Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer (K08CA140946, a YC), (5F32CA130372, para PC), (R01CA102774 y R01HL055748 a PB), el Departamento de Defensa (PC094302 a YC), el Fondo para la Investigación de la Familia Shuman GIST (a PC), y el Consorcio de Cáncer Starr (para PC, YC, CLS y PB). Nos gustaría agradecer a Katia Manova, Fan Ning, y Mesurh Türkekul del MSKCC instalación moleculares básicos de Citología para ayudar con muestras criostáticas y la inmunotinción.

1. La disección de ratón del tracto gastrointestinal <ol><li> Los ratones sacrificados por las normas locales IUCAC </li><li> Pin cada miembro en la superficie de espuma de poliestireno y enjuague la superficie abdominal con el 70% de etanol. Abrir la cavidad abdominal con incisión larga línea media desde el diafragma hasta el pubis. Hacer un corte en el esófago distal, y un segundo corte en el intestino grueso distal y quitar el tubo digestivo desde el estómago hasta el ano en bloque, cortando cuidadosamente los ligamentos en el duodeno y el ciego con unas tijeras pequeñas. Lugar del tracto gastrointestinal en una placa de Petri con PBS. Diseccionar mesenterio con unas pinzas (Figura 1). Para separar el estómago, intestino delgado e intestino grueso, corte en el píloro y la unión ileocecal. Enjuague la luz de cada parte del tracto gastrointestinal con PBS utilizando una jeringa de 5 ml conectada a una aguja de alimentación (ratones de más edad) o aguja sin punta (ratones más jóvenes). </li><li> Abrir el estómago, intestino delgado e intestino grueso a lo largo del borde mesentérico. Corte dos piezas para cada parte del tracto gastrointestinal, un montaje para la visualización entera y otro para cryosection. </li></ol> 2. Todo el montaje y preparación de la muestra inmunotinción <ol><li> Coloque la pieza entera de cada parte del tracto gastrointestinal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 cm lleno con 1,0 ml de acetona fría y muestras de solución para al menos 1 hora a 4 ° C. Las muestras pueden ser almacenadas por hasta 1 semana a -20 ° C. Por lo general almacenar las muestras en acetona y proceder a la preparación cyrosections. </li><li> Lave 2X muestra con PBS. Ponga la muestra en placa de Petri con PBS. Bajo microscopio de disección, cuidadosamente quite la capa de la mucosa con un bisturí por la celebración de un extremo con un par de pinzas, dejando la capa muscular. </li><li> Los músculos se pueden cortar en trozos de 5 mm para la tinción con anticuerpos diferentes. No almacenar por más de 2 días en PBS antes de la tinción. </li><li> Pasos de bloque y la incubación se puede hacer en un pocillo de una placa de 24 pocillos o en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Bloque con 0,5 ml de tampón de bloqueo (5% suero de cabra, un 0,1% Triton X-100 en PBS durante 1 hora a 4 ° C). </li><li> Se incuba con el anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo y gire la noche a 4 ° C. Hemos utilizado con éxito ACK-2 de rata anti-Kit, de conejo anti-Ano1, y de conejo anti-anticuerpos para inmunoticción Pgp9.5 montar todo. </li><li> Lávese las manos por 5 minutos 2 veces con PBS en los rotadores a temperatura ambiente. </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente en los rotadores. Por lo general el uso Alexa Fluor 488 anti-conejo y Alexa Fluor 594 anticuerpos anti-rata. </li><li> Lávese las manos por 15 minutos 3 veces con PBS en los rotadores a temperatura ambiente. </li><li> Montaje de la diapositiva, lado seroso en la parte superior para asegurar la orientación de los tejidos durante la microscopía. Esta orientación se asegurará el lado seroso hacer frente a los cubreobjetos y se encontró por primera vez como uno se centra en la diapositiva en un microscopio. Hacemos esto en un microscopio de disección. A veces, brevemente examinar el tejido bajo el microscopio de fluorescencia para orientar correctamente. Bajo microscopía de fluorescencia para visualizar Kit o Ano1, uno debe encontrar el ICC-MI primera red desde el lado del cubreobjetos. A continuación, aspirar PBS tanto como sea posible sin secarse por completo. Añadir 50 l de los medios de comunicación establecidos duro de montaje (que utilizamos prolongar Oro) y coloque suavemente el cubreobjetos en la parte superior del tejido. Permitir el ajuste de montaje de la noche a temperatura ambiente y se desliza almacenar a -80 ° C. </li><li> Para el examen microscópico, se utilizó un microscopio de campo amplio con un Z-drive. Hemos utilizado ya sea un objetivo 20X de aire (NA 0.75, apocromático plano) o un objetivo de aceite 60X (NA 1.4, apocromático plano) y tomó dos superior o igual a 1 micra Z-secciones que abarcan toda la capa muscular. Las imágenes fueron deconvoluted posteriormente mediante el software de deconvolución AutoQuant. Por otra parte, muchos otros han usado la microscopía confocal en cambio, con resultados similares. </li></ol> 3. Criosección preparación y tinción <ol><li> Lugar de cada parte del tracto gastrointestinal, por parte serosa, planos en papel de filtro. Corte el papel de filtro alrededor del tejido. Coloque el tejido en papel de filtro en el 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS (se diluye el 32% de paraformaldehído en PBS frasco cerrado en la derecha antes de su uso) durante 2 horas a temperatura ambiente. La fijación se puede hacer en un 6 - o 12 y placa, dependiendo del tamaño del tejido, o en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Si se hace en el plato, parafina para minimizar la exposición PFA. Ya veces puede dar lugar a la fijación adhesiva de antígeno, en particular para el ACK-2 Kit anti-anticuerpos. </li><li> Eliminar el tejido de la PFA y el lugar en el 30% de sacarosa en PBS. Permitir que el tejido a hundirse durante la noche en el 4 ° C. </li><li> Equilibrar los tejidos con una relación 1:1 de 30% de sacarosa y octubre durante 1 hora. A continuación, monte el tejido verticalmente en cryomold lleno de octubre El eje longitudinal del tracto gastrointestinal debe estar en paralelo con el cyrosections. Al examinar los ratones con diferentes genotipos o con diferentes tratamientos, puede ser útil para montar los tejidos de los ratones en diferentes cryomold mismo para asegurar el procesamiento en paralelo. Congelación de hielo seco y colocar en el congelador -80 ° C para su almacenamiento. </li><li> Reducción del 10 micras cryosectionsen diapositivas y almacenar a -80 ° C congelador. Por lo general, dos secciones de corte en cada diapositiva. También suele realizar la tinción H &amp; E de diapositivas cryosection una. </li><li> Por inmunofluorescencia, en primer lugar equilibrar diapositivas a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, dibuje un círculo alrededor del tejido usar la pluma PAP. </li><li> Bloquear con 150 l de tampón de bloqueo (igual que para toda la inmunotinción de montaje) durante 1 hora. </li><li> Aspirar el tampón de bloqueo y añadir 150 l de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo y se incuba durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. </li><li> Lavado de 5 minutos 2 veces con PBS. </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. Por lo general el uso Alexa 488 anti-conejo y Alexa 594 anticuerpos anti-rata. </li><li> Lávese las manos por 15 minutos 3 veces con PBS. </li><li> Aspirar diapositiva sin secarse por completo los tejidos. Añadir una gota de conjunto difícil de montaje multimedia con DAPI (usamos prolongar Oro) y el lugar # 1.5 cubreobjetos. Lugar de diapositivas a temperatura ambiente durante la noche para establecer y guardar en el congelador -80 ° C. </li><li> Adquisición de tres imágenes de fluorescencia con DAPI, FITC y Texas establece filtro rojo. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Aquí, nosotros usamos el intestino grueso como un ejemplo. H &amp; E tinción de sacarosa protegidos sección fija de hielo utilizado para inmunofluorescencia muestra algunos artefactos en comparación con una sección de parafina de referencia (Figura 2), donde la línea amarilla del plexo mientérico demarks entre las capas musculares circulares y longitudinales y la demarks línea verde de la frontera entre el mucosa y muscularlis. Examinar la cryosection, de la serosa a mucosa, en primer lugar encontramos la más delgada del músculo longitudinal (LM) de la capa seguido por el grueso del músculo circular (CM) de la capa. La sección debe estar en paralelo con el músculo longitudinal para los núcleos de LM debe ser algo alargado, mientras que los núcleos de la CM debe ser pequeño y redondo. Entre el LM y CM son plexos mientérico hechos de neuronas que se tiñen con Pgp9.5. Pgp9.5 también manchas neuronal procesos a lo largo de la CM. Mientérico red ICC (ICC-MI) rodean el plexo mientérico y están hechos de células multipolares. Dentro de la capa muscular longitudinal, no son raros los CCI intramuscular (ICC-IM), que son células bipolares en paralelo con el músculo. Dentro de la capa muscular circular, hay abundantes ICC-IM, que también son células bipolares que se ejecutan en paralelo con el músculo circular y está seccionado con este corte. En el cruce de la capa muscular y la submucosa, la submucosa de la red de la CPI consiste en ICC-SMP es una red plana de los CCI multipolar. Examinar el kit de montaje en toda la inmunotinción del intestino grueso, se debe esperar encontrar el ICC-MI de la red, y luego la Corte Penal Internacional-IM de la CM, y las redes de ICC-SMP, como uno se centra en el cubreobjetos (Figura. 3) . Medida volumétrica de las redes de ICC con reconstrucción 3D de imágenes de monte se han descrito 10. Utilizando todo el microscopio de campo, no es significativo fuera del plano de fluorescencia en las imágenes en bruto que puede ser retirado después de deconvolución (Figura 3). Incompleta stripping de la mucosa se traducirá en la fluorescencia de fondo de alta. ANO1 es otro indicador de la Corte Penal Internacional y co-tinción de KIT y ANO1 muestra una superposición completa de la tinción de la CCI (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Representante de la figura 1. Diseccionado el tracto gastrointestinal del ratón, reimpreso con el permiso de 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A) Representante tinción H &amp; E del intestino grande del ratón de cryosections preparado como se describe y embebidos en parafina de referencia sección que muestra algunos artefactos de la contracción de cryosections. El demarks línea amarilla del plexo mientérico y la línea azul que separa la mucosa de la capa muscular. B) Representante Kit (rojo, ACK-2) y Pgp9.5 (verde) de inmunofluorescencia doble con DAPI (azul) contratinción del intestino grande del ratón. LM: CM músculo longitudinal: músculo circular. Barra de escala 20 micras. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representante Kit (rojo, ACK-2) todo el montaje de inmunofluorescencia el mismo campo en tres planos focales, el ICC-Mi avión en la frontera LM / CM, el plano de la CPI-IM en el CM, y la Corte Penal Internacional SMP avión en la frontera CM / submucosa. Las imágenes RAW y las imágenes se muestran deconvoluted. Barra de escala 20 micras. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Representante de doble inmunofluorescencia de Ano1 (verde) y Kit (rojo, ACK-2) en el intestino grueso. Barra de escala 20 micras.

<ol>
	<li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract.">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li><li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal:+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks.">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li><li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract.">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li><li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal.">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li><li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine.">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li><li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W/kit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity.">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li><li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumour.">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li><li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors.">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li><li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+(GIST).">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , (2010).</li><li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors.">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li><li>Hwang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+anoctamin+1/TMEM16A+by+interstitial+cells+of+Cajal+is+fundamental+for+slow+wave+activity+in+gastrointestinal+muscles.">Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.</a> J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).</li><li>Gomez-Pinilla, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li><li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li></ol>

Las células intersticiales de Cajal se caracteriza inicialmente por Santiago Ramóón y Cajal exactamente un siglo atrás con manchas de metileno cromato azul y plata de muscularis gastrointestinal. Cajal pensaba inicialmente ICC se basa en las neuronas de sus procesos que son una reminiscencia de los axones y dendritas. Lo largo de muchos años de seguimiento, el estudio de la biología de la CPI ha sido limitada por la falta de marcadores específicos hasta el descubrimiento de que Kit no sólo se expresa en la CPI, pero también es necesario para su desarrollo 6. Desde entonces, KIT inmunofluorescencia ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la biología y la Corte Penal Internacional también ha llevado a la apreciación de la Corte en otros órganos contráctiles, como la vejiga urinaria. Recientemente, ANO1 ha sido identificado como un segundo marcador fiable de la CPI. Ha habido numerosas publicaciones en los últimos 15 años mediante inmunofluorescencia para identificar a la CPI con la fijación de diversas técnicas de montaje. En nuestras manos &quot;fijo&quot; congelados cryosections que se han prefijado con paraformaldehído y sacarosa obras protegidas por el mejor en comparación con acetona o paraformaldehído posterior a la fijación después de muestras criostáticas. Para montajes todo, hemos encontrado que la fijación de acetona seguida por disección de la mucosa se presentan los resultados más robustos. Históricamente, el ACK-2 ha sido el anticuerpo Kit de elección para el ratón de la CPI de identificación. Es una rata monoclonal que reconoce el dominio extracelular y es también un bloqueo de anticuerpos que causa íleo cuando se les da para vivir ratones. Sin embargo, el epítopo ACK-2 es destruido lentamente por la fijación de paraformaldehído y no es rescatado por los métodos de recuperación de antígeno. Hemos encontrado que el epítopo ACK-4 es más resistente a la fijación de paraformaldehído. En comparación con el fijo bloques congelados y secciones, bloques de parafina y las secciones conserva la morfología mejor y es más susceptible de archivo a largo plazo (Figura 4). Ni ACK ACK-2 ni 4 se han utilizado con éxito en las secciones de parafina. Hemos caracterizado que D13A2, un anticuerpo monoclonal de conejo nuevo, funciona excepcionalmente bien en las dos secciones fijas congeladas y la parafina en el tracto gastrointestinal. Kit se expresa en varios tipos celulares, incluyendo los melanocitos, las células hematopoyéticas, células germinales, y en particular en los mastocitos, que también se encuentran en el tracto gastrointestinal. Afortunadamente, la mayoría de las células cebadas se encuentran es la mucosa y no en la capa muscular. Doble tinción con conejo anti-Ano1 y rata anti-Kit puede eliminar la tinción inespecífica de cada anticuerpo (Figura 4). También vale la pena señalar que la expresión relativa de Kit y Ano1 entre las subclases de la Corte Penal Internacional parece diferente. Por ejemplo, en el intestino delgado, la tinción de Kit es mucho más intensa en mientérico ICC en comparación con el ICC de los músculos profundos del plexo Ano1 mientras que la tinción es comparable.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> rata anti-Kit de anticuerpos (clon ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> Uso en 2μg/ml. Epítopo se pierde con overfixation. </td></tr><tr><td> rata anti-Kit de anticuerpos (clon ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> Uso en 2μg/ml. </td></tr><tr><td> conejo anti-KIT anticuerpos (clon D13A2) </td><td> Señalización Celular </td><td> 3074 </td><td> Uso en dilución 1:100. Anticuerpos sólo figuran en esta lista que funciona bien en las secciones de parafina. </td></tr><tr><td> conejo anti-anticuerpos Pgp9.5 </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Etiquetas citoplasma de la célula neuronal. Útil para marcar las neuronas del plexo mientérico. Uso en la dilución 1:1000. </td></tr><tr><td> conejo anti-anticuerpos Ano1 </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> Uso en 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 cabra anti-IgG de rata </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> Uso en 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> Uso en 2μg/ml </td></tr><tr><td> Aguja de alimentación de los animales </td><td> Pescador </td><td> 01-208-87 </td><td> De silicona con punta de aguja útil para el lavado del tracto gastrointestinal de los ratones adultos </td></tr><tr><td> Blunt aguja </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Aguja roma útil para el lavado del tracto gastrointestinal de las crías pre-destete </td></tr><tr><td> Prolongar reactivo Antifade oro con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Puede usar alternativas difíciles de establecer medios de montaje con DAPI </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek octubre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 32% de paraformaldehído (ampollas de 10 ml sellado) </td><td> EM Ciencias </td><td> 15714 </td><td> Ampolla abierta sellado y diluir a 4% justo antes de usar </td></tr><tr><td> Tampón de bloqueo </td><td></td><td></td><td> 5% de suero de cabra, 0,1% Triton X-100 en PBS </td></tr></tbody></table>

visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice

Las células intersticiales de Cajal (ICC) se mesenquimales derivados de las &quot;células marcapasos&quot; del tracto gastrointestinal (GI) que generan las ondas lentas espontánea necesaria para la peristalsis y mediar en la entrada neuronal de la system1 nervioso entérico. Diferentes subtipos de la CPI formar redes distintas en la capa muscular del tracto gastrointestinal 2,3. Pérdida o daños a estas redes se asocia con una serie de trastornos de la motilidad 4. Las células de la CPI expresar la tirosina quinasa del receptor KIT en la membrana plasmática y el KIT inmunotinción se ha utilizado durante los últimos 15 años a la etiqueta de la red de ICC 5,6. Es importante destacar que la actividad KIT normal es necesaria para el desarrollo de ICC 5,6. Transformación neoplásica de las células de la CPI resultados en tumores del estroma gastrointestinal (GIST), que con frecuencia puerto de ganancia de función de las mutaciones KIT 7,8. Recientemente hemos demostrado que ETV1 es un factor de supervivencia de linaje específico, expresado en el linaje de ICC / GIST y es un regulador maestro de la transcripción necesarios tanto para la formación normal de la red de la CPI y de la tumorogénesis GIST 9. Además, demostrar que coopera con la activación de las mutaciones KIT en la tumorigénesis. Aquí se describen los métodos para la visualización de las redes de la CPI en los ratones, en gran parte basado en los protocolos previamente publicados 10,11. Más recientemente, el canal de cloro anoctamin 1 (ANO1) también se ha caracterizado como un marcador de membrana específicos de ICC 11,12. Debido a su localización membrana plasmática, la inmunofluorescencia de ambas proteínas se pueden utilizar para visualizar las redes de la CPI. Aquí se describe la visualización de las redes de la CPI por fija congeladas y preparaciones cyrosections todo el montaje.

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Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Las células intersticiales de Cajal (ICC) son las células marcapasos del tracto gastrointestinal (GI). Se forman redes complejas entre las células del músculo liso y fibras post-ganglionares neuronal para regular la contractilidad del GI. A continuación, presentamos los métodos de inmunofluorescencia transversal y todo el montaje de visualización de redes murino de la CPI.

La visualización de las células intersticiales de Cajal (ICC) de red en ratones

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

54.2K vistas.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Las células intersticiales de Cajal (ICC) son las células marcapasos del tracto gastrointestinal (GI). Se forman redes complejas entre las células del músculo liso y fibras post-ganglionares neuronal para regular la contractilidad del GI. A continuación, presentamos los métodos de inmunofluorescencia transversal y todo el montaje de visualización de redes murino de la CPI.

Video: Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Una técnica rápida para la visualización en vivo de las células de levadura inmovilizada

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Investigación

Biología

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Contar y determinar la viabilidad de las células cultivadas

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Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Siembra y células de mamífero

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Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

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Congelación, descongelación, y las Pilas de embalaje para el transporte

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Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...