Este trabalho foi financiado por doações do Wellcome Trust e BBSRC a IG. IG é um Wellcome Senior Fellow.

1. Geração e Passaging de linhas celulares marcadas com SILAC Nota: o uso de Tripsina-EDTA deve ser evitada em todas as fases de passaging e preparação de amostras para análises experimentais como a tripsina pode conter aminoácidos não marcados, o que levaria a marcação incompleta de amostras. <ol><li> Para preparar um frasco de meios SILAC adicionar uma alíquota de 0,5 ml de uma arginina apropriadamente SILAC-marcado (84 mg / ml em PBS) e lisina (146 mg / ml em PBS) a um frasco de 500 ml de Arg / Lys DMEM livre (contendo L-glutamina). </li><li> Em seguida, adicionar 50 ml de FBS dialisado e 5 mL de penicilina / estreptomicina a garrafa de 500 ml. Nota: as células HEK 293T (ATCC), devem ser mantidas em meio DMEM sem arginina e lisina e suplementada com luz (R0K0), médio (R6K4) ou pesado (R10K8) aminoácidos, soro fetal de bovino dialisado (corte de 10 kDa), e penicilina / estreptomicina. As células devem ser mantidas em meio para um mínimo de cinco divisões celulares para assegurar a completarotulagem. Na maioria dos casos, as células são prontamente marcado no ≥ 2 semanas. </li><li> Para dividir células para passaging, as células devem ser desalojado do monocamada por bater o frasco. As alternativas incluem a utilização de raspadores de células ou por utilização, tampão de dissociação celular com base em PBS livre de enzima. Nota: Para conservar a mídia, as células devem ser repicadas em frascos T25 e número de células maiores gerado apenas imediatamente antes de um experimento. </li><li> 24 horas antes da transfecção de células, as sementes de 3,5 x 10 6 células marcadas com SILAC em um único prato de 10 cm2 para cada condição experimental em investigação. </li></ol> 2. Transfecção de células marcadas com construções pEGFP-fusão <ol><li> Remova a mídia das células e substituí-lo com 9 ml de livre de antibiótico SILAC DMEM mídia (leve, médio ou pesado). Nota: Os antibióticos não deverá ser adicionado ao meio, uma vez que podem interferir com a eficácia de reagentes de transfecção à base de lipossomas. </li><li> Prepare uma mistura de 10 mg do plasmídeo apropriado (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) em 500 mL de antibiótico-livre SILAC DMEM e misture com 500 mL de DMEM SILAC sem antibiótico contendo 10 ul de reagente de transfecção (por exemplo, lipofectamina 2000). Misture a reação completamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Incubar a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 20 min e em seguida adicionar gota a gota para a monocamada de células. Balance a placa suavemente de um lado para o outro. </li><li> Incubar as células transfectadas a 37 ° C e 10% de CO 2 durante 24 horas. Nota: Se a expressão de uma proteína de interesse resulta em qualquer toxicidade aparente, então pode ser necessário para reduzir a quantidade de plasmídeo transfectado e / ou a duração do período subsequente expressão. </li></ol> 3. Colheita lisados ​​celulares <ol><li> Células colheita do prato em PBS gelado usando um raspador de células. Recolher as células por centrifugação a 220 xg, a 476; C durante 5 min. Lave as células uma outra 3x em 10 ml de PBS gelado. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de tampão de lise celular (10 mM de TrisCl / pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, NP40 a 0,5%) contendo recentemente adicionado cocktail de inibidores de protease de III na concentração de RNase e 1x cocktail (opcional) em 5 ul por ml. Nota: Para as proteínas com ácido nucleico conhecida actividade de ligação, pode ser necessário adicionar nucleases para o lisado antes da precipitação. Nos casos em que é adicionado a nuclease, as amostras devem ser incubadas em gelo durante 30 minutos em gelo, com pipetando a cada 10 min. Extração de ácidos nucleicos totais a partir de uma pequena fração da amostra e análise por eletroforese em gel de agarose pode testar a eficácia da nuclease. </li><li> Centrifugar as amostras a 13.000 xg, 4 ° C durante 10 min reter o sobrenadante como o ligado celular solúvel. </li><li> A concentração do ligado celular devem ser avaliadas por ensaio BCA de acordo com as instruções do fabricante. </li><li>Utilize tampão de lise contendo mistura de inibidores de protease de III para normalizar a concentração de proteína num volume final de 500 ul. </li><li> Ajustar o volume para 1 ml com a adição de 500 ul de tampão de diluição (10 mM de TrisCl / pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM) contendo mistura de inibidores de protease de III na concentração final de 1x. Uma alíquota de 50 ul da amostra deve ser retida como a entrada de amostra e o lisado mantido em gelo enquanto se prepara os grânulos de anti-GFP (por exemplo, GFP-armadilha). Nota: os rendimentos variam tipicamente entre 1-3,5 mg de proteína na final de 1 ml de amostra. Embora os tampões acima são adequados para muitas proteínas com interesse, para os outros, pode ser necessário modificar os componentes do tampão para garantir a proteína isco é solubilizado e para manter as interacções proteína-proteína. Alterações possíveis incluem o agente tampão (fosfato, HEPES), a concentração de sal (150-500 mM), a escolha do detergente, ou outros aditivos. </li></ol> 4. Ligação para Anti-GContas PF <ol><li> Resumidamente vortex a suspensão do grânulo para voltar a suspender as contas. Usando uma pipeta de ponta de 200 ul com a extremidade cortada, transferir 25 ul de pérolas por amostra para um tubo fresco. Nota: O usuário deve preparar as contas para um único experimento SILAC como mastermix para minimizar a variação de amostra-a-amostra. </li><li> Para cada 25 ul de suspensão de grânulo, adiciona 20 volumes (1500 mL por 75 pasta ul) de tampão de diluição, e centrifuga-se as esferas a 2700 xg durante 5 min. Em seguida, lavar as contas umas 2x em 20 volumes de tampão de diluição. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de diluição de por 25 ul de suspensão de esferas. Utilizando uma ponta de 200 ul com a extremidade cortada, transferir 85 ul desta suspensão de ressuspenso para cada uma das amostras marcadas com SILAC do passo 3.6. </li><li> Incubar as amostras com os grânulos num rotor, a 4 ° C durante 2 horas. </li></ol> 5. Lavar roupa, eluição e Preparação de Amostras para Análise de MS <ol><li> Amostras centrifugar a 2.700 xg, 46; C durante 5 min. 50 ul do sobrenadante deve ser retida como a amostra não ligada, com o restante do sobrenadante descartado. </li><li> 1 ml de tampão de diluição deve ser adicionada a cada tubo para ressuspender as esferas e a amostra centrifugada a 2700 xg, a 4 ° C durante 5 min. O sobrenadante deve ser rejeitado. Este deve ser realizado duas vezes. </li><li> Eluir a proteína a partir das pérolas por meio da adição de 50 ul de tampão de carregamento 2 x SDS, e aquecimento a 95 ° C durante 10 min. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 2700 xg durante 2 min a 4 ° C </li><li> Reter o sobrenadante em tubos pré-lubrificadas, onde ele pode ser, em seguida, armazenados a -80 ° C até ser necessário. Para a submissão a uma instalação de espectrometria de massa, misture as amostras rotuladas 01:01:01 (por exemplo, 10 ml de cada) e enviar a amostra mista. Nota: Neste ponto, as amostras podem ser testadas por western blot,-coloração com prata ou por outros meios para testar a interacção com os parceiros de ligação conhecidos / desconhecidos. Um exemplo é dado na figuraure 2 que mostra a ligação específica de um parceiro conhecido interacção - eIF4G por western blot, e o aparecimento de bandas de coloração de prata presentes em amostras suspensos a partir de uma proteína de interesse, mas não é uma amostra de controlo. </li><li> Enviar amostra para análise LC-MS/MS. Nota: uma vez convencido de que uma proteína de interesse é marcado parceiros de interação, volumes iguais de cada amostra marcada (leve, médio e pesado) são combinados e submetidos para análise LC-MS/MS com sucesso vinculativo. É usual para apresentar 30 ul total de uma amostra para a análise de IP. Isso implicaria misturar 10 ml de amostra Light-rotulados com 10 ml de amostras pesadas marcado com 10 ml marcado médio e para dar um total de 30 mL. </li></ol> 6 Análise de Dados I:. Compreender os resultados, e Remoção de Identificações de baixa confiança Nota: A lista de títulos de coluna retornados pelo software Proteome Discoverer é dada na Tabela 1 Dif.software ferentes (por exemplo, MSQuant, MaxQuant) voltará diferentes posições, no entanto, apenas um subconjunto destes é necessária para a análise e estes são comuns aos diferentes pacotes de software. Os dados devem incluir sempre um número de acesso para cada proteína identificada, relação de comparação de cada relação de amostra (luz vs médio, leve vs pesado, médio vs pesado etc), o número de peptídeos únicos identificados, e alguma forma de taxa de falsos positivos ou indicação confiança. <ol><li> Antes de atravessar os dados, primeiro copie os dados brutos para uma nova planilha. A partir desta planilha remover todas as colunas, exceto aquelas que dão o número de acesso, número de peptídeos exclusivos, índices que comparam amostras, relação de variabilidade, bem como a descrição da proteína. Se experimentos réplicas foram realizadas, estas devem ser combinados em um único arquivo de Excel, com cada experiência que aparece em uma guia separada. Nota: Os dados de baixa confiança inclui proteínas identificadas por apenas um único péptido original, e aqueles waqui quantificação não foi possível. </li><li> Use a função de &#39;tipo&#39; Excels &#39;para ordenar os dados pelo número de peptídeos e remover as entradas para as proteínas que faltam mais de um peptídeo. Depois classificar por relação e remover as proteínas que não possuem relações SILAC (proteínas não quantificadas). </li><li> Converta índices SILAC a um log de ​​dois valores usando a fórmula: &#39;= log (Taxa SILAC, 2)&#39;, onde &#39;Razão SILAC&#39; é substituído pelo identificador da célula. Observação: Como rácio SILAC resultados em todos os dados para as proteínas que mostram uma redução na abundância sendo restrito aos valores entre 0 e 1, que é habitual para converter uma relação a uma relação SILAC SILAC registo 2, como isso significa que as proteínas, tanto aumentada ou diminuída em uma amostra são representados em uma escala logarítmica, onde 2 ou -2 representa um aumento de 4 vezes ou diminuição da abundância, e 3 ou -3 um aumento ou diminuição na abundância, respectivamente de 9 vezes. Após essa transformação, os dados devem atender a uma Gaussian distribuição centrada em torno de um rácio de log 2 SILAC de 0. Um exemplo disto é dado na Figura 3. </li><li> Criar novas colunas no arquivo excel e calcular log 2 proporções SILAC para todas as amostras / colunas simulados. Para a conversão de uma relação falsa / amostra a uma relação amostra / simulada, usar a fórmula: &quot;= 1/ratio&quot; </li></ol> 7 Análise de Dados II:. Seleção Interações grande confiança para Estudo <ol><li> Abrir Graphpad Prism, selecione Novo&gt; Tabela de Dados e Gráfico ... &#39;coluna&#39; Selecione na lista no lado esquerdo da janela, e selecione os dados Digite / Importação&gt; Digite os valores de réplicas, empilhados em opções de colunas. Pressione &#39;Criar&#39;. </li><li> Selecione e copie um determinado log 2 Amostra / Mock SILAC coluna proporção da planilha Excel para o novo arquivo Prism. </li><li> Clique no menu drop-down &#39;Inserir&#39; e selecione &#39;Nova análise &quot;. Sob análise coluna selecione &#39;Distribuição de freqüência &#39;. Manter as opções padrão, clique em &#39;OK&#39;. Nota: Este passo gera um histograma que ilustra o número de proteínas identificadas numa dada proporção. Isso deve formar uma distribuição de Gauss. </li><li> Na pasta &#39;Resultados&#39; uma nova seção &quot;Histograma&quot; terá sido gerado. Selecione a seção de distribuição de freqüência. </li><li> Clique no menu drop-down &#39;Inserir&#39; e selecione Novo análise&gt; XY&gt; regressão não-linear (ajuste de curva). Clique em &#39;distribuição de Gauss&#39; e clique em OK. Nota: Este passo encaixa uma curva aos dados da distribuição de frequências geradas na etapa 7.3, obtendo-se os valores que podem ser posteriormente utilizadas para calcular os limiares de significância. </li><li> Na janela de resultados que aparece, a média eo desvio-padrão são dadas. Gerar um limite, adicionando 1,96 desvios-padrão da média. Nota: Estes valores representam as médias e desvios-padrão da dist Gaussianribution, não o conjunto de dados total. 1,96 desvios padrão iria colocar um limite no limite de confiança de 95% (p ≤ 0,05). 2,58 SD daria 99%, e 3,3 SD 99,9%. O limite deve ser determinado individualmente para cada experimento réplica, pois pode variar. </li></ol> 8 Análise de Dados III:. Mesclando Datasets Replica Nota: Para ter a certeza na identificação de parceiros de interação um SILAC suspenso experiência típica idealmente deve ser realizado três vezes, com o meio e as amostras pesadas rotulados comutada para uma das repetições para o controle de qualquer efeito da mídia sobre os resultados. Uma proteína que se mostra como interagindo em pelo menos duas das três experiências, com o &#39;amostra switched&#39;-mídia idealmente representando um destes, é uma interacção de alta confiança. <ol><li> Retornar para o arquivo Excel, criar uma nova guia chamada &#39;Combinado&#39;. Coluna Etiqueta A &#39;adesão&#39; e copie todos os números de acesso de cada um of as experiências individuais em esta única coluna. </li><li> Selecione a guia &#39;Dados&#39;, e em seguida a opção &quot;remover duplicatas &#39;. </li><li> Criar colunas para as relações SILAC e variabilidade proporção de cada experimento, bem como para o nome / descrição da coluna de proteína. </li><li> Na aba descrição, usar a fórmula PROCV para coletar a descrição de cada número de acesso. Arrastar a fórmula para baixo na coluna para preencher na descrição da proteína. A fórmula PROCV é: &quot;= PROCV (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)&quot;, onde: AccessionNo é de R $ aX com X sendo o número da linha WheretoLook é o &quot;guia Experiment Name &#39;$ A $ 2:.! $ Y $ Z, onde Y e Z são a parte inferior direita de dados sobre a planilha que está sendo referenciado. ColumnsAccross é o número de colunas em frente ao núme adesãober na coluna A um valor desejado se encontra. Nota: Por exemplo, se o número de acesso é na coluna A, e os dados de interesse situa-se na coluna E. O valor aqui seria de 5 (coluna A conta como 1). Como os números de adesão foram reunidas no passo b, o mais provável é que não vlookup obter todos os nomes requeridos de uma experiência. Quando ele retorna N / D, modificar a fórmula para se obter a descrição de cada experiência, por sua vez, até todas as descrições são adquiridas. </li><li> Para destacar a interação de proteínas no conjunto de dados combinados, selecione cada coluna individualmente relação e clique na guia Início, seguido por regras células Formatação Condicional&gt; Destaque&gt; Mais regras. </li><li> Selecione o estilo &#39;clássico&#39;. Formatar apenas células que contêm &#39;value celular&#39;, &#39;Maior ou Igual &quot;. Na caixa, digite o valor do desvio padrão de 1,96 e clique em &#39;OK&#39;. </li><li> Avaliar a variabilidade proporção para cada interação positiva. Se subtraindo o% varESPONSABILIDADE cairia um &#39;hit&#39; abaixo do valor limite, isso deve ser tratado com cautela. Nota: Este representa o quão consistente os índices individuais para cada peptídeo que, juntos, compõem uma proporção SILAC &#39;as proteínas são, e é dada como uma porcentagem. Quando a relação de variabilidade é tida em conta e uma proteína dá uma proporção SILAC acima do limiar, a proteína representa uma batida. Se a variabilidade proporção dá um intervalo que fica abaixo do limiar, a &#39;batida&#39; pode representar um contaminante. </li><li> Repita esse procedimento para cada uma das colunas de resultados e comparar através de experimentos. Destaque proteínas identificadas em dois ou mais experimentos representam uma interação de alta confiança. Nota: Dependendo do banco de dados utilizado para atribuir números de adesão de proteínas, em diferentes experimentos uma proteína pode ter sido identificado com um nome diferente, ou até mesmo vários números de adesão. É importante verificar isso para garantir que as proteínas não são acidentalmente omitido. </li&gt; </ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A estratégia suspenso SILAC descrito aqui representa um meio muito sensíveis e poderosos de detectar nova proteína: interações proteína, e, além disso, permite que a discriminação rápida e simples de padrões de ligação entre as amostras alteradas estreitamente relacionadas de interesse. Neste exemplo, esta técnica foi utilizada para investigar a relação proteína: interacções proteicas das proteínas eIF4AI e eIF4AII 6. Para o conhecimento do autor, este é o primeiro estudo na literatura explorando a utilidade da proteômica SILAC para investigar o interactome celular destas duas isoformas de eIF4A. A abordagem descrita acima utiliza um GFP-tag e anti-GFP grânulos 9, 10 e, por conseguinte, as modificações podem ser necessárias para permitir que esta abordagem para ser utilizado para uma proteína específica de interesse, por exemplo, se a marca é colocada na extremidade N-ou C-terminal de uma proteína. Sempre que possível, Western blot ou ensaios funcionais devemser realizados para detectar a ligação de um parceiro de interacção proteína conhecida. Se uma proteína não tolerar fusão com a tag GFP, outra marcação ou estratégias suspensos foram aplicadas a pulldowns SILAC usando as duas outras tags (Flag 11, Biotina 12, STREP (dados próprios, não publicado)), ou usando anticorpos primários contra uma proteína de interesse onde siRNA knockdown da proteína-alvo fornece uma amostra de controlo 13. Tais experiências têm sido descritos em outros lugares na literatura, mas em breve, passo 1, e as etapas de 5,4-8 seria aplicada como acima, com passos 2-5,3 modificados conforme apropriado para o sistema de expressão / suspenso de escolha da utilização de factores de proteínas iguais como descrito em os passos 2,4-2,5. À medida que as fases de quantificação permitir proteínas de ligação não específicas a serem removidos no nível de análise, recomenda-se omitir a pré-incubação com esferas de controlo, ou lavagens elevados de sal, a fim de preservar a proteína de baixa afinidade: interacções de proteína com uma proteína de interesse . A ma nucleasey ser incluído ou omitido a partir deste protocolo de acordo com as especificidades de uma experiência particular. Por exemplo: como as proteínas utilizadas neste método são as helicases de RNA, RNase cocktail foi incluído no protocolo para remover interacções indirectas mediadas através do ARN (passo 3.2). Em alguns casos, no entanto, não pode ser beneficiar realizando experimentos paralelos com e sem nuclease para identificar ácidos nucléicos interações dependentes. Dentro deste protocolo, a troca de amostras &quot;pesados&quot; em experiências idênticas, &quot;médio&quot; e é recomendado para controlar a variação introduzida por diferenças nos media SILAC ou crescimento celular. Um controle alternativo envolve a troca sequencial de todos os três (&#39;light&#39;, &#39;médio&#39; e &#39;pesado&#39;) de mídia em experimentos de réplica. Enquanto esta abordagem é potencialmente mais rigorosas, que faz aumentar a complexidade da análise, tal como em, pelo menos, uma réplica, uma proteína de interesse wdoente ser produzida em células marcadas &quot;light&quot; e por isso é necessário fazer a distinção entre proteínas consistentemente identificados em amostras de &quot;light&quot; (contaminantes ambientais, como a queratina), e aqueles que só são enriquecidas em amostras &quot;light&quot;, quando ligado a uma proteína de interesse. Embora o uso de dados permite a discriminação de quantificação específicos do de interacções não específicas através da utilização de um limiar, inevitavelmente algumas interacções genuínas pode ser descartado. A abordagem acima é uma abordagem simples e rápido para identificação de proteína: interações proteína que pode ser facilmente tentados por pesquisadores com nenhuma experiência anterior com espectrometria de massa, ou de análise de grandes conjuntos de dados de interação proteína: proteína. Para a maioria das utilizações este é mais do que suficiente para a identificação de novas proteínas de interesse. Outras modificações para essa abordagem para ajudar a reduzir a perda de dados são descritos em outro lugar na literatura e incluem o uso de um prbiblioteca freqüência otein onde conhecido proteínas contaminantes para um conjunto específico de parâmetros experimentais (linha celular, matriz talão, condições buffer) podem ser excluídos 10, 14. No entanto, dependendo das condições experimentais particulares, pode ser necessário executar uma série de experiências de controlo para gerar um proteoma do grânulo e, por conseguinte, este pode aumentar tanto o custo e complexidade do experimento. Mais informações sobre esta técnica está disponível no site da www.peptracker.co.uk 14. Deve também notar-se que o protocolo descrito acima envolve a mistura de amostras marcadas de forma diferente no final do processo de imunoprecipitação (denominada uma Mistura Após Purificação - MAP SILAC experimento). Isto é feito como proteína: interacções de proteínas ocorrer num determinado equilíbrio 15. Deve notar-se que outros grupos combinaram esta abordagem MAP SILAC descrito neste protocolo com a incubação das amostrasantes de suspenso (Purificação Após mistura - PAM SILAC) para diferentes períodos de tempo (de 20 min a 2 h foram utilizados na literatura) 15, 16. Com base em como rapidamente uma proporção de proteína de gotas em relação de 1:1, é possível investigar qualitativamente afinidades de ligação e para definir as proteínas como as proteínas que interagem estáveis ​​ou dinâmicos 15. Em resumo, pulldowns SILAC representar um meio muito poderoso de identificação de proteínas que interagem com uma dada proteína de interesse, em um ambiente fisiologicamente relevante. A técnica pode ser muito facilmente adaptado a um certo número de diferentes estratégias de purificação, o que permite a sua aplicação a qualquer proteína de interesse. A quantificação dos resultados simplifica grandemente a identificação de interacções genuínos, e permite o relaxamento das condições do tampão utilizado para remover rigorosas ligantes não específicos, e assim preserva as interacções de baixa afinidade. Como até três amostras pode ser comparado, em que precedeestratégia, a técnica tem pontos fortes claras na comparação diferenças na proteína de ligação entre as diferentes isoformas de proteínas, proteínas mutantes, ou o efeito de inibidores farmacológicos. Como fatias inteiras de gel são analisados ​​em vez de bandas individuais que mancha de Coomassie, o número de proteínas identificadas em alta confiança são normalmente mais elevados do que aqueles identificados em uma GST / TAP-suspenso padrão, e experimentador viés na seleção de proteínas de interesse é removido. Assim, a técnica compara muito favoravelmente com outras técnicas comumente usados ​​utilizados na identificação de novos proteína-interações (levedura 2-híbridos, GST / His ou TAP Pulldowns).

Um passo essencial para a compreensão da função das proteínas é a identificação de proteínas que interagem relevantes. Quando essas proteínas são desconhecidos, há uma série de técnicas disponíveis, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens. Estes incluem o sistema de leveduras duplamente híbrido, utilizando ensaios de pulldown proteína recombinante, bem como a purificação por afinidade em tandem ou TAP-marcação 1, 2. Uma adição mais recente destas técnicas é a combinação de purificação por afinidade de uma proteína de interesse a partir de uma linha celular de mamífero relevante, seguido por espectrometria de massa de análise quantitativa utilizando rotulagem isótopo estável de aminoácidos em cultura de células (SILAC) 3. Isto tem vantagens sobre a levedura abordagem de dois híbridos em que a localização celular e modificações pós-tradução não são perturbados, assim como as vantagens sobre os tradicionais, em que é uma abordagem quantitativa do que qualitativa permitindo ao utilizador a rea-marcação TAPdily distinguir não especificamente proteínas que interagem e contaminantes, de factores do hospedeiro que se ligam especificamente. Além disso, como a amostra é tipicamente analisados ​​inteiro, em vez de bandas de proteínas individuais como, proteínas de interesse não são mascarados por semelhante a migração de proteínas em gel, nem eles tipicamente têm de estar presentes em níveis suficientes para ser visível após a coloração, levando a aumento do número de proteínas de confiança identificados 4. Para demonstrar esta técnica, fusões GFP do fator de iniciação da tradução eucariótica intimamente relacionado eIF4AI e eIF4AII que partes sobre identidade de aminoácidos de 90% foram investigados por SILAC-imunoprecipitação proteômica quantitativa. EIF4AI humano e II foram clonados em pEGFP-C1 para formar uma proteína de fusão onde a GFP é fundido com o terminal N de elF4A. Para evitar a necessidade de se gerar linhagens de células estáveis ​​a transfecção transiente foi usado para entregar estas construções para células 293T de isótopos estáveis ​​rotulados. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; As células foram marcadas em primeiro lugar durante duas semanas em meio de cultura de células SILAC, seguido por transfecção de plasmídeo de ADN que codifica uma proteína de interesse. As células foram então lisadas, a concentração de proteína normalizada, e quantidades iguais de lisado purificado por afinidade em agarose de anti-GFP. Quantidades iguais de eluato foram então combinados e submetidos à análise de LC-MS/MS. Os resultados desta análise são então processadas para identificar proteínas de elevada confiança: interacções de proteína (Figura 1). SILAC imunoprecipitação permite a identificação não só de interações diretas, mas também baixa afinidade ou interações indiretas com complexos de proteína 4. Usando este sistema, eIF4AI e II imunoprecipitações permitiu a identificação reprodutível e confiável do parceiro de ligação primária eIF4G (isoformas I / II e III) 5, assim como as interacções indirectas com a eIF4E, e os vários componentes do complexo eIF3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium &#160;(DMEM)</td>
			<td style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td style="width:88px;">LM010</td>
			<td style="width:745px;">DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:271px;">Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml</td>
			<td rowspan="2" style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">DS1003</td>
			<td rowspan="2" style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Arginine (R0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">A8094</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R6) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CLM-2265</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R10) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-539</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lysine (K0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L8662</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K4) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">DLM-2640</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K8) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-291</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml</td>
			<td style="width:87px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">15140-122</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:88px;">11668-027</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">GFP-trap Agarose (500&#956;l resin)</td>
			<td style="width:87px;">Chromotek</td>
			<td style="width:88px;">gta-20</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">5x SDS Sample loading buffer</td>
			<td style="width:87px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">PN39000</td>
			<td style="width:745px;">The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:88px;">539134</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.7ml&#160; prelubricated tubes</td>
			<td style="width:87px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3207</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BCA protein assay kit (1L)</td>
			<td style="width:87px;">Pierce</td>
			<td style="width:88px;">23225</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris (Trizma)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Rnase cocktail</td>
			<td style="width:87px;">Ambion</td>
			<td>AM2286&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">NP-40 alternative</td>
			<td style="width:87px;">Millipore</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics

Proteômica quantitativos combinados com purificação de imunoafinidade, SILAC imunoprecipitação, representam um poderoso meio para a descoberta de nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteínas tanto em amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais. Interacções de baixa afinidade podem ser preservadas por meio da utilização de condições de tampão menos rigorosas e ficar prontamente identificável. Este protocolo descreve a marcação de células de cultura de tecidos com isótopos estáveis ​​aminoácidos marcados, transfecção e imunoprecipitação de uma afinidade marcado proteína de interesse, seguido pela preparação para a apresentação de uma instalação de espectrometria de massa. Este protocolo, em seguida, discute como analisar e interpretar os dados retornados do espectrômetro de massa, a fim de identificar parceiros celulares que interagem com uma proteína de interesse. Como um exemplo desta técnica é aplicada a identificar proteínas de ligação aos fatores de iniciação eucarióticos tradução: eIF4AI e eIF4AII.

Numa experiência típica SILAC suspenso, a grande maioria das proteínas identificadas (&gt; 90%) representam os contaminantes, assim como as proteínas de ligação não específica para a matriz de afinidade, e que é ilustrado na Figura 2B, mesmo quando os protocolos de lavagem remove a maioria dos contaminantes citoplasmáticos tais como GAPDH (Figura 2A). No entanto, a agregação de proteínas não se ligar especificamente a uma distribuição normal, permite que as proteínas que se ligam especificamente a uma proteína de interesse a ser distinguida como estas têm maiores proporções de amostra / simulacro do que o fundo. Embora contaminantes deve teoricamente aglomerar em torno de um rácio de log 2 SILAC de 0, este não é necessariamente o caso, um exemplo disto é dado na Figura 3. Possíveis razões para isto incluem a rotulagem SILAC imperfeita de células, carregando os volumes ou concentrações desiguais de lisado para as contas anti-GFP, a perda acidental de contas durante a purificação ou mistura desigualção de amostras no final do processo de purificação de 3. No entanto, assumindo que os dados são analisados ​​com base em um limite de desvio padrão da média dos contaminantes normalmente distribuídos, pequenas mudanças na centragem dos dados não deve afectar a qualidade dos resultados obtidos. Ao comparar as diferenças nas interacções proteína entre duas proteínas relacionadas, uma situação semelhante pode ocorrer quando uma proteína de interesse é produzida a níveis mais elevados do que as células no interior de uma segunda (ou devido à variação na eficiência de transfecção, ou uma propriedade intrínseca da proteína ou do ARNm) . Alguma variação na expressão (por exemplo, a Figura 2A) pode ser corrigida por analisar a relação SILAC para estas duas amostras. Neste exemplo, estas seriam as amostras GFP-eIF4AI e GFP-eIF4AII. Ao analisar a relação 4AI/4AII SILAC como discutido na seção 7, é possível identificar proteínas cuja ligação varia significativamente entre as isoformas. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Na Figura 4, uma representação de uma das proteínas de ligação de elF4A identificados em uma das experiências realizadas réplicas é mostrado ilustrando a cobertura do complexo do factor de iniciação deste protocolo alcançado. As maiores proporções foram tipicamente observados com eIF4G, que se liga diretamente à eIF4A, com rácios mais baixos para eIF4E, que se liga a eIF4G em um local longe do local de ligação eIF4A. Foram observados índices mais baixos para os membros do complexo eIF3. No entanto, isso demonstra claramente que o experimento satisfatoriamente identificados parceiros de ligação entre diretos e indiretos da eIF4AI e II. Como pode ser esperado a partir da sua identidade elevada sequência 6, proteína: interacções proteína pareceu muito conservada entre as duas isoformas, neste sistema experimental, 7, 8. Uma selecção de algumas das proteínas que interagem são apresentados na Tabela 2, que ilustra o formato de dados. <table border="0" cellpadding="0" cellspAcing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Título de Coluna </td><td> Descrição </td></tr><tr><td> Adesão </td><td> Exibe o número de acesso para a seqüência </td></tr><tr><td> Cobertura </td><td> Proporção da sequência da proteína abrangida pelos péptidos identificados </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> Peptide jogo espectral </td></tr><tr><td> ♯ peptídeos </td><td> O número total de péptidos únicos identificados para uma proteína </td></tr><tr><td> ♯ AAs </td><td> O comprimento de uma proteína em aminoácidos </td></tr><tr><td> MW (Da) </td><td> O peso molecular de uma proteína em Daltons. Exclui modificações </td></tr><tr><td> cale. PI </td><td> O ponto isoeléctrico de uma proteína teórico </td></tr><tr><td> Contagem </td><td> A pontuação total de uma proteína (o qual representa a soma dos indivpontuações peptídicos idual). A pontuação exata necessária para significância irá variar entre os experimentos. Uma instalação de MS normalmente aplicar um corte de taxa de falsa descoberta de 5%. </td></tr><tr><td> Seqüência </td><td> A sequência de aminoácidos que constituem a proteína </td></tr><tr><td> Relação </td><td> A intensidade relativa dos péptidos em uma amostra marcada chamado, em comparação com uma segunda amostra marcada </td></tr><tr><td> Contagem Relação </td><td> O número de relações de péptidos que foram utilizados para calcular a uma dada razão de proteínas </td></tr><tr><td> Variabilidade Ratio (%) </td><td> A variabilidade dos rácios de péptidos individuais usados ​​para calcular uma determinada proporção de proteínas </td></tr><tr><td> Descrição </td><td> O nome da proteína </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Títulos de coluna padrão de um relatório Proteome Discoverer.Embora a informação útil pode ser adquirida a partir de todas estas colunas, aqueles crítica para esta análise são apresentados em negrito. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057"><tbody><tr><td> Adesão </td><td> Peptídeos </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> Nome </td><td> Análise SILAC </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> Proteína &#39;Bait&#39; </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0,01 </td><td> 90,855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47,575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> Interagindo proteínas </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11.778 </td><td> 10.619 </td><td> eIF4GII60; </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7,22 </td><td> 7,57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0,685 </td><td> 0,646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> Contaminantes não se ligam especificamente </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0,531 </td><td> 0,498 </td><td> Histona H4 </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> Queratina-1 </td><td rowspan="2"> Contaminantes ambientais </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0,01 </td><td> 0,01 </td><td> Queratina-1 do citoesqueleto 9 </td></tr></tbody></table> Dados típicos de um experimento de SILAC imunoprecipitação. Dando exemplos de dados para uma proteína de interesse / isca (peptídeos, alta proporção), proteínas que interagem com a proteína de interesse (baixa peptídeos alto /, relação elevada), não especificamente de ligação Tabela 2. proteínas (baixo Pept / altaides, a relação cai abaixo de cutoff - neste experimento 0,96), e contaminantes ambientais (muitas vezes peptídeos altos, relação negativa / abaixo do limite). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> Figura 1. Plano Experimental. Em primeiro lugar as células são cultivadas em meio sem arginina e lisina, e substituídos com isótopos estáveis ​​marcado arginina e lisina durante 2 semanas (1). (2) As células são semeadas em pratos de 10 cm2 e transitoriamente transfectadas com plasmídeos que codificam para GFP (Mock) ou proteínas de fusão de GFP (amostras). (3) As células são lisadas e as proteínas de fusão de GFP ou GFP são imunoprecipitada a partir de lisados ​​celulares. (4) As amostras são combinadas numa proporção de 1:1 e submetido a análise de LC-MS/MS. Os dados são então analisados ​​para remover baixo ident proteína confiançaficações e para selecionar um nível de enriquecimento de proteínas correspondentes a proteínas que interagem genuínos. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> Figura 2. Confirmando condições adequadas de imunoprecipitação. A) análise de transferência de Western de lisados ​​de células, assim como as fracções não ligadas e ligadas do imunoprecipitação confirma expressão e imunoprecipitação da proteína de interesse. Um Western blot contra GAPDH confirma a depleção de proteínas não interagem e mais uma western blot de um parceiro de interacção conhecida de elF4A confirma a imunoprecipitação bem sucedida das proteínas de ligação para a proteína de interesse. B) Quando não são conhecidos interagindo parceiros de uma proteína de interesse, um gel corado pela prata pode confirmar imunoprecipitação de proteínas que interagem. Nesta prata-mancha<html> bandas de gel ed para GFP e GFP-eIF4AI/II são claras, e uma banda de migração no tamanho correto para eIF4G está presente apenas nas pistas GFP-4AI/II-bound e não na pista controle GFP. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> Figura 3. Resultados representativos. Histograma mostrando a distribuição de proporções de proteína a partir de uma repetição de (A) GFP-eIF4AI ou (B) GFP-eIF4AII suspenso. O corte de 1,96 desvio padrão é marcado com uma linha tracejada. As proteínas que interagem abrangidos os contaminantes normalmente distribuídos são evidentes a partir de ~ 0,25 e 1 em (A), e ~ 0,3-1,5 em (B). les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Identificação dos membros da FEI complexos a partir de uma única réplica de uma experiência SILAC IP. Proteínas em verde foram a proteína de interesse utilizada para o suspenso Interagindo proteínas são sombreadas de vermelho para branco de acordo com a relação de log 2 SILAC no PI SILAC com vermelho sendo a proteína mais abundante na análise, e sendo o ponto de corte branco 1,96 DP. Proteínas sombreados em cinza não foram identificadas nesta análise.

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Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

identification-protein-interaction-partners-mammalian-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

31.3K visualizações.  University of Cambridge.  Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas. 

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biologia

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...