecimiento al matraz. </li><li> Una vez que se completa la centrifugación, medios de aspirado y la transferencia de pellets a matraz bajo apego añadiendo 6 ml tallo medio celular y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para aflojar pellet. Colocar en frascos humidificado incubadora de cultivo celular ponen a 37 ° C y 5% de CO 2. Monitor de células cada 2 - 3 días para observar la formación de esferoides. </li><li> Crear cultura TIC tradicional. Retire frasco de 80% de células confluentes cultivadas en condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 1,5 ml de tripsina al 0,25% de EDTA y se incuba 3-5min a TA. </li><li> Preparar un ultra bajo apego poliestireno superficie 75 cm 2 frasco de cultivo de tejido etiquetado con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular. Añadir 10 ml de células madre medios de comunicación, suplementado con EGF y FGF, como se describe, al matraz. </li><li> Añadir 6 ml de medio de células madre en el matraz con la tripsina. Solución de células Pipetear hacia arriba y hacia abajo y tratar de aflojar las células de la superficie del matraz. Transfiera todo el volumen de las células a la ultra baja frasco adjunto que contiene los 10 ml provienen medio celular. Coloque el frasco en humidificado incubadora de cultivo celular establece en 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Suplemento culturas TIC cada 48 a 72 hr con un adicional de 2 ml detener los medios de comunicación celulares y EGF y FGF fresco para concentraciones finales de 20 ng / ml y 10 ng / ml, respectivamente. </li><li> Monitorear las células hasta 60 - se alcanza el 80% de confluencia. Culturas divididas por la colocación de volúmenes iguales en 2 frascos nuevos de ultra bajo de fijación y la adición de medios de células madre frescas para alcanzar un volumen final de 18 ml. AlternativaLy, centrífuga de toda la suspensión a 4 ° C durante 5 min a 400 x g. Resuspender las células en medios de células madre complementados con EGF y FGF y distribuyen por igual en nuevos frascos de ultra bajo de apego. Las células no tienen que ser disociado en suspensiones de células individuales para pases. NOTA: En este punto, las culturas se seguirá dividiéndose y culta, congelado, o experimentalmente manipulado para su análisis. En 60 a 80% de confluencia se recuperaron las siguientes concentraciones de células de ACI-23: 8,0 x 10 6 para Tradicional Adherente, 4,0 x 10 6 para Tradicional TIC, y 5,0 x 10 6 de culturas Floater TIC. Aunque podría ser línea celular dependiente, hemos encontrado que de 5 - 10 días de cultivo es óptimo para el enriquecimiento TIC como el porcentaje de CD133 + ALDH + células es baja dentro de los primeros 3 días, los picos a los 5 - 10 días, y disminuye de nuevo en 14 días. </li></ol> 3. Generación de líneas de células epiteliales primarias de cáncer de ovario y multicelulares esferoidesde ascitis Paciente quimiorresistente NOTA: aprobación de la Junta de Revisión Institucional se obtuvo para este protocolo. Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril. <ol><li> Placa de fluido de ascitis 1: 1 con medio de cultivo celular tradicional. Preparar los medios de comunicación como se describe en la sección 1 y añadir 10 ml de varios frascos tradicionales cm2 de cultivo de tejidos de poliestireno 75. </li><li> El líquido ascítico se suele realizar en 1 L de botellas de vacío estéril; retire la tapa de vacío. Añadir con cuidado 10 ml de líquido ascítico al frasco que contiene 10 ml de medios de comunicación tradicionales y lugar en humidificado incubadora de cultivo celular establecidos a 37 ° C y 5% de CO 2. Deje reposar durante 72 a 96 horas, antes de hacer un cambio de medio completo. Cambie medios cada 2-3 días hasta que las células alcanzan 60-80% de confluencia </li><li> Una vez que las células alcanzan 60-80% de confluencia, dividir 1: 2 como se describe en el apartado 1. culturas Inicio TIC como se describe en la sección 2. NOTA: Los eritrocitos presentes en ascites serán removidos después del primer cambio de medio, ya que son no adherentes. Cualquier fibroblastos presentes serán eliminados en gran medida después del tratamiento con tripsina ya que son más sensibles y levantar con una exposición mínima a la tripsina. La pureza de las células de cáncer de ovario se determinó mediante análisis de citometría de flujo usando el anticuerpo de CA-125 (MUC16). </li></ol> 4. La tinción de células para Citometría de Flujo Confirmación de TIC Marcadores <ol><li> Reunir culturas TIC. Transferir contenido del frasco en 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno. Suspensiones Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 2 ml de solución de disociación celular no enzimática, incubar 3 - 5 min a 37 ° C, y pipetear arriba y abajo para romper los grumos y se disocian en células individuales. Añadir 4 ml detener los medios de comunicación celulares. </li><li> Recoger cultivos adherentes. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 3 ml de solución de disociación celular no enzimática y se incuba 3 - 5 min a 37 ° C. Añadir 3 ml de células tradicionalmedios de cultivo y pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar las células del frasco y recogen en el tubo de centrífuga. </li><li> Centrifugar tanto TIC y suspensiones adherentes durante 5 minutos a 400 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender cada sedimento en 1 ml de PBS que contenía suero bovino fetal al 3%. Incubar a RT 30 min. Mientras tanto, contar el número de células viables utilizando azul de tripano. Observar las células bajo el microscopio para confirmar esferoides se disocian en células individuales. </li><li> Etiqueta de 5 x 1,5 ml tubos Eppendorf para cada una de las siguientes condiciones de cultivo: 1) no teñida (control de mancha de indemnización), 2) ALDH (de control sola mancha positivo para la compensación), 3) CD133 (control positivo sola mancha de indemnización), 4 ) ALDH + CD133 (muestra experimental de prueba), y 5) DEAB + ALDH (controles negativos para la fluorescencia de fondo en FL-1 y FL-4 canales, respectivamente). </li><li> Distribuir aproximadamente 5 x 10 5 células cada uno de los tubos # 1 - 4. suspensiones Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Aspirar supernatant y volver a suspender las pastillas en 500 l Aldefluor tampón de ensayo. Añadir 10 l DEAB (inhibidor de ALDH) al tubo # 5 para el control negativo experimental. </li><li> Añadir 5 l activados reactivo Aldefluor al tubo # 2 para el control positivo de compensación y la película para mezclar. Añadir 5 l activados reactivo Aldefluor al tubo # 4 para el análisis experimental. Flick tubo para mezclar y transferir inmediatamente la mitad del volumen de células de tubo # 4 en el tubo # 5 (250 l) que contiene el DEAB. </li><li> Tubos Flick se mezclen bien. Incubar todos los tubos durante 30 - 45 min a 37 ° C protegido de la luz. Tubos Flick a mitad de período de incubación como células se depositan en el fondo. Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 400 x g. Sobrenadante y volver a suspender las células Aspirar en 500 l Aldefluor tampón de ensayo. </li><li> Para tubos con tinción CD133 (# 3 y # 4), añadir CD133-APC 1:11 directamente en tampón de ensayo Aldefluor. Incubar 15 minutos en hielo protegido de la luz. Tubos de centrífuga de CD133 para 5 min a 400 x g. Lavar una vez con500 l Aldefluor tampón de ensayo. Resuspender las células en 500 l de tampón de ensayo Aldefluor, respectivamente. </li><li> Filtrar suspensiones en tubos de fondo redondo de poliestireno individuo con tapa filtro celular. Asegúrese de que todo el volumen se filtra a través de la tapa. </li><li> Utilizar un citómetro de flujo para analizar la población celular. Utilice tubos # 1-3 para ajustar los controles de compensación. Utilizando hacia adelante y los parámetros secundarios de dispersión, puerta de las células, asegurándose de excluir los desechos celulares. Establecer células dobles utilizando FL-1 y FL-4 canales, respectivamente ALDH + y CD133 +. </li><li> Utilizando un programa de análisis de citometría, confirman las condiciones de cultivo mejorado el porcentaje de células TIC como las culturas Tic-ricos deberían tener una mayor tinción para estos dos marcadores. NOTA: Además de CD133 y ALDH, otros TIC cáncer de ovario markersof se puede analizar con el número de marcadores usados ​​en cualquier muestra dependen de las capacidades de citómetro de flujo. </li></ol> 5. En vivo </em&gt; subcutáneos Inyecciones para confirmar Tumorigenicidad de poblaciones celulares NOTA: aprobación de la Junta de Revisión Institucional se obtuvo para este protocolo. Distribuir ratones desnudos hembra atímicos 6-8 semanas de edad en grupos experimentales en jaulas de 3 y permitir que se aclimaten durante unos días antes de las inyecciones. Siga ratones bajo directrices experimentales humanas como por NIH Cuidado de Animales y el empleo Comisión; controlar el peso corporal, la apariencia física, incluyendo la pérdida o ganancia de peso superior al 20%, aspecto demacrado, la diarrea o la dermatitis y la eutanasia a los ratones encajan estos criterios por CO 2 asfixia. <ol><li> Reunir culturas como se describe en la sección 2. Resuspender cada población celular en 1 ml de PBS. Contar las células viables mediante ensayo de azul tripán. </li><li> Preparar 15 ml tubos de centrífuga. Para triplicado medidas añaden 1,5 x 10 6 células viables diluidos en 2 ml de PBS en cada tubo (5 x 10 5 células en un volumen de 0,5 ml se inyectaron por vía subcutánea en la derecha flacio de cada ratón). Preparar 0,5 ml de PBS sólo para los ratones de control. </li><li> El uso de agujas 27 G, subcutaneouslyinject 0,5 ml de suspensión de células a partir de cultivos adherentes tradicionales, culturas TIC tradicionales, flotador culturas TiC, o PBS en el flanco derecho de cada uno de 3 ratones por grupo. Ratones Regreso al jaulas originales después de la inyección. </li><li> Pesar los ratones y medir cualquier tumores palpables en dos dimensiones dos veces weeklyby Vernier pinza, el establecimiento de longitud y anchura. NOTA: el tiempo de latencia del tumor es generalmente 20 a 50 días, dependiendo de la línea celular. </li><li> Calcular el volumen de tumor en húmedo por métodos estándar (V = (anchura) 2 x longitud / 2). NOTA: Aunque este estudio se comparó la tumorigenicidad de las TIC frente a las células adherentes de la primera generación sólo, pasada en serie en vivo de las TICs cultivadas bajo condiciones similares ha sido completado por otros 11,20. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El protocolo descrito aquí presenta un método eficiente y consistente para enriquecer cultivos de células con características de células madre a partir de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos y es aplicable a muestras primarias de pacientes. Este método enriquece con éxito para los tics a través de una variedad de líneas celulares. Permite la identificación oportuna de las condiciones que enriquecen a un TIC y / o fenotipo tumorigénico, sin tomarse el tiempo para ordenar físicamente las TICs de los no TICs dentro de la población. De esta manera, los niveles relativos de las diferentes vías de señalización pueden ser evaluados por su contribución al fenotipo TIC mediante la comparación de cultivos adherentes tradicionales para Tic culturas que utilizan una variedad de ensayos funcionales. Si se desea una población pura TIC, el aislamiento se puede conseguir fácilmente mediante la incorporación de un paso de fluorescencia asistida o magnético de clasificación en el protocolo de citometría de flujo. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que la expresión del marcador de TICs, tales como CD133, CD44, o ALDH, puede variar entre líneas celulares o muestras incluso del mismo tipo de tumor de pacientes. Por ejemplo encontramos que las células OVCAR-5 tienen una mayor expresión de CD44 en relación con CD133, mientras que lo contrario es cierto para ACI-23. Por tanto, es pertinente que confiar en la iniciación del tumor en ratones y análisis de citometría de flujo como definitiva de la presencia TIC. Siguiendo este protocolo, actividad alta ALDH fue constantemente observada cuando las células de cáncer de ovario se cultivaron en condiciones de células madre. Curiosamente, la expresión CD133 es consistentemente mayor en las células de ACI-23 cultivadas en condiciones tradicionales de cultivo de TIC, mientras que ALDH es mayor en flotador condiciones TIC. En contraste los TGS-3 células de ascitis primarios muestran un pequeño aumento en CD133 positividad bajo condiciones flotador TIC, pero un aumento notable en la actividad ALDH en condiciones TIC tradicionales. Estos resultados ponen de manifiesto la heterogeneidad de las células del cáncer de ovario y la plasticidad comúnmente asociado con las TICs. Para apoyar aún más la claim que estos métodos mejoran TIC, también se observó el enriquecimiento de TRA-1-60 células positivas. TRA-1-60 es un marcador de pluripotencia y se ha utilizado para identificar carcinomas embrionarios del ovario y testículos, así como cáncer de próstata TICS 30-32. Aunque nuestros métodos han tenido éxito con numerosas líneas de células, es posible que las condiciones TIC estándar pueden ser más adecuado para algunas células de cáncer de ovario, mientras que las condiciones flotador modificados mejor enriquecen para los tics en otras poblaciones de células de cáncer de ovario. De nuevo, esto pone de manifiesto la heterogeneidad esperada dentro de las dos líneas celulares de cáncer de ovario-derivados de pacientes y establecidos. Además de los marcadores de superficie celular hay varios factores de transcripción que se ha demostrado para caracterizar TIC cáncer de ovario incluyendo Nanog, Sox2, Oct-4 11, aunque estos marcadores no son específicos de TIC de cáncer de ovario y más bien representan factores importantes para la pluripotencia de células madre embrionarias y difdiferencia- 33,34. Se examinaron los cambios en los niveles proteicos de estos factores y encontró que los niveles Nanog aumentan en condiciones de cultivo de TIC, de acuerdo con los demás 13,35 así como CD133, TRA-1-60, y CD117. Una matriz de ADNc marcador de células madre humanas mostró además un incremento en los genes CD133, Nanog, Melk y Podxl en las condiciones TIC en comparación con las condiciones adherentes tradicionales. Es importante destacar que, cabe señalar que, como con marcadores de superficie celular, factores de transcripción asociados con tics ováricos pueden variar entre líneas celulares y muestras de pacientes. Hemos observado que las células pueden ser más tumorigénico y expresan niveles más altos de marcadores de células madre si son inherentemente no adherente in vitro (es decir, células que no se adhieren fácilmente a una placa adherente flotante). En cultivo, líneas celulares tales como ACI-23 normalmente tienen muchas células y / o células viables flotantes que crecen verticalmente en una manera de apilamiento bajo Condit cultura tradicionaliones. Aunque el enriquecimiento exitosa de TICs de las células flotantes y agregados podría ser líneas celulares aplicables a relativamente pocos incluidas las del presente estudio y OVCAR-3 12, nuestros hallazgos sugieren que esto podría representar una población más tumorigénico. Por lo tanto, la recolección de la población &quot;flotante&quot; de las células cultivadas en placas de cultivo de tejidos y medios de comunicación estándar puede servir como un método alternativo de enriquecimiento de TIC, para las células que se adaptan mal a los medios de comunicación de células madre comercial. El uso de los diferentes métodos de cultivo que se presentan en este manuscrito permitirá el enriquecimiento rápido de las poblaciones de TIC y una mejor comprensión de cuáles son los factores apoyar este fenotipo en diferentes células. Las aplicaciones actuales de este método incluyen caracterizadora que las vías de señalización son vitales para mantener la propagación de esta población única de células. Los resultados de estos estudios ayudarán a aclarar los mecanismos de progresión del tumor y la recaída.

El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal en los Estados Unidos con la mayor causa de morbilidad y mortalidad de ser las características altamente recurrentes, quimiorresistentes de esta enfermedad. El tratamiento primario por lo general comprende la cirugía de citorreducción máxima y la terapia basada en platino posterior, aunque existe cierta evidencia que sugiere la terapia neoadyuvante podría ser beneficioso en algunos casos 1. La mayoría de los pacientes responden favorablemente al tratamiento primario, pero desafortunadamente la mitad recaerá en 18 meses 2. La mayoría de los tumores malignos de ovario son carcinomas epiteliales y pueden tener su origen en el epitelio superficial del ovario o 3,4 tubo de Falopio. Varios estudios apoyan la existencia de células madre somáticas en el sistema reproductor femenino que, presumiblemente, ayudar en la reparación de los tejidos que se necesita después de la ovulación 5,6. La alta actividad proliferativa, tanto en el ovario y la trompa de Falopio durante ovulación podría ser un factor importante en el desarrollo de cáncer de ovario (Gharwan, et al. manuscrito presentado). La derivación de las células tumorales de formación está claro pero puede surgir a partir de células madre normales, células progenitoras, o células diferenciadas a través de mutaciones que las hacen incapaces de regular la división o el destino. Estas células también se han denominado &quot;células madre del cáncer&quot;, o &quot;células iniciadoras del cáncer&quot;, y pueden crecer en esferoides multicelulares tumorígenos, bajo condiciones de poca fijación. Aunque el modelo jerárquico de desarrollo TIC puede ser dinámico, TICs comparten muchas de las mismas características que las células madre normales, incluyendo la quietud, la resistencia a la quimioterapia, a largo plazo la auto-renovación y la capacidad de diferenciarse en varios linajes celulares 7,8. Varios estudios apoyan la existencia de las TICs en el cáncer de ovario y de los esfuerzos actuales están llevando a cabo para aclarar el mecanismo (s) por el cual estas células apoyan tumorigénesis 9-11. Se han propuesto varios marcadores para identificar TIC de ovario con tumorigenicidad mejorada incluyendo CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, y MyD88, aunque la contribución exacta de cada marcador no está clara y puede ser de tipo celular específico 11-16. Mientras que un marcador universal, o conjunto de marcadores no se ha demostrado de manera inequívoca para TICs ováricos, diferentes grupos han aislado TICs ováricos más comúnmente mediante la selección de CD44 +, CD133 + y / o células con alta aldehído deshidrogenasa (ALDH) actividad 13,17-21. CD44 es una glicoproteína transmembrana que actúa como receptor para el ácido hialurónico y regula varios procesos importantes para la progresión tumoral, incluyendo la adhesión, proliferación, migración, la angiogénesis y la diferenciación 22. CD133 es una glicoproteína transmembrana cuya función todavía no está claro, pero los estudios sugieren que organiza topología de la membrana plasmática 23. ALDH, una enzima intracelular que cataliza la oxidación de aldehídos, puede ser la más universal marcador de TIC como alta actividad ha sido identificada en células madre aisladas de una variedad de tejidos y múltiples funciones han sido atribuidas a ALDH en el apoyo a las células madre normales y los tics 24. A partir de ahora, CD133 y ALDH1 parecen ser los marcadores más reproducibles de TICs ovario 13,21. Además de conocer las características de las TICs, también hay un gran esfuerzo para identificar fármacos que se dirigen específicamente a esta subpoblación. La alta tasa de recaída asociado con el cáncer de ovario puede ser debido al fracaso de las quimioterapias actuales para erradicar con éxito tics. Aunque la mayor parte del tumor es susceptible a las terapias existentes, tics se cree que son resistentes y con una densidad indetectable por métodos estándar. Elucidar los mecanismos de resistencia a la terapia y la recaída del tumor son vitales para mejorar la respuesta y las tasas de supervivencia global de los pacientes con cáncer de ovario. Aquí, las técnicas de cultivo se describen ésimoa enriquecer para los tics de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos y primarios. Las condiciones de cultivo descritas en el presente documento se han usado por varios grupos para inducir la propagación de células tics o esferoide con cualidades de células madre 11,12,14,16,20. Aunque hay varios medios de cultivo de células madre y suplementos comúnmente usados ​​para enriquecer TIC / esferoides se utilizó una fórmula medios libres de suero con EGF y FGF, pero sin la adición de B27 o N-2 suplementos. Estos suplementos, comúnmente utilizados para el cultivo celular neuronal y enriquecedora para las células madre, se han demostrado para promover un fenotipo mesenquimal 25,26 y hay cierta incertidumbre en el campo de si TIC que tienen un fenotipo mesenquimal o epiteliales son más tumorigénico 27-29 . Para minimizar las incertidumbres y las variables se optó por utilizar la fórmula más común, ya que se trata de células de cáncer de ovario epitelial. El mantenimiento de las células en medio libre de suero en un matraz bajo adjuntofacilita la formación de esferoides y apoya la propagación de células con expresión CD133 y alta actividad ALDH. Nuestro trabajo ha puesto de manifiesto, además, que las células flotantes en condiciones normales adherentes también pueden representar una población TIC más tumorigénico. La inyección de células cultivadas en estas condiciones en ratones desnudos atímicos conduce a un mayor potencial tumorigénico en comparación con las células cultivadas en condiciones adjuntas en presencia de suero. Mucha información sobre el papel de las TICs en la iniciación del cáncer ovárico, la progresión, la respuesta terapéutica, y la recaída de la enfermedad puede ser adquirida a través de la utilización de estas técnicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:308px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:104px;">83.1813.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Aldefluor Kit</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:104px;">1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">CD133-APC</td>
			<td style="width:191px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:104px;">130-090-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F0291</td>
			<td>Prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Epidermal Growth Factor - human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E9644</td>
			<td>Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium)</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:104px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:191px;">Gemini</td>
			<td style="width:104px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron)</td>
			<td style="width:191px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro enrichment of ovarian cancer tumor-initiating cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

Establecido líneas celulares de cáncer de ovario y una línea celular de ascitis primaria cultivada en condiciones de cultivo tradicionales adherentes en la presencia de suero espectáculo adjunta, la morfología de adoquines, mientras que las mismas células cultivadas en condiciones de cultivo TIC pantalla flotante morfología esferoidal, común en las poblaciones de TIC. Imágenes de campo claro mostradas en la Figura 1 A muestran claramente las diferencias morfológicas en las condiciones de cultivo. La Figura 1B muestra las morfologías diferenciadas obtenidos después de resiembra las ACI-23 y TGS-3 culturas TIC en condiciones adherentes tradicionales. Sólo 24 hr después de la siembra de nuevo en condiciones adherentes, la mayoría de los esferoides multicelulares se disocian y se adhieren a la superficie, se asemeja a las células adherentes típicas. Para verificar que las condiciones TIC enriquecen de células con marcadores de células madre de citometría de flujo se realizó un análisis utilizando dos marcadores comunes de TICs de ovario - CD133 expression y la actividad de ALDH. Las gráficas de puntos que se muestran en la Figura 2 A resaltar el aumento del porcentaje de células CD133 + en poco apego, condiciones libres de suero. Del mismo modo, la actividad de la enzima ALDH es mayor en estas condiciones en comparación con condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Aunque los cultivos adherentes tradicionales contienen células CD133 +, los incrementos porcentuales en condiciones que mejoran la formación de esferoides. Análisis de un marcador de pluripotencia, TRA-1-60, se presta más apoyo que las condiciones TIC enriquecen de TICs, Figura 2 B. La cuantificación de la Figura 2 C demuestra que (CD133 + ALDH +) ACI-23 células doble positivas se limitan en gran parte a los cultivos que crecen bajo condiciones que mejoran TIC. También se examinaron los cambios en los niveles de proteína de diferentes factores de transcripción que se producen en las células de ACI-23 después de cinco días de cultivo en las condiciones TIC. Un aumento progresivo de cada uno de el marcadors se ve desde lo tradicional a flotador condiciones TIC en comparación con los niveles relativamente bajos observados en el cultivo adherente, Figura 2 D. Curiosamente una línea celular humana ascitis crecido en las diversas condiciones muestra el fenotipo marcador más alto que las condiciones TIC tradicionales con poca o ninguna tinción presente en las condiciones TIC flotador, la Figura 2 E. La tumorigenicidad de las condiciones de cultivo TIC se validó a través de inyecciones subcutáneas de números iguales de células viables obtenidas a partir de todas las condiciones en cohortes de ratones desnudos atímicos. La Figura 3 demuestra que ACI-23 (A, B) y OVCAR-5 (C) células de cultivos adherentes tradicionales fueron menos tumorigénicas que los de las culturas TIC. Tenga en cuenta que las culturas TIC flotantes producen tumores más grandes en un período corto de tiempo que las culturas tradicionales TIC adherentes o tradicionales. Estos data sugieren que incluso con un modesto aumento en los marcadores de TIC de ovario, hay un cambio fenotípico dramático. Sin embargo, con otras líneas celulares (no se muestra) las culturas TIC tradicionales eran más tumorigénico de las células del cultivo TIC adherentes y flotador tradicionales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> Figura 1. Esferoide de desarrollo en diferentes condiciones de cultivo. (A) de la empresa de ovario líneas celulares de cáncer de células primarias derivadas del paciente ascitis (TGS-3) obtenidas en matraces de fijación con bajos libre de suero (ACI-23, OVCAR-5 y Caov3) y tallo medio celular forma fácilmente esferoides multicelulares. Las imágenes muestran las condiciones de cultivo adherentes tradicionales mantienen la morfología de adoquines epitelial en ACI-23, OVCAR-5, Caov3 y TGS-3 células, mientras que las mismas células formadas esferoides dentro de las 96 horas en condiciones de TIC. Barra de escala 100 micras. (B) Tras la exposición de 24 horasa condiciones de cultivo adherentes tradicionales, las morfologías de cultivo TIC muestran un fenotipo diferenciado se asemeja a la morfología original de adherente. Barra de escala 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> Figura 2. Baja-apego, condiciones libres de suero para enriquecer células con marcadores de TIC. (A) análisis de citometría de células ACI-23 utilizando APC conjugado anticuerpo CD133 flujo demuestra un aumento del porcentaje de células CD133 + en frascos bajos de apego con tallo sin suero medios de comunicación celulares. Utilizando análisis de citometría de flujo muestra de ensayo Aldefluor aumento de la actividad ALDH en células cultivadas en matraces bajas de fijación con los medios de células madre libre de suero. Control negativo CD133 no contiene anticuerpos y con negativo ALDHcontrol es el sustrato activado en presencia del inhibidor de ALDH (DEAB). (B) Análisis utilizando FITC conjugado anticuerpo TRA-1-60 muestra mayor porcentaje de células TRA-1-60 + en los flotadores condiciones TIC en ACI-23 células. El control negativo no contiene anticuerpo. (C) CD133 + ALDH + células son las más altas en el tradicional TIC y flotador condiciones TIC en la línea celular de ACI-23. Las barras de error: SEM, n = 6, * p &lt;0,05. (D) Análisis de transferencia de Western que muestra aumento en los niveles de proteína de marcadores transcripcionales de las células madre en las células ACI-23 cultivadas en condiciones TIC durante 5 días. Lisados ​​de células enteras (50 g) se analizaron con GAPDH como control de carga. (E) gráficos de puntos representativos de TGS-3 células de ascitis primarios analizados como en A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. Low-apego, condiciones libres de suero enriquecen para las células con un aumento de la tumorigenicidad. (A) 5 x 10 5 ACI-23 células viables se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos por triplicado. Los ratones se pesaron y se midieron los tumores mediante un calibre dos veces por semana. A = cultura tradicional adherente, cultura F = Flotante TIC, la cultura S = tradicional TIC. * P &lt;0,05. (B) Imágenes representativas de los tumores formados a partir de ACI-23 después de 25 días usando células cultivadas bajo diferentes condiciones de cultivo. (C) 5 x 10 5 células viables OVCAR-5 se inyecta por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos por triplicado y monitoreado como en A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

13.7K vistas.  National Cancer Institute. Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema para el Estudio de latencia del tumor y el salto hacia el crecimiento metastásico

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Investigación

Medicina

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Ensayo in vitro Liquidación mesoteliales que modela los pasos iniciales de la metástasis del cáncer ovárico

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotípicos tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

Aislamiento libre de marca y el enriquecimiento de las células a través Contactless Dielectroforesis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

El enriquecimiento de las células madre quimiorresistente cáncer ovárico de líneas celulares humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.