Queremos agradecer a los fondos de puesta en marcha de la Wayne State University (MJA), una beca de la Fundación Americana para la Investigación del Envejecimiento (SMV), y una vía para el Premio de Transición de Carrera de la Independencia (R00EB007129) del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería del Instituto Nacional de la Salud (MJA).

1. Metalación con LnCl tres sales <ol><li> Disolver el ligando en el agua para producir una solución de 30 a 265 mM. El ligando 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-ácido dietilentriamina pentaacético (p-SCN-BN-DTPA) se utilizó en este video a una concentración de 73 mM. </li><li> Ajustar el pH de la solución de ligando a entre 5,5 y 7,0 mediante la adición de 1 M de NH 4 OH. En este video, 0,2 ml de la 1 M NH 4 OH solución se utilizó. </li><li> Disolver 2.1 equivalentes de LnCl 3 en el agua para producir una solución con una concentración de 5-1000 mM. En este video, EuCl 3 y GdCl 3 fueron utilizados en concentraciones de 111 mm. Un exceso de metal se utiliza a menudo para impulsar el metalación hasta el final y por lo tanto simplificar la purificación. </li><li> Añadir la solución de LnCl 3 a la solución de ligando mientras se agita. </li><li> Después de la adición de LnCl 3, ajustar el pH de la mezcla de reacción a entre 5,5 y 7,0 mediante la adición de 0,2 M de NH 4 OH. Un total de 0,5 ml de 0,2 M de NH 4 OH solución se utilizó en este video. Si su ligando contiene sensibles a los ácidos grupos funcionales, ajustar los tiempos de pH múltiples durante este paso. ATENCIÓN - Si la solución se vuelve demasiado básico, cualquier base funcional de los grupos más sensibles, como el isotiocianato, serán inutilizados para la conjugación. </li><li> Monitor de la reacción a través de mediciones de pH. La reacción se completa cuando el pH se mantiene constante. </li></ol> 2. El aumento de pH diagnóstico diferencial (no incluido en este video, pero bueno para ligandos sin base sensible a los grupos funcionales) <ol><li> Añadir NH4OH concentrado a la mezcla de reacción para ajustar el pH de ≥ 11. Este paso se precipitan los metales no acomplejada como el hidróxido insoluble. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras. Si la mezcla de reacción obstruye el filtro, la centrifugación y la decantación antes del filtrado se recomienda. </li><li> Si la diálisis no se realizará, eliminar el disolvente a presión reducida (evaporación giratoria o liofilización es recomendado). </li><li> Pasos 2.1-2.3 se puede repetir si lantánidos libre queda. </li></ol> 3. Diagnóstico diferencial de diálisis <ol><li> Corte el tubo de diálisis a una longitud apropiada (siga las instrucciones del fabricante) para mantener el volumen de la muestra, dejando una longitud extra (aproximadamente el 10% del volumen de muestra). En este vídeo, un 100-500 dalton de peso molecular de corte (MWCO) de la membrana se utilizó, pero más grandes tubos MWCO se puede utilizar en su caso, si la conjugación se realiza antes de metalación. Además, cassettes de diálisis se puede utilizar como una alternativa a los tubos de diálisis si lo desea. </li><li> En su caso sobre la base de las indicaciones del fabricante, disfrutar del tubo de diálisis en el corte de agua durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Llenar un depósito de diálisis (un vaso de 1 litro se usó en el video) con agua (líquido de diálisis). El volumen de líquido de diálisis debe ser aproximadamente 100 veces la de la muestra. </li><li> Dobla un extremo del tubo dos veces y seguro de la parte doblada del tubo con una abrazadera de cierre de la diálisis. Envuelva el extremo del cierre con una banda elástica para asegurarse de que permanece cerrada durante la diálisis. </li><li> Filtrar la mezcla de reacción a través de un filtro de 0,2 micras, y la carga del filtrado en el extremo abierto del tubo con cuidado de no romper la tubería. Asegúrese de dejar espacio en la cabeza lo suficiente para cerrar el tubo. </li><li> Doble el otro extremo abierto del tubo dos veces, con un cierre de seguridad, y envolver el cierre con una banda elástica en el paso 3.4. </li><li> Coloque un frasco de vidrio que contiene aire a la pinza en un extremo del tubo de diálisis con una goma elástica. Coloque un frasco que contiene la arena a la otra pinza. Estos viales asegurar que la tubería se queda sumergido en el líquido de diálisis. </li><li> Coloque la tubería completa en el embalse de diálisis que contiene líquido de diálisis. </li><li> Revuelva el líquido de diálisis con una placa de agitación magnética a una velocidad lenta (no vortex) a temperatura ambiente. </li><li> Cambiar el líquido de diálisis 3 veces en el transcurso de un día (en este video, el dializado se cambió a 2.5, 6.5 y 11.5 h), y luego permitir que la diálisis para seguir toda la noche (para un total de 20 a 28 h de diálisis). </li><li> Retire el tubo de diálisis de la solución de diálisis y abra cuidadosamente un cierre para extraer la muestra. Lave el tubo de diálisis 3 veces con agua y combinar los lavados con la muestra. </li><li> Eliminar el agua a presión reducida. La liofilización se utiliza en este video. </li></ol> 4. Evaluación de la presencia de metal libre <ol><li> Se disuelve el complejo metálico en tampón de acetato (preparación de buffer: Disolver 1,4 ml de ácido acético en 400 ml de agua, ajustar el pH a 5.8 con 1 M de NH 4 OH, y añadir agua para producir un volumen total de 500 ml) y añadir el xilenol indicador en naranja (16 mM de pH 5,8 buffer). En este video, 0,3 mg de complejo se disolvió en 0,3 ml de solución tampón y 3 ml de solución indicadora añadió. </li><li>Detectar la presencia de metales gratuita a través de la observación de un cambio de color del indicador de amarillo a violeta. </li><li> Si lo desea, la cantidad de metal libre se puede cuantificar mediante la creación de una curva de calibración 1. Por otra parte, el tinte arsenazo III se puede utilizar en lugar de xilenol naranja 2. Si se mantiene libre de metales, la muestra debe ser purificado mediante diálisis, una columna de la desalación, o de alto rendimiento de cromatografía líquida (HPLC) antes de la caracterización. </li></ol> 5. Determinación del número de coordinación de agua (q) <ol><li> Prepare una solución de la Eu-III que contiene complejo (~ 1 mm) en H 2 O y la otra solución de la misma concentración de D 2 O. Antes del análisis, la solución de D 2 O se evapora y se disuelve en D 2 O tres veces para eliminar los restos de H 2 O. </li><li> Añadir la solución de agua con una cubeta limpia y coloque la cubeta en un espectrofluorómetro. </li><li> Realizar análisis de excitación y emisión para determinar los valores máximos para cada uno (~ 395 nm y 595 nm ~, respectivamente). </li><li> Realizar una fosforescencia tiempo de desintegración experimento utilizando los siguientes parámetros: longitud de onda de excitación y de emisión establecidos en el paso 5.3, la excitación y la anchura de corte de emisiones (5 nm), flash cuenta (100), el retraso inicial (0,01 ms), tiempo máximo (13 ms) , y el retraso del crecimiento (0,1 ms). Estas condiciones son las adecuadas para la mayoría de los complejos, pero la demora máxima y los valores de incremento puede ser aumentado o disminuido para las especies con tiempos de decaimiento muy largas o cortas en extremo. </li><li> Repita el paso 5.4 con la solución de D 2 O preparada en la etapa 5.1. </li><li> De los datos de la decadencia luminiscencia obtenido en 5.4 y 5.5, el argumento del logaritmo natural de intensidad en función del tiempo. La pendiente de estas líneas son las tasas de decaimiento (τ -1) (Figura 2). En este video, Microsoft Excel 2007 se utilizó para generar las parcelas logaritmo natural de los datos en bruto. Utilizar los tipos de deterioro en la ecuación desarrollada por Horrocks y compañeros de trabajo (eq 1) 3. Si su ligando contiene grupos OH o NH coordinado al metal, entonces la ecuación debe ser modificada antes de su uso 3. </li></ol> la ecuación 1: <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="La ecuación 1" /> 6. Mediciones de relajación <ol><li> Seleccionar el modo de aplicación deseada en el analizador de tiempo de relajación: T 1 (tiempo de relajación longitudinal) o T 2 (tiempo de relajación transversal). </li><li> Prepare una serie de muestras que contienen diferentes concentraciones de D-os-III que contiene complejos en un disolvente acuoso. En este vídeo, el agua se utiliza como disolvente y soluciones de 10,0, 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 y 0 mM se prepararon. Otros solventes acuosos o tampones podría ser utilizado, pero es importante utilizar el disolvente como el espacio en blanco. El volumen final de la muestra es específica para el instrumento que se utiliza. </li><li> Coloque una muestra en el instrumento y dejar reposar durante 5 minutos para que se equilibre a la temperatura del instrumento (37 ° C en este video). </li><li> Determinar el tiempo de relajación (en unidades de s) mediante el ajuste de los parámetros del software para obtener una curva suave exponencial de T 1 o T 2 (curvas representante de T 1 y T 2 se muestran en la Figura 3). </li><li> Repita los pasos 6.3 y 6.4 para todas las muestras, incluyendo el espacio en blanco. </li><li> Calcular la inversa de la medida T 1 o T 2 valores en unidades de s-1. </li><li> Parcela T 1 o T -1 2 -1 frente a Di-s los valores de concentración III (en unidades de mm). Debido a la naturaleza higroscópica de Di-s III complejos que contienen, confirmar la concentración de Di-s III con espectrofotometría de absorción atómica o acoplado inductivamente espectrometría de masas de plasma. Ajustar la parcela con una línea recta. Un diagrama representativo se muestra en la Figura 4. </li><li> La pendiente de la línea de ajuste es la capacidad de relajación (R 1 o R 2 para T 1 y T 2, respectivamente), y tiene unidades de mM -1 s -1. </li></ol> 7. Resultados representante Los datos representativos de los pasos de este protocolo se han incluido en las Tablas y Figuras sección. Además de la cantidad de agua-la coordinación y la caracterización de relajación descritos en el protocolo, es importante para caracterizar los productos finales usando técnicas estándar químico. La identidad de los compuestos se pueden obtener utilizando la espectrometría de masas, y los espectros de masas representativa que muestra los patrones de isótopos para el diagnóstico de Di-s III - Eu y III que contienen complejos se muestran en la Figura 5. Además, para los no-Gd III </sa&gt; lantánidos complejos que contienen, la espectroscopia de RMN puede ser utilizado para la identificación del producto. Para la caracterización de la pureza del complejo, HPLC o análisis elemental o ambos pueden ser utilizados. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Esquema general de metalación y purificación:. Esquema que muestra el procedimiento general para metalación y las razones para la elección de las diferentes vías de purificación. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 luminiscencia intensidad parcela:. Trama Representante del logaritmo natural de intensidad en función del tiempo de la sección 5. Las pendientes de las líneas generadas a partir de curvas similares adquiridos por el agua y las soluciones de D 2 O se utilizan con la ecuación 1 para caracterizar el número agua coordinación de Eu-III que contienen complejos. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 Relajación curvas tiempo de caída:. Representante de los datos (izquierda) y T 1 (derecha) la adquisición de T 2. Las desviaciones de estas formas de curva se produce datos confiables. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 determinación relaxividad:. Un representante de la parcela 1 / T 1 frente a la concentración de Di-s III. La pendiente de la línea de ajuste es de relajación y tiene unidades de mM -1 s -1. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5 Los espectros de masas:. Representante espectros de masas que muestra los patrones de isótopos para el diagnóstico de (izquierda), Di-s que contienen los complejos III y (derecha) de la UE III complejos que contienen. El negro picos de Gauss representan la distribución de isótopos teóricos y las líneas rojas son los datos reales.

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging:+theory+and+design.">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li><li>Yoo, B., Pagel, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging.">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. 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K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents.">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li><li>Le&#243;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates.">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li><li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Dado el creciente número de publicaciones que incluyen lantánidos basado en 04.14 agentes de contraste, es importante que se tenga cuidado en la preparación, purificación y caracterización de los productos para garantizar resultados reproducibles y comparables. Estos complejos son a menudo considerados un desafío para purificar y caracterizar con respecto a las moléculas orgánicas, debido a su naturaleza paramagnética y la sensibilidad de los grupos funcionales que podrían ser utilizados para biocon...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivos y Equipos </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203.254-5G </td></tr><tr><td> p-SCN-BN-DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B-305 </td></tr><tr><td> de hidróxido de amonio </td><td> EMD </td><td> AX1303-3 </td></tr><tr><td> Spectra / Por la biotecnología de éster de celulosa (CE) membrana de diálisis - 500 D MWCO </td><td> Fisher Scientific </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore Millex IC-LG Filtro de unidades </td><td> Fisher Scientific </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xilenol naranja sal tetrasódica </td><td> Alfa Aesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> Fluka </td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Isótopos Cambridge Laboratories, Inc. </td><td> DLM-4-25 </td></tr><tr><td> purificador de agua </td><td> ELGA </td><td> PURELAB ultra </td></tr><tr><td> de alto rendimiento cromatografía líquida y espectrometría de masas </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS-2010EV </td></tr><tr><td> analizador en tiempo de relajación </td><td> Bruker </td><td> mq60 Minispec </td></tr><tr><td> Espectrofotómetro UV-VIS </td><td> Fisher Scientific </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> liofilizador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pH metro </td><td> Hanna Instruments </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> espectrofluorómetro </td><td> HORIBA Jobin Yvon </td><td> FluoroMax-4 </td></tr><tr><td> Calculadora de peso molecular versión 6.46 por Matthew Monroe, descargado 17 de octubre 2009 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> Calculadora de peso molecular </td></tr></tbody></table>

preparation, purification, and characterization of lanthanide complexes for use as contrast agents for magnetic resonance imaging

Polyaminopolycarboxylate basada en ligandos se utilizan habitualmente para quelar iones lantánidos, y los complejos resultantes son útiles como agentes de contraste para resonancia magnética (MRI). Muchos ligandos disponibles en el mercado son especialmente útiles debido a que contienen grupos funcionales que permiten la rápida y de alta pureza, y de alto rendimiento, la conjugación de macromoléculas y biomoléculas a través de amina reactiva ésteres activados y los grupos isocianato o maleimides tiol reactivos. Mientras metalación de estos ligandos se considera de conocimiento común en el campo de la química bioconjugation, las sutiles diferencias en los procedimientos de metalación hay que tener en cuenta a la hora de seleccionar los materiales metálicos de partida. Además, múltiples opciones para la purificación y caracterización de existir, y la selección del procedimiento más eficaz depende en parte de la selección de los materiales de partida. Estas diferencias sutiles son a menudo descuidado en los protocolos publicados. Aquí, nuestro objetivo es demostrar los métodos comunes para metalación, purificación y caracterización de los complejos de lantánido que se pueden utilizar como agentes de contraste para resonancia magnética (Figura 1). Esperamos que esta publicación permitirá a los científicos biomédicos para incorporar las reacciones de complejos de lantánidos en su repertorio de reacciones comúnmente utilizados por facilitar la selección de materias primas y métodos de purificación.

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Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Se demuestra la metalación, purificación y caracterización de los complejos de lantánidos. Los complejos descritos aquí pueden ser conjugados a las macromoléculas para permitir el seguimiento de estas moléculas por medio de resonancia magnética.

Preparación, purificación y caracterización de los complejos lantánidos para el uso de agentes de contraste para resonancia magnética

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

preparation-purification-characterization-lanthanide-complexes-for

Research

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Biology

14.9K vistas.  Wayne State University. Se demuestra la metalación, purificación y caracterización de los complejos de lantánidos. Los complejos descritos aquí pueden ser conjugados a las macromoléculas para permitir el seguimiento de estas moléculas por medio de resonancia magnética.

Video: Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Investigación

Biología

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

En el etiquetado in vitro de células estaminales embrionarias humanas de Resonancia Magnética

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase y de interferencia diferencial microscopía de contraste (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Cuantificación de mezcla utilizando imágenes por resonancia magnética

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Generación y purificación de Humanos INO80 remodelación de la cromatina complejos y Subcomplejos

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...