La co-inmunoprecipitación multiplexada cuantitativa, o QMI, permite a los usuarios medir simultáneamente cientos de interacciones binarias en una red de interacción proteica predefinida. Mediante la realización de múltiples co-IP simultáneamente en el mismo izado, las técnicas bioinformáticas pueden examinar cómo cambian los grupos de asociaciones conjuntas de manera coordinada. El ensayo requiere mucho tiempo para desarrollarse, pero una vez que el panel QMI está en la escala de red de mano, los datos se pueden recopilar sobre los sistemas de transducción de señales en un ensayo relativamente simplemente nocturno.
QMI requiere el pipeteo preciso de diferentes muestras y reactivos en placas de 96 pozos. Se deben tomar notas cuidadosas al configurar y ejecutar cada ensayo para evitar errores. Para la preparación de muestras y la inmunoprecipitación, comience por la lesión de la muestra en un detergente adecuado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa para una incubación de 15 minutos sobre hielo.
Al final de la incubación, gire hacia abajo la muestra para eliminar las membranas y los desechos y realice un ensayo de BCA en el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas de acuerdo con los protocolos estándar. Después de normalizar las concentraciones de proteínas, prepare una mezcla maestra de cuentas magnéticas que contenga aproximadamente 250 cuentas magnéticas de cada clase por pozo. Utilice la separación magnética para lavar la mezcla magnética de perlas dos veces en el búfer Fly P antes de resuspender las perlas en 20 microlitros de búfer Fly P por muestra.
Después de un pipeteo exhaustivo, aliquot 20 microlitros de perlas en un tubo de microcentrífuga helada por muestra y añadir volúmenes iguales de izado con concentraciones de proteínas normalizadas a cada tubo para inmunoprecipitación. A continuación, divida cada muestra de lisato en un tubo para cada placa que se está ejecutando e inmunoprecipita las muestras en un rotador a cuatro grados Celsius durante la noche protegido de la luz. A la mañana siguiente utilice un estante magnético para eliminar el suaveato del primer conjunto de tubos y lavar las cuentas dos veces en 500 microlitros de lúdico frío Fly P buffer por lavado.
Después de calcular el volumen de resuspensión, resuspender los inmunoprecipitados en el volumen calculado de lampló la mosca P fría. Resuspender a fondo las cuentas magnéticas mediante pipeteo suave y distribuir 25 microlitros de cuentas por pozo a través de una placa plana de 96 pozos sobre hielo. En una placa de 96 pozos diferente, diluir mediante anticuerpos de sonda attinilated a una concentración de trabajo dos veces mayor.
Utilice una pipeta multicanal para distribuir 25 microlitros de cada dilución de anticuerpos de sonda en los pocillos apropiados de la placa de ensayo magnética que contiene la placa de ensayo y agitar a alta velocidad en un agitador de placa horizontal para mezclar y resuspender las perlas magnéticas. Después de mezclar, reduzca la velocidad durante una hora de incubación a cuatro grados Centígrados protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave la placa tres veces con el tampón Fly P fresco por lavado en una arandela de placa magnética a cuatro grados centígrados.
Después del último lavado, resuspender las perlas en 50 microlitros de estreptavidina PE diluido de uno a 200 en tampón Fly P. Agitar la mezcla y resuspender las perlas antes de incubar la placa a cuatro grados Celsius durante 30 minutos protegido de la luz. Al final de la incubación, lave la placa tres veces con el amortiguador Fly P en una arandela de placa magnética a cuatro grados Celsius y resusppend las perlas en 125 microlitros de tampón Fly P.
Agitar la placa durante un minuto a 900 rotaciones para resuspender a fondo las perlas y cargar la placa en un citómetro de flujo repusido. En el software de citometro de flujo, seleccione El ajuste de destino de alto RP1, una condición de parada de 1.000 perlas por región y un volumen de muestra de 80 microlitros. Detenga la carrera a mitad de camino y resusppend las cuentas para evitar el asentamiento.
Al final de la ejecución, exporte los archivos de datos en formato XML. Para realizar el análisis ANC, rellene el archivo de entrada ANC para reflejar los detalles del diseño experimental y ejecute el programa, que escribirá un archivo CSV en el directorio activo. El archivo que termina en hits.
csv informará de las asociaciones proteicas que son significativamente diferentes en un nivel falso positivo de 0,05 entre las condiciones de control y experimental en al menos tres de cuatro réplicas experimentales. Para el análisis de red de correlación ponderada, pegue los títulos de columna de la salida del archivo de datos por Matlab que termina en mfi. csv en la primera columna de una nueva hoja de cálculo y agregue las columnas Experimento para el número de experimento y Tratamiento para el tratamiento experimental y cualquier otra variable a analizar.
Guarde este archivo como rasgos. csv y abrir R Studio. Establezca el directorio de trabajo en una carpeta que contenga el mfi.
csv y rasgos. csv, resalte secciones de código y pulse Comando Intro para ejecutar los comandos de R como se indica en el archivo de comandos comentado. Los módulos de análisis de red de correlación ponderada significativamente correlacionados con cada rasgo experimental se mostrarán como un archivo gráfico y la correlación de cada interacción con cada módulo se mostrará como un archivo CSV.
Para cada interacción en el archivo de salida ANC, identifique si esa interacción también es significativa por CNA y cree una nueva columna que indique si cada acierto ANC es también un golpe CNA. Convierta los valores para registrar dos cambios de plegado y calcule el valor promedio para todos los hits CNA de unión ANC. Por último, haga una nueva hoja de cálculo con cada CNA de unión ANC que se vea listada por su objetivo de inmunoprecipitación en una columna, su objetivo de sondeo en la segunda columna y su valor de cambio de pliegue en la tercera columna.
Importe este archivo en Cytoscape como red para crear un diagrama de borde de nodo. Las interacciones de proteínas de alta confianza identificadas por los dos enfoques estadísticos independientes se visualizan como diagramas de borde de nodo utilizando el software de código abierto, Cytoscape, o como mapas de calor utilizando el código R y las instrucciones de análisis incluidas en el material complementario. A lo largo del protocolo, los usuarios deben tener cuidado con la pipeta con precisión, mantener registros meticulosos y mantener las muestras frías en todo momento.
Hemos utilizado QMI para entender cómo las vías de transducción de señales diferencian entre diferentes tipos de entrada e integran información de múltiples receptores.
