Name: biochemical assays for analyzing activities of atp-dependent chromatin remodeling enzymes
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes at JoVE.com

Work in the authors' laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.

מבחני Remodeling הנוקלאוזום .1 תלוי ATP כדי למדוד ATP תלוי פעילויות הנוקלאוזום שיפוץ, immunopurified INO80 או subcomplexes INO80 מודגרת עם ATP ומצע mononucleosomal, המכיל הנוקלאוזום יחיד ממוקם בקצה אחד של קטע DNA 216-BP, שכותרתו-P 32. תוצרי התגובה לאחר מכן נתון לאלקטרופורזה בג&#39;ל פולי-acrylamide ילידים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת ליצור את, בר 32 שכותרתו P &#39;601&#39; DNA, להגביר מpGEM-3Z-601 4 שבר 216 נ&quot;ב DNA המכיל 601 רצף מיצוב הנוקלאוזום מיקום סוף, באמצעות oligonucleotides 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG ו5&#39;-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG כ קדימה ולאחור פריימרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת PCR 100 μl כפי שמתואר בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR התגובות בCycler תרמית באמצעות התכנית הבאה: 1 דקות ב96 מעלות צלזיוס, followeד על ידי 45 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב57 ° C, 60 שניות ב72 מעלות צלזיוס במשך 30 מחזורים; כלה ב7 דקות ב72 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תגובת PCR נגמרה, להסיר את נוקלאוטידים מאוגדים על ידי העברת תוצרי התגובה פעמיים באמצעות עמודות ספין nuclease חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוץ 5 μl של מוצר PCR המטוהר בagarose ג&#39;ל 1.2% כדי לאשר שתגובת PCR שנוצרה קטע DNA נ&quot;ב הרצוי ~ 216. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5 μl של מוצר PCR המטוהר פי 20, ולמדוד את ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. התשואה הממוצעת היא ~ 40 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הרדיואקטיביות של 1 μl של מוצר PCR המטוהר במונה נצנץ. להעריך את יעילות התיוג על ידי חישוב עותקים לדקה / ng. תגובת תיוג מוצלחת צפויה להניב ~ 15,000 עותקים לדקה / ng של 601 קטע DNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את nucleosomes תא הלה על DNA 601 שכותרתו באמצעות שיטת דילול סדרתי 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 2 pmol של32 קטע DNA 601 עם כותרת P 6 מיקרוגרם של nucleosomes הלה (שהוכן כמתואר 5) ב50 μl של מאגר המכיל 1.0 M NaCl, 10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 מ&quot;מ PMSF, ו1 מ&quot;מ DTT ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לדלל את התערובת ל0.8 M, 0.6 M, ו0.4 M NaCl על ידי דילול עם 12.5 μl, 20.8 μl, ו41.6 μl, בהתאמה, של 10 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 מ&quot;מ PMSF, ו 1 מ&quot;מ DTT, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס לאחר כל דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לדלל את התערובת ל0.2 M ולאחר מכן ל0.1 M NaCl על ידי תוספת של 125 μl ולאחר מכן 250 μl מאותו המאגר המכיל 0.1% Nonidet P-40, גליצרול 20%, ו200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס בין שני דילולים הסופיים. אחסן את מצע mononucleosome ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות הנוקלאוזום הזזה ATP תלויות בנפח כולל של 10 μl. המחשבהרכיבי ction מפורטים בטבלה 2. מאז ריכוז NaCl האופטימלי לפעילות שיפוץ הנוקלאוזום INO80 הוא ~ 50 mM NaCl (תוצאות לא פורסמו), להתאים את הריכוז הכולל של NaCl בכל תגובה ל50 מ&quot;מ, תוך לקיחה בחשבון את כמות NaCl הכלולה ב הכנות של nucleosomes ואנזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שיתחיל בלהגדיר את מבחני, להטיל ג&#39;לי פולי-acrylamide ילידים (18 x 16 סנטימטר). כדי להכין ג&#39;ל יחיד המכיל 5% acrylamide (acrylamide: bisacrylamide 37.5: 1), TBE 0.5x (45 borate מ&quot;מ טריס, 1 mM EDTA), 0.01% persulfate אמוניום (APS), ו0.001% N, N, N&#39;, -tetramethylethylenediamine N&#39;(TEMED), לערבב את החומרים המפורטים בטבלה 3. אפשר ג&#39;ל לפלמר לפחות שעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לכל תגובה שיש לבצע, לשלב בצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge מראש צונן siliconized ~ 20 ננומטר INO80 או subcomplex INO80 (שהוכן כמתואר 3) עם סכום של חיץ EB100 ( <strאונג&gt; לוח 4) מספיק כדי לתת נפח של 4.75 μl. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 שנותרו בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קוקטייל הורים עם שאר החומרים, גמלון בפקטור של &quot;X&quot; (כאשר X = מספר כולל של תגובות +3). הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובת 10 μl בודדת מופיע בטבלה 5; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר של תגובות שיש לבצע. מערבבים היטב על ידי הקשה על הצינור או על ידי pipetting למעלה ולמטה עם Pipetman ולסובב את הצינור לכמה שניות בmicrocentrifuge המעבדתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5.25 μl של קוקטייל האדון לכל אחד מצינורות התגובה הוקמו בצעד 1.3.2. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. התחל את התגובות על ידי העברת צינורות תגובה לאמבטית גוש חום C 30 מעלות או מים ודגירה עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את &#39;הסרת לערבב&#39; קוקטייל המכיל DNA מתחרהוnucleosomes, גמלון בפקטור של X (X = מספר הכולל של תגובות + 4). הסכום של כל מרכיב הדרוש כדי להכין 1.5 μl הסרת תערובת לתגובה יחידה מופיע בלוח 6; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר מבחני שיש לבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים תגובות על ידי הוספת 1.5 μl של תמהיל הסרת. מערבבים היטב, ספין למטה, ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לפני לרוץ ג&#39;ל polyacrylamide הילידים ביחידת אלקטרופורזה אנכית ב100 V ל30 דקות ב 4 ° C, באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל עם בר ומערבב מגנטי בתוך החדר התחתון כדי לשמור על זרימת דם למאגר קבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את המדגם, להוסיף 2.5 μl של טעינת צבע המכיל 3x TBE, גליצרול 30%, 0.25% כחול bromophenol, ו0.25% Cyanol FF קסילן. מערבבים היטב, ספין בקצרה הדגימות, ולהעמיס אותו על ג&#39;ל באמצעות עצות לטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 200 V ל4.5 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את האות, להעביר את הג&#39;ל לערימה של שני גיליונות של נייר סינון. לעטוף את נייר הסינון עם ג&#39;ל על גבי באמצעות ניילון נצמד ברור, ולאחר מכן לחשוף אותו למסך זרחן האחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה. </li></ol></li></ol> 2 מבחני כריכת Mononucleosome לassay הזיקה המחייבת של מורכב INO80 ניתנו לmononucleosomes, לבצע Shift electrophoretic ניידות Assay (Emsa) באמצעות מצע mononucleosomal שנוצר בשלב 1.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת תערובות לכריכה מבחני כפי שתואר עבור מבחני שיפוץ הנוקלאוזום אבל להשמיט ATP ותמהיל הסרת מהתגובות; לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl של טעינת צבע לכל תערובת תגובה, ותחול על ג&#39;ל polyacrylamide ילידים המכיל 3.5 acrylamide% (acrylamide: bis 31), 1% גליצרול, TBE 0.5x, APS 0.01%, ו0.001% TEMED: 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל, הפעל את הג&#39;ל על 200 V ל2.5 שעה על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ ולחשוף למסך זרחן האחסון. </li></ol> .3 דנ&quot;א והנוקלאוזום תלוי מבחני ATPase לבצע מבחני ATPase בתערובות תגובת 5 μl מכילות 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCl, 6.6 מ&quot;מ MgCl 2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40, גליצרול 2.5%, 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל BSA, 1 מ&quot;מ DTT, 0.1 מ&quot;מ PMSF, 2 מ&quot;מ ATP, 2 μCi של [P 32 α-] ATP (3,000 Ci / mmol). עבור כל מורכב INO80 או כמות מורכבת INO80 להיות assayed הקים שלוש תגובות מקבילות, חיץ EB100 מכיל אחד למדוד דנ&quot;א או הנוקלאוזום עצמאי ATPase, אחד מכיל סגורות פלסמיד דנ&quot;א העגול (נ&quot;ב 5,000, ~ 30 ננומטר) כדי למדוד דנ&quot;א ATPase תלוי, ואחד המכיל oligonucleosomes הלה (~ 185 ננומטר) כדי למדוד ATPase הנוקלאוזום תלוי. הגדר את כל התגובות על קרח. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תגובה, לשלב 10-50 ננומטר של subcomplexes INO80 או INO80 immunopurified עם סכום של חיץ EB100 מספיק כדי לתת נפח של 2.2 μl ב1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge משומן מראש צונן. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הקוקטייל שני. הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובה יחידה מופיע בלוח 7. בהיקף של עד המתכון לפי קנה מידה על ידי גורם של 3 (X + 2) +1, כאשר X = מספר הכנות INO80 להיות assayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין מאגר המכיל &#39;משנה הקוקטיילים&#39; בלבד, DNA, או nucleosomes, לוותר 2.5 (X + 2) μl של קוקטייל האב לשלושה צינורות נפרדים. הוספת 0.3 (X + 2) μl של שתי EB100, DNA הסגור המעגלי פלסמיד (1.5 מיקרוגרם / μl), או (1.5 מיקרוגרם / μl) oligonucleosomes הלה ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 2.8 μl של תת הקוקטייל המתאים לצינורות תגובה המכיל אנזים שהוקמו בstep 3.1. פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב; למנוע החדרת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את תגובות, להעביר את צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5, 15, 30, ו60 דקות של דגירה, לזהות 0.5 μl של כל תערובת תגובה על כרומטוגרפיה שכבה דקה polyethyleneimine תאית צלחת (TLC) (20 x 10 סנטימטר) בקו ישר לפחות 1.5 ס&quot;מ מהקצה התחתון . מייד לחזור צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות ניתן לקחת נקודות זמן כל כך רבות מצינור אחד. אחרי שהבחנתי ב, לייבש את צלחות TLC באמצעות מכת מייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צלחות TLC לתא זכוכית המכיל מספיק פוספט 0.375 M אשלגן (pH 3.5) כדי לאפשר 0.5 סנטימטר תחתית צלחת TLC להיות שקוע בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את התא, ולפתח עד החלק הקדמי של השלב הנוזלי מגיע העליון של צלחות TLC. מיידי לייבש את הצלחות באמצעות מכת מייבש ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את צלחות TLC המיובשים למסך זרחני אחסון ב RT.סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולקבוע את סכום מצע ATP רדיואקטיבי לבין מוצר ADP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את הסכום של ATP הידרוליזה, להכפיל את ATP% הידרוליזה על ידי הכמות של הווה ATP בתערובת התגובה החל שימוש בנוסחה הבאה: ATP pmol הידרוליזה ATP pmol = 10 במתחילים x תגובה [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

<ol>
	<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes.">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li><li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes.">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li><li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes.">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li><li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes.">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li><li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor.">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex.">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex:+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling.">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li><li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF.">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li><li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics.">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li><li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation,+Mol.Cell+Biol.">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li><li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site.">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li><li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler,+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes.">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase,+Biochemistry.">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome.">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

כדי להבטיח ששיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase שאנו רואים במבחנים תלויים בפעילות הקטליטית של מתחמי INO80, ולא על זיהום ו / או אנזימי ATPase שיפוץ, אנו הנוקלאוזום באופן שגרתי assay שיפוץ ופעילות ATPase של גרסאות כקטליזאטור פעילים של מתחמי INO80, מטוהר ב במקביל עם הסוג בר INO80 תוך שימוש ב?...

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 כוללים מקטע ATPase מרכזי כמו SNF2-1,2. פונקציה מסוימת כמו SNF2-ATPases כאנזימים למקטע אחד, בעוד שאחרים לתפקד כמקטע קטליטי של מתחמים רב למקטע גדולים יותר. הבהרת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו כל אחד מיחידות המשנה של הכרומטין מתחמי שיפוץ לתרום לפעילויות שלהם דורש את היכולת לבצע מבחני ביוכימיים שלנתח את תהליך שיפוץ. שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP על ידי מורכב INO80 האנושי ואנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכול להיות שחזה כתהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של אנזים שיפוץ לnucleosomes, ואחרי הפעלה של דנ&quot;א ו / או ATPase הנוקלאוזום תלוי, טרנסלוקציה של אנזים שיפוץ על DNA nucleosomal, ומיצוב מחדש סופו של הדבר nucleosomes 1,2. הבנת הפרטים המולקולריים של r תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATPequires נתיחה של תגובת שיפוץ לשלבים הבודדים שלה והגדרתה של תרומתם של יחידות משנה נפרדות של מתחם שיפוץ הכרומטין לכל צעד של התגובה. ניתוח מסוג זה דורש היכולת לנתח שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות אחרות באמצעות מצעים מולקולריים מוגדרים במבחנה. בפרוטוקול יופיטר קודם, שתארנו תהליכים המשמשים ליצירת מתחמי INO80 שיפוץ הכרומטין וsubcomplexes עם יצירות למקטע מוגדרים 3. כאן, אנו מציגים שלושה מבחני ביוכימיים שיאפשר ניתוח כמותי של הנוקלאוזום המחייב, דנ&quot;א וATPase מופעל הנוקלאוזום, ופעילויות שיפוץ הנוקלאוזום הקשורים למתחמים כאלה.

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR reaction buffer&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science&amp;nbsp;</td><td>11435094001</td><td></td></tr><tr><td>Roche Taq DNA Polymerase</td><td>Roche Applied Science&amp;nbsp;</td><td>11435094001</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Nuclease-free Spin Columns&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Cat. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ultrapure ATP&amp;nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9418&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sonicated salmon sperm DNAs&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10% ammonium persulfate (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>benzonase&amp;nbsp;</td><td>Novagen</td><td>Cat. No. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]- 6,000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermal cycler PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer vertical electrophoresis unit</td><td>Hoefer</td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM filter paper</td><td>Whatman&amp;nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Typhoon PhosphorImager&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant software</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe</td><td>Biodex</td><td>Model 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

biochemical assays for analyzing activities of atp-dependent chromatin remodeling enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

הנתונים מראים תוצאות נציג של מבחני ביוכימיים משמשים כדי לאפיין פעילויות INO80, כוללים הנוקלאוזום הזזה (איור 1) ומחייב (איור 2) מבחני ודנ&quot;א או מבחני הנוקלאוזום תלוי ATPase (איור 3). הניסוי שמוצג באיור 1</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes at JoVE.com

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

biochemical-assays-for-analyzing-activities-atp-dependent-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  Stowers Institute for Medical Research. Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Video: Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Genetics

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Biochemistry

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Cancer Research

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting of two copies of the core histones H2A, H2B, H3, and H4, wrapped around by the DNA. The octamer is composed of two copies of an H2A/H2B dimer and a single copy of an H3/H4 tetramer. The highly charged core histones are prone to non-specific interactions with several proteins in the cellular cytoplasm and the nucleus. Histone chaperones form a diverse class of proteins that shuttle histones from the cytoplasm into the nucleus and aid their deposition onto the DNA, thus assisting the nucleosome assembly process. Some histone chaperones are specific for either H2A/H2B or H3/H4, and some function as chaperones for both. This protocol describes how in vitro laboratory techniques such as pull-down assays, analytical size-exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation, and histone chaperoning assay could be used in tandem to confirm whether a given protein is functional as a histone chaperone.

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

This protocol describes a battery of methods that includes analytical size-exclusion chromatography to study histone chaperone oligomerization and stability, pull-down assay to unravel histone chaperone-histone interactions, AUC to analyze the stoichiometry of the protein complexes, and histone chaperoning assay to functionally characterize a putative histone chaperone in vitro.

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in response to environmental stimuli. These changes are essential for genomic integrity, epigenetic regulation, and DNA metabolic reactions such as replication, transcription, and repair. Chromatin assembly is crucial for chromatin dynamics and is catalyzed by histone chaperones. Despite extensive studies, the mechanisms by which histone chaperones enable chromatin assembly remains elusive. Moreover, the global features of nucleosomes organized by histone chaperones are poorly understood. To address these problems, this work describes a unique single-molecule imaging technique named DNA curtain, which facilitates the investigation of the molecular details of nucleosome assembly by histone chaperones. DNA curtain is a hybrid technique that combines lipid fluidity, microfluidics, and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) to provide a universal platform for real-time imaging of diverse protein-DNA interactions.Using DNA curtain, the histone chaperone function of Abo1, the Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase, is investigated, and the molecular mechanism underlying histone assembly of Abo1 is revealed. DNA curtain provides a unique approach for studying chromatin dynamics.

DNA curtain, a high-throughput single-molecule imaging technique, provides a platform for real-time visualization of diverse protein-DNA interactions. The present protocol utilizes the DNA curtain technique to investigate the biological role and molecular mechanism of Abo1, a Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase.

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

פיתוח בדיקה מבוססת קליק לבדיקת פעילות האנזים HAT1

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

מחבר זרקור: פיתוח בדיקת אצטיל-קליק להקרנת מעכבי HAT1

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה