Work in the authors' laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.

1. ATP-dependientes Nucleosome Remodelación ensayos Para medir las actividades de remodelación nucleosoma dependiente de ATP, inmunopurificado INO80 o subcomplexes INO80 se incuban con ATP y un sustrato mononucleosomal, que contiene un único nucleosoma posicionado en un extremo de un fragmento de ADN de 216 pb, marcado con P 32. Los productos de reacción se someten después a electroforesis en geles de poli-acrilamida nativos. <ol><li> Para generar el fragmento de ADN marcado con 32P &#39;601&#39;, amplificar de pGEM-3Z-601 4 un fragmento de ADN de 216 pb que contiene una secuencia de 601 el posicionamiento de nucleosomas final ubicado, utilizando los oligonucleótidos 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG y 5&#39;-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG como adelante y atrás primers. <ol><li> Configurar una reacción de PCR 100 l como se describe en la Tabla 1. </li><li> Lleve a cabo las reacciones de PCR en un termociclador con el siguiente programa: 1 min a 96 ° C, followed por 45 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 57 ° C, 60 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos; terminando con 7 min a 72 ° C. </li><li> Después de que se terminó la reacción de PCR, eliminar los nucleótidos no incorporados haciendo pasar los productos de reacción dos veces a través de columnas de centrifugado sin nucleasa. </li><li> Ejecutar 5 l de producto de PCR purificado en un gel de agarosa al 1,2% para confirmar que la reacción de PCR generó el fragmento de ADN de ~ 216 pb deseado. </li><li> Diluir 5 l de producto de PCR purificado de 20 veces, y medir la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. El rendimiento promedio es de ~ 40 ng / l. </li><li> Medir la radiactividad de 1 l de producto de PCR purificado en un contador de centelleo. Estimar el etiquetado de eficiencia mediante el cálculo de la cpm / ng. Se espera una reacción de marcado con éxito para producir ~ 15.000 cpm / ng de fragmento de ADN de 601. </li></ol></li><li> Transferencia de células HeLa nucleosomas en el ADN marcado 601 utilizando un método de dilución en serie 5. <ol><li> Mezclar 2 pmol de32 P-etiquetados 601 fragmento de ADN con 6 g de nucleosomas Hela (preparado como se describe 5) en 50 l de un tampón que contenía NaCl 1,0 M, Tris-HCl 10, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, y 1 mM TDT y se incuba a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Secuencialmente se diluye la mezcla a 0,8 M, 0,6 M y NaCl 0,4 M por dilución con 12,5 l, 20,8 l, y 41,6 l, respectivamente, de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, y DTT 1 mM, con una incubación de 30 min a 30 ° C después de cada dilución. </li><li> Además se diluye la mezcla a 0,2 M y luego a NaCl 0,1 M mediante la adición de 125 l y luego 250 l de la misma solución tampón que contiene 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glicerol, y 200 mg / ml de BSA, con una incubación de 30 min a 30 ° C entre las dos últimas diluciones. Almacenar el sustrato mononucleosome a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. </li></ol></li><li> Realizar reacciones nucleosoma deslizamiento dependientes de ATP en un volumen total de 10 l. El reaction componentes se enumeran en la Tabla 2. Puesto que la concentración de NaCl óptima para INO80 actividad de remodelación nucleosoma es de ~ 50 mM de NaCl (resultados no publicados), ajustar la concentración total de NaCl en cada reacción a 50 mM, teniendo en cuenta la cantidad de contenido en NaCl preparaciones de nucleosomas y enzima. <ol><li> Antes de comenzar a configurar los ensayos, emitidos geles poli-acrilamida nativos (18 x 16 cm). Para preparar un solo gel que contiene 5% de acrilamida (acrilamida: bisacrilamida 37.5: 1), TBE 0,5 x (Tris 45 mM borato, EDTA 1 mM), persulfato de amonio 0,01% (APS), y 0,001% de N, N, N &#39;, N &#39;tetrametiletilendiamina (TEMED), mezclar los ingredientes enumerados en la Tabla 3. Deje que el gel se polimerice por lo menos durante 2 horas a RT. </li><li> Mientras tanto, para que se realice cada reacción, se combinan en un tubo de 1.5 ml con silicona previamente enfriado ~ 20 nM INO80 o subcomplejo INO80 (preparada como se describe 3) con una cantidad de tampón EB100 ( <strong&gt; Tabla 4) suficiente para dar un volumen de 4,75 l. Inmediatamente vuelva a congelar las fracciones que contiene INO80-que quedan en hielo seco en polvo o nitrógeno líquido. </li><li> Establecer un cóctel principal con el resto de los ingredientes, la ampliación por un factor de &#39;X&#39; (donde X = número total de reacciones 3). La cantidad de cada ingrediente necesario para una sola reacción de 10 l se enumera en la Tabla 5; la receta debe ampliarse de acuerdo con el número de reacciones a realizar. Mezclar bien tocando el tubo o pipeta hacia arriba y hacia abajo con un Pipetman y hacer girar el tubo durante unos segundos en una microcentrífuga de sobremesa. </li><li> Dispensar 5,25 l de cóctel de maestro a cada uno de los tubos de reacción preparada en el paso 1.3.2. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo. Iniciar las reacciones mediante la transferencia de los tubos de reacción a un baño de 30 ° C o bloque de calor de agua y se incuba durante 2 hr. </li><li> Mientras tanto, preparar &#39;la eliminación de mezcla&#39; cóctel que contiene ADN competidory nucleosomas, la ampliación por un factor de X (X = número total de reacciones + 4). La cantidad de cada ingrediente necesario para preparar 1,5 l de la mezcla para la eliminación de una sola reacción se enumera en la Tabla 6; la receta debe ser ampliado en función del número de ensayos a realizar. </li><li> Terminar reacciones mediante la adición de 1,5 l de la mezcla de la eliminación. Mezclar bien, girar hacia abajo, y se incuba a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Mientras tanto, pre-ejecutar el gel de poliacrilamida nativo en una unidad de electroforesis vertical en 100 V durante 30 min a 4 ° C, utilizando TBE 0.5x como tampón con una barra de agitación magnética dentro de la cámara inferior para mantener la circulación de tampón constante. </li><li> Para cargar la muestra, añadir 2,5 l de colorante de carga que contiene 3x TBE, 30% de glicerol, 0,25% azul de bromofenol, y 0,25% de xileno cianol FF. Mezclar bien, girar brevemente las muestras, y la carga en el gel usando puntas de carga. </li><li> Correr el gel a 200 V durante 4,5 horas a 4 ° C con circulación de buffer.</li><li> Para detectar la señal, transferir el gel a una pila de dos hojas de papel de filtro. Envuelva el papel de filtro con el gel en la parte superior mediante una envoltura de plástico transparente, y luego exponerlo a una pantalla de fósforo de almacenamiento a 4 ° C durante el tiempo deseado. </li><li> Busque en la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y analizar los datos utilizando un software adecuado. </li></ol></li></ol> 2. Mononucleosome ensayos de unión Para ensayar la afinidad de unión de un complejo INO80 dado para mononucleosomes, realice un cambio de movilidad electroforética de ensayo (EMSA) utilizando el sustrato mononucleosomal generada en el paso 1.2. <ol><li> Configurar la reacción de mezclas para ensayos de unión como se ha descrito para los ensayos de remodelación de nucleosomas, pero omitir la ATP y la eliminación de la mezcla de las reacciones; incubar a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Añadir 2,5 l de colorante de carga a cada mezcla de reacción, y se aplican a un gel de poliacrilamida nativo que contiene 3,5% de acrilamida (acrilamida: bis 37.5: 1), 1% de glicerol, TBE 0,5 x, 0,01% de APS, 0,001% y TEMED. </li><li> El uso de TBE 0.5x como tampón, ejecute el gel a 200 V durante 2,5 horas a 4 ° C con circulación de tampón y se exponga a una pantalla de fósforo de almacenamiento. </li></ol> 3. ADN y Nucleosoma-ATPasa dependiente Ensayos Realizar ensayos de ATPasa en las mezclas de reacción 5 l que contenía 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 60 mM, 6,6 mM de MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glicerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 Ci de [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Para cada complejo INO80 o cantidad de complejo INO80 a ensayar establecer tres reacciones paralelas, una memoria intermedia que contiene EB100 para medir ADN o nucleosoma-ATPasa independiente, uno que contiene ADN plásmido circular cerrado (5.000 pb, ~ 30 nM) para medir el ADN ATPasa dependiente, y una que contiene Hela oligonucleosomas (~ 185 nm) para medir-nucleosoma ATPasa dependiente. Configure todas las reacciones en hielo. <ol&gt; <li> Para cada reacción, se combinan 10-50 nm de la INO80 o INO80 subcomplexes inmunopurificados con una cantidad de tampón EB100 suficiente para dar un volumen de 2,2 l en 1,5 ml tubos de microcentrífuga lubricados pre-refrigerados. Inmediatamente vuelva a congelar las fracciones que contiene INO80-en hielo seco en polvo o nitrógeno líquido. </li><li> Establecer un cóctel maestro. La cantidad de cada ingrediente necesario para una sola reacción se enumera en la Tabla 7. Escala la receta por la ampliación por un factor de 3 (X + 2) 1, donde X = el número de preparaciones INO80 a ensayar. </li><li> Para preparar conteniendo buffer &#39;sub-cócteles&#39; solamente, ADN, o nucleosomas, dispensan 2.5 (X + 2) l del cocktail master en tres tubos separados. Añadir 0,3 (X + 2) l de cualquiera de EB100, el ADN plásmido circular cerrado (1,5 g / l), o Hela oligonucleosomas (1,5 g / l) y mezclar bien. </li><li> Prescindir de 2,8 l de la sub-cóctel apropiado para los tubos de reacción que contienen enzimas con base en St.ep 3.1. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar; evitar la introducción de burbujas. </li><li> Para iniciar reacciones, transferir los tubos de reacción a un bloque de calor a 30 ° C. </li><li> Después de 5, 15, 30, y 60 min de incubación, detectar 0,5 l de cada mezcla de reacción en una cromatografía de polietilenimina celulosa de capa fina (TLC) placa (20 x 10 cm) en una línea recta al menos 1,5 cm del borde inferior . Devolver inmediatamente tubos de reacción a la 30 ° bloque de calor C por lo que múltiples puntos de tiempo se pueden tomar de un solo tubo. Después de las salpicaduras, seque las placas de TLC utilizando un secador de pelo. </li><li> Transferir las placas de TLC a una cámara de vidrio que contiene suficiente fosfato de potasio 0,375 M (pH 3,5) para permitir que la parte inferior 0,5 cm de la placa de TLC se sumergieron en la solución. </li><li> Cubra la cámara, y esperar que el frente de la fase líquida alcanza la parte superior de las placas de TLC. Inmediato secar las placas a fondo con un secador de pelo. </li><li> Exponga las placas de TLC secas a una pantalla de fósforo de almacenamiento a temperatura ambiente.Busque en la pantalla con un sistema de escáner de imágenes de isótopos y determinar la cantidad de sustrato ATP radiactivo y producto ADP. </li><li> Para calcular la cantidad de ATP hidrolizado, multiplique el ATP% hidrolizado por la cantidad de ATP presente en la mezcla de reacción de partida utilizando la siguiente fórmula: ATP hidrolizado pmol = 10 ATP pmol en el inicio de la reacción x [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

<ol>
	<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes.">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li><li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes.">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li><li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. 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Biol. 276 (1), (1006).</li><li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes.">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li><li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor.">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex.">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex:+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling.">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li><li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. 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D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation,+Mol.Cell+Biol.">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li><li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site.">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li><li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler,+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes.">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase,+Biochemistry.">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome.">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Para asegurarse de que la remodelación nucleosoma y actividades de ATPasa se observa en los ensayos dependen de la actividad catalítica de complejos INO80, y no en la contaminación de la remodelación y / o enzimas ATPasa, que nucleosoma ensayo de forma rutinaria la remodelación y la actividad ATPasa de versiones catalíticamente inactivos de Ino80, purificado en en paralelo con el tipo salvaje INO80 utilizando el mismo procedimiento. Una reacción de control negativo que carece de ATP también se debe realizar cuan...

Complejos remodeladores de cromatina familia SNF2 incluyen una SNF2 como ATPasa subunidad central de 1,2. Algunos ATPasas función como SNF2 como enzimas de subunidades individuales, mientras que otros funcionan como la subunidad catalítica de complejos de múltiples subunidades más grandes. Dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales cada una de las subunidades de la cromatina complejos remodeladores de contribuir a sus actividades requiere la capacidad de realizar ensayos bioquímicos que diseccionan el proceso de remodelación. Remodelación nucleosoma dependiente de ATP por el complejo INO80 humana y otras enzimas remodelación de la cromatina puede ser concebido como un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión de la enzima a la remodelación nucleosomas, seguido por la activación de su ADN y / o nucleosoma-ATPasa dependiente, translocación de la enzima sobre el ADN nucleosomal remodelación, y la eventual reposicionamiento de los nucleosomas 1,2. La comprensión de los detalles moleculares de la ATP-dependiente proceso de remodelación de la cromatina requiere disección de la reacción de remodelación en sus pasos individuales y definición de las contribuciones de las subunidades individuales del complejo de remodelación de la cromatina a cada etapa de la reacción. Tales análisis requieren la capacidad de analizar la remodelación nucleosoma y otras actividades utilizando sustratos moleculares definidos in vitro. En un protocolo JOVE anterior, describimos los procedimientos utilizados para generar complejos remodeladores de cromatina INO80 y subcomplexes con composiciones de subunidades definidas 3. A continuación, presentamos tres ensayos bioquímicos que permiten el análisis cuantitativo de la unión, ADN y-nucleosoma activado ATPasa, y actividades de remodelación de nucleosomas asociados con tales complejos de nucleosomas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="839">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:123px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PCR reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Roche Applied Science&#160;</td>
			<td style="width:147px;">11435094001</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roche Taq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:212px;">Roche Applied Science&#160;</td>
			<td style="width:147px;">11435094001</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway Nuclease-free Spin Columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td style="width:147px;">Cat. # AM10070</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrapure ATP&#160;</td>
			<td>USB/Affymetrix</td>
			<td style="width:147px;">77241 25 UM</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">A9418&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">N,N,N&#180;,N&#180;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">17919</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td>
			<td style="width:212px;">Amresco</td>
			<td style="width:147px;">0254-500ML</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicated salmon sperm DNAs&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:147px;">27-4565-01</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">17874</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">Cat. No. 70664</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[&#945;-32P] ATP (3000 Ci/mmol)</td>
			<td style="width:212px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:147px;">BLU003H250UC</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">dCTP, [&#945;-32P]- 6000Ci/mmol</td>
			<td style="width:212px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:147px;">BLU013Z250UC</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoefer vertical electrophoresis unit</td>
			<td style="width:212px;">Hoefer</td>
			<td style="width:147px;">SE600X-15-1.5</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Storage Phosphor Screen&#160;</td>
			<td>Molecular Dynamics</td>
			<td style="width:147px;">63-0034-79</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3MM filter paper</td>
			<td>Whatman&#160;</td>
			<td style="width:147px;">28458-005</td>
			<td style="width:123px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Typhoon PhosphorImager&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:147px;">8600</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuant software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:147px;">ver2003.02</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">5725-7</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe</td>
			<td style="width:212px;">Biodex</td>
			<td style="width:147px;">Model 14C</td>
			<td style="width:123px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical assays for analyzing activities of atp-dependent chromatin remodeling enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Las cifras muestran resultados representativos de ensayos bioquímicos utilizados para caracterizar las actividades INO80, incluyendo nucleosoma deslizamiento (Figura 1) y vinculante (Figura 2) y ensayos de ADN o ATPasa ensayos nucleosomas dependiente (Figura 3). El experimento mostrado en la Figura 1 compara la capacidad de los complejos de INO80 intactas purificó a través de FLAG-NIF N ° 2 o FLAG-INO80E y de INO80 subco...

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Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K vistas.  Stowers Institute for Medical Research. Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.