This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

1 Preparación de muestras biológicas para criofractura / Freeze-grabado <ol><li> Utilice una formulación convencional fijador EM tales como glutaraldehído al 2% + 2% de paraformaldehído en tampón de fosfato 0,1 M durante 1 hora. para llevar a cabo la fijación primaria de los tejidos biológicos. NOTA: Si bien puede ser deseable para congelar algunos tipos de especímenes sin fijación previa, patógenos transmitidos por la sangre precauciones universales exigen fijación apropiada cuando la muestra se compone de tejido humano. </li><li> Después de la fijación primaria, enjuagar la muestra en el mismo tampón suplementado con 0,2 M de sacarosa por no más de 1 hr. </li><li> Transferir la muestra a una solución crioprotector que consiste en 25% de glicerol en tampón de fosfato 0,1 M durante no más de 1 hr. </li></ol> 2. Congelación y almacenamiento de muestras por adelantado de Freeze-fractura <ol><li> Seleccione oro o cobre talones de muestras de tamaño y forma apropiada para la muestra que se procesan (Figura 4 </strong&gt;). </li><li> Con unas pinzas finas de grado y / o de calibre pequeño de posición agujas de jeringas pequeños fragmentos de la muestra en la parte superior del talón de un espécimen de metal. <ol><li> Reducir el contenido de líquido de la muestra a un pegajoso, ligeramente pegar consistencia extrayendo líquido desde el borde del talón con papel de filtro. </li><li> Para réplicas individuales, utilice pequeñas agujas de jeringa de calibre para crear un montículo de tejido en el talón. Para doble réplicas, invertir otro trozo y colocarlo exactamente sobre el trozo y colocarlo ligeramente sobre la superficie del espécimen creando un sándwich (Figura 5A). No presione la muestra de entre los dos talones. </li></ol></li><li> Llene dos vasos Dewar aisladas con nitrógeno líquido. NOTA: El primer buque tiene capacidad para un poste de metal que contiene un pequeño pozo que se utiliza para licuar un pequeño volumen de gas propano de un cilindro disponible comercialmente (Figura 5B). El segundo recipiente es un almacenamiento seccionada / depósito de almacenamiento de brevely mantener muestras congeladas en nitrógeno líquido. <ol><li> El uso de la boquilla del cilindro colocado en el pozo de propano, abra la válvula del cilindro y permite que el gas fluya hacia el pozo del buque donde se licua. NOTA: ATENCIÓN !! PROPANO ES EXPLOSIVO, PUEDE CAUSAR CONGELACIÓN DE LESIONES EN CONTACTO, Y ES UN ASFIXIANTE. Use sólo con propano en una campana química certificada para tal uso cuidando también de evitar las fuentes de ignición extraños, utilizando prendas de protección contra las temperaturas bajas, y el mantenimiento de una ventilación adecuada. </li><li> Lo más rápido posible, recoger la muestra de montaje con unas pinzas finas de grado y se hunden en el gas licuado en el primer recipiente durante varios segundos y luego transferir rápidamente al segundo recipiente de retención de nitrógeno líquido (Figura 5B). </li><li> Una vez que las muestras se congelan, almacenan en nitrógeno líquido hasta que esté listo para transferir a la planta de congelación-fractura. Transfiera los talones a un mayor almacenamiento de nitrógeno líquido recipiente Dewar para extendersealmacenamiento, si se desea, sin embargo se debe tener cuidado de no permitir que los talones se descongele. </li></ol></li></ol> 3. Funcionamiento de la congelación-fractura de procesamiento de instrumentos y muestras <ol><li> Cargando muestras en el soporte de latón y dentro de la cámara <ol><li> Cargue los talones de muestras de oro en un portamuestras doble réplica de tipo folleto o sujetar el dispositivo en nitrógeno líquido y mantener allí hasta que esté listo para colocar en la cámara de muestra (Figura 6). </li><li> Cuando la cámara ha alcanzado alto vacío (aproximadamente 2 x 10 -6 mbar) y la etapa se ha enfriado a la temperatura del nitrógeno líquido, apague la bomba, ventilar la cámara, y la posición de las muestras talones monta sobre la mesa muestra lo más rápidamente posible . </li><li> Encienda la bomba, restablecer alto vacío, y el uso de los controles de fase y temperatura brazo electrónico para ajustar la temperatura de la tabla de muestras a -100 ° C y el nitrógeno líquido directo al brazo microtomo y bring a la temperatura del nitrógeno líquido. </li></ol></li><li> El proceso de fractura <ol><li> Sobre la realización de alto vacío, una temperatura de -100 º C etapa y el brazo micrótomo a temperatura de nitrógeno líquido, abrir de forma remota el titular doble réplica espécimen fracturando así los ejemplares en los montes de muestras (por congelación fracture_movie1.mov). </li><li> En el caso de especímenes destinados para el grabado después de una fractura, utilice una hoja de afeitar mantenido en una abrazadera en el brazo microtomo para afeitarse (es decir, la fractura) de la superficie de los especímenes en lugar de la etapa 3.2.1 (congelar-etch_movie2.mov). </li><li> Si la etapa de congelación-aguafuerte añadido se va a realizar, posicionar el brazo microtomo enfriado sobre las superficies fracturadas de uno a varios minutos. NOTA: Esta maniobra sublimar (es decir, etch) el agua de la superficie fracturada. El efecto de esta maniobra es revelar superficies verdaderas células, matriz extracelular, y / o ensamblajes moleculares por sublimación de agua, además de framagen caras de pasar a través de la bicapa lipídica de las membranas. </li></ol></li><li> Sombreado metal y apoyo réplica de evaporación utilizando cañones de electrones <ol><li> Active la pistola de platino / electrones de carbono o la resistencia y deje que se evapore una capa delgada (aproximadamente 2 nm) de platino / carbono sobre la superficie fracturada de un ángulo de 30 º - 45 º. Esto normalmente requiere aproximadamente al 15 - 20 seg. </li><li> Activar el electrón de carbono o pistola de resistencia como en el paso 3.3.1 y evaporar una capa delgada de carbono a la superficie de la muestra fracturada directamente desde arriba (90 º) para dar apoyo a la réplica. Esto normalmente requiere aproximadamente al 15 - 20 seg. </li></ol></li><li> Recuperación de réplicas <ol><li> Al finalizar el remedo de replicación y la estabilización de carbono, apague la bomba de vacío, ventilar la cámara, y retire la pieza de montaje del instrumento. </li><li> Con un par de pinzas finas grado quitar cada trozo de muestras de oro del dobleréplica de folleto / pinza y dejar descongelar durante varios segundos antes de bajar suavemente el talón sobre una superficie de agua en una placa punto (Figura 7). NOTA: La réplica de carbono / platino que contiene material de muestra adherente flotará sobre la superficie del agua. </li><li> Maniobrar las réplicas utilizando ya sea un bucle de alambre fino o una rejilla de microscopio electrónico de cobre convencional en poder de fórceps grado fino y la transferencia a otro punto de la placa que contiene 5% de dicromato de sodio en ácido sulfúrico al 50% durante una a varias horas. NOTA: Este baño digiere el material de muestra biológica real de la réplica. Fuerza completa cloro de uso doméstico puede ser sustituida por la solución de ácido dicromato / sulfúrico. </li><li> Cuando la digestión es completa, transferir la réplica de nuevo a una superficie de agua limpia y recuperar en una rejilla estándar de microscopía electrónica de cobre. (NOTA: Réplicas puede fragmentarse en trozos más pequeños durante la digestión, sino incluso muy pequeñas réplicas puede contener información importante y debería ser retrieved y examinado.) réplica tienda apoyando rejillas en cajas de la red disponibles en el mercado donde permanecerán estables durante años con un manejo suave. </li></ol></li></ol> 4. ultraestructural Examen de criofractura / Réplicas de grabado <ol><li> Ver réplicas en un microscopio electrónico de transmisión a un voltaje de aceleración típicamente 50 a 80 kV. </li><li> Graba imágenes relevantes sobre la película TEM estándar o con una cámara digital de alta resolución. </li></ol>

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	<li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens.">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li><li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker.">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li><li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues.">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li><li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+faces+of+frozen+membranes.">Fracture faces of frozen membranes.</a> ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release.">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+inner+dynein+arms,+radial+spokes,+and+the+central+pair/projection+complex+of+cilia+and+flagella.">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+the+outer+dynein+arm.">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li><li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick-freeze,+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells.">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+freeze,+deep+etch+of+the+cytoskeleton.">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li><li>Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy:+Methods+and+Protocols.">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li><li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization.">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li><li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+membrane.">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li><li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future.">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium.">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium:+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture.">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+organization,+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets.">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li><li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability.">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro.">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium:+A+freeze-fracture+study.">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li><li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells.">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li><li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2++in+epithelial+cells.">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li><li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+teratogen+on+[3H]uridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions.">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li><li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium.">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell &amp; Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection.">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease.">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect &amp; Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li><li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung.">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute,+low+level+sulfur+dioxide+exposure.">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis.">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li><li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke.">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li><li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy,+surface+replication,+freeze-etching+and+label+fracture.">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes.">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li><li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes.">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

En los años siguientes a su introducción y disponibilidad comercial, congelación-fractura / procedimientos de grabado fueron ampliamente utilizados para investigaciones de la estructura de la membrana biológica. De hecho, las mejores perspectivas de algunas de las especializaciones estructurales de las membranas se han obtenido en las preparaciones de congelación-fractura / Etch. Estos estudios no sólo han contribuido a la comprensión de la organización estructural de las membranas, pero también proporcionaron ...

El concepto y la aplicación práctica de procesamiento de congelación-fractura de las muestras biológicas se introdujo por Steere 1 más de la mitad de hace un siglo. El aparato temprana apropiado componentes dispares en una unidad autónoma de trabajo 1. El aparato original fue modificado y refinado en instrumentos disponibles comercialmente con el fin de acomodar la necesidad crítica para la manipulación a distancia, el mantenimiento de alto vacío, y la evaporación de carbono y metales para producir una réplica adecuado para el examen por microscopía electrónica de transmisión (Figura 1 y la Figura 2). El instrumento típico consiste en una cámara de alto vacío con mesa de espécimen y el brazo microtomo tener rendimientos de nitrógeno líquido regulables (Figura 1). La cámara también cuenta con dos cañones de electrones, uno para la estabilización de la evaporación de carbono colocados en un ángulo de 90 º a la platina y el otro para platinum / carbono sombra en un ángulo ajustable, típicamente 15 º - 45 º (Figura 2). Alimentación a la unidad se aplica para accionar la bomba de vacío y paneles electrónicos regular ajuste de la temperatura y de electrones control de armas. Originalmente concebido como un medio para lograr una mejor imagen de los virus, criofractura ganado aún más popularidad como una técnica para el examen y análisis de las membranas celulares y sus especializaciones 2, 3. De hecho, este procedimiento ha sido parte integral de la aclaración de las relaciones estructura / función en las células y tejidos, y muchos de estos estudios destacan como clásicos contribuciones a la biología celular y molecular 4-9. El principal objetivo y razón para el desarrollo de la técnica de congelación-fractura era limitar los artefactos observables en la resolución microscópica de electrones derivados de la fijación química y el procesamiento utilizado en microscopía electrónica biológico convencional. Aquí el objetivo es limitar químicala fijación y para congelar la muestra con suficiente velocidad y con frecuencia en presencia de un crioprotector a fin de limitar la formación de cristales de hielo y otros artefactos de congelación. Más recientemente, esta técnica ha encontrado un resurgimiento del interés por parte de los biólogos moleculares y los investigadores de ciencia de los materiales para el examen de las nanopartículas y nanomateriales. Imágenes criofractura y el embargo preventivo de grabado exhiben un carácter tridimensional y, a veces se confunden con microscopio electrónico de barrido. Sin embargo, los preparativos de congelación de fractura son examinadas por microscopía electrónica de transmisión y de su importante contribución a los estudios morfológicos de alta resolución es su representación única de elementos de estructura / función de las membranas celulares. Procesamiento de congelación-fractura se inicia mediante la congelación de células y tejidos con una velocidad suficiente para limitar la cristalización del hielo y / o con el uso de agentes crioprotectores tales como glicerol. Las muestras son luego fracturaron al vacío y un representantelica se genera por evaporación de carbono y platino sobre la superficie fracturada. El ejemplar original se digiere de la réplica de la que se recupera en una rejilla de muestras estándar de EM. Otra mala interpretación común de las imágenes de congelación de fractura es que representan las superficies celulares. Sin embargo, la premisa básica de congelación-fractura es que las membranas biológicas se dividen a través de la bicapa lipídica por el proceso de fractura (Figura 3). Este proceso en las membranas biológicas produce dos caras de fractura, uno que revela la organización de la media de la membrana adyacente al citoplasma, el PF-cara, y uno que revela la media de la valva bimolecular de la membrana que está adyacente a la extracelular medio, el EF-cara. Superficies celulares verdaderos no están representados en imágenes de congelación-fractura, pero sólo aparecen cuando se utiliza la etapa posterior añadido de congelación-grabado siguiendo el procedimiento de la fractura. Para grabar con eficacia especímenes previamente fracturados para revelar deta superficiel, los especímenes deben congelarse a un ritmo rápido y sin unetchablecryoprotectant. Grabado de agua de la superficie de la muestra fracturadas que revelan características subyacentes se lleva a cabo colocando el brazo microtomo enfriamiento durante la etapa de muestra de la creación de un diferencial de temperatura entre la etapa de celebración de la muestra y el brazo microtomo de enfriamiento que hace que el agua para sublimar de la superficie. Cuando el agua se sublima desde la superficie de la muestra fracturados durante la maniobra de congelación-aguafuerte, a continuación, los aspectos de las superficies reales de células, matriz extracelular, las estructuras del citoesqueleto, y conjuntos moleculares pueden ser revelados a alta resolución. Así por congelación y congelar fractura de grabado no son términos intercambiables sino más bien refleja un proceso paso a paso el último de los cuales puede no ser necesario o deseable dependiendo de las necesidades del estudio particular. A raíz de la congelación-fractura / congelar-grabado procedimientos, las superficies fracturadas se someten a evapora dirigidosTIVE capas de carbono y platino con el fin de proporcionar apoyo y formación de imágenes de contraste a la réplica. El platino imágenes evaporación / carbono puede ser unidireccional o rotatorio y se lleva a cabo por cualquiera de resistencia o cañones de electrones. Sombreado unidireccional desde un ángulo conocido, típicamente 30 º - 45 º, es útil en la realización de ciertos cálculos morfométricos. Las muestras que han sido sometidos a lo profundo de grabado normalmente son rotatorio sombra y las imágenes resultantes de estos especímenes son fotográficamente invierten para su evaluación. El histórico, así como una meta actual de la / técnica de congelación de grabado de congelación-fractura es limitar la fijación química y procesamiento de muestras artefactos que están asociados con los procedimientos de microscopía electrónica de transmisión más convencional. Sin embargo, esta técnica proporciona una ventaja sustancial en su capacidad para conferir detalle en tres dimensiones y por lo tanto facilitar la adquisición de los datos morfométricos en biológica, ciencia de los materiales, y nespecímenes anotechnology. Procedimientos criofractura y el embargo preventivo de grabado son complejos y de múltiples facetas y algunos aspectos de su aplicación son personalizados. Esta presentación ofrece una visión encuesta de las principales características del proceso y se remite al lector a los protocolos completos publicados 10, 11 con el fin de abordar los detalles y personalizar el proceso para las necesidades específicas de investigación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

Criofractura / congelación grabado describe un proceso por el cual las muestras, por lo general biológico o nanomaterial en la naturaleza, se congelan, fracturar y replicado para generar un carbono / platino &quot;fundido&quot; destinada a examen mediante microscopía electrónica de transmisión. Las muestras se someten a la tasa de congelación ultrarrápidos, a menudo en presencia de agentes crioprotectores para limitar la formación de cristales de hielo, con posterior fractura de la muestra en nitrógeno líquido enfría temperaturas bajo alto vacío. La superficie fracturada resultante se replica y se estabilizó por evaporación de carbono y platino desde un ángulo que confiere detalle superficie tridimensional para el reparto. Esta técnica ha demostrado ser particularmente instructivo para la investigación de las membranas celulares y sus especializaciones y ha contribuido considerablemente a la comprensión de la forma celular para la función celular relacionada. En este informe, examinamos los requisitos de instrumentos y protocolo técnico para la realización decongelación-fractura, la nomenclatura y las características de los planos de fractura asociado, las variaciones en el procedimiento convencional, y criterios para la interpretación de las imágenes de congelación de fractura. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para la investigación ultraestructural en muchas áreas de la biología celular y mantiene la promesa como una técnica de imagen molecular emergente de la nanotecnología, y los estudios de la ciencia de materiales.

La premisa fundamental de la interpretación de imágenes de criofractura es que los planos de fractura pasan a través de la bicapa lipídica de las membranas que confieren dos caras de fractura, llamada por convención el PF-cara (plasma fractura-cara) y EF-cara (fractura-cara extracelular) (Figura 3). El PF-cara es la mitad de la bicapa lipídica de la membrana adyacente al citoplasma de la célula y el EF-cara es la mitad de la bicapa lipídica de la membrana adyacente al medio extracelular. La téc...

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Se describen las técnicas básicas y los refinamientos de procesamiento de congelación-fractura de las muestras y los nanomateriales biológicos para el examen por microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es un método preferido para revelar características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas y para la obtención de datos de dimensiones y espaciales a nivel ultraestructural en ciencias de los materiales y productos de la nanotecnología.

Fundamental elementos técnicos de Freeze-fractura / Freeze-grabado en Biológica Microscopía Electrónica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K vistas.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  Se describen las técnicas básicas y los refinamientos de procesamiento de congelación-fractura de las muestras y los nanomateriales biológicos para el examen por microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica es un método preferido para revelar características ultraestructurales y especializaciones de las membranas biológicas y para la obtención de datos de dimensiones y espaciales a nivel ultraestructural en ciencias de los materiales y productos de la...

Video: Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Investigación

Biología

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Microscopía Electrónica De Barrido Bloque-Cara Serial (SBF-SEM) De Muestras De Tejido Biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Estrategias para la optimización de la adquisición de datos de tomografía electrónica criogénica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Congelación rápida utilizando un dispositivo de congelación sándwich para una buena preservación ultraestructural de especímenes biológicos en microscopía electrónica