La investigación en los laboratorios es financiado por la Fundación Fritz-Bender, Múnich, Alemania (a TD) y de la Universidad de Witten / Herdecke beca de investigación interna (a W.-KL). Nos gustaría agradecer a Prof. Dr. Dr. Frank Thévenod (Instituto de Fisiología, Fisiopatología y Toxicología de la Universidad de Witten / Herdecke) para sugerencias útiles.

1. Preparación de Reactivos y Soluciones <ol><li> Preparar la solución de una sal equilibrada de Hank modificada (HBSS) (en mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 de NaHCO3, pH 7,2, sin rojo de fenol). Almacenar a 4 ° C. </li><li> Hacer 1,5 M CaCl 2 y 2 M 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) (pH 7,2) soluciones madre usando agua destilada. </li><li> Preparar una solución madre 250 mM de probenecid. Por la forma de ácido libre (a menudo referida como insolubles en agua), disolver en polvo probenecid en NaOH 1 N, llenar tres cuartas partes del volumen final con agua destilada y titular lentamente a pH 7,4 con HCl 1N. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Disolver membrana fluorescente de calcio permeable colorante de unión en sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO) a una concentración madre de 1 mM. Conservar a -20 ° C en la oscuridad. </li><li> Antes de cada experimento, recién preparar H que contiene probenecid-BSS flujo (PHF) mediante la combinación de tampón modificado con HBSS (en concentraciones finales) 1,5 mM CaCl 2, HEPES 10 mM, pH 7,2, suero bovino fetal al 5%, probenecid 2 mM, 5,55 mM y glucosa. Calentar a 37 ° C. </li></ol> 2. Cultivo Celular <ol><li> Placa de células de 2,5 x 10 5 renales proximales tubulares (WKPT-0293 CL.2) por pocillo de una placa de 6 o 35 mm plato en medio de cultivo estándar y crecen durante 2 días alcanzando una confluencia de aproximadamente el 70%. </li></ol> 3. Calcio colorante de carga <ol><li> Para cada plato o bien, mezclar 1 ml de medio de cultivo que contiene suero bovino fetal al 5%, 4 mM celular permeable colorante de unión a calcio y probenecid 2 mM. </li><li> Sustituir el medio de cultivo con 1 ml de mezcla de colorante de carga en cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 30 min en un incubador humidificado con 5% de CO 2. Cubrir la placa con papel de aluminio para evitar la decoloración del indicador fluorescente. </li></ol> 4. Preparación de CeLLS para citometría de flujo <ol><li> Ácido etilendiaminotetraacético caliente tripsina 0,05% (EDTA) solución a 37 ° C. </li><li> Aspirar la solución de calcio colorante de carga de cada pocillo y añadir 1 ml de tripsina a lo largo de la pared del pozo. </li><li> Incubar a 37 ° C hasta que se separan todas las células. </li><li> La transferencia de células a un tubo de 1,5 ml y pellet por centrifugación en una microcentrífuga a 10.000 g durante 1 min. </li><li> Aspirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li><li> Lavar las células mediante la adición de tampón de PHF 1 ml y resuspender pipeteando arriba y abajo. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 10.000 g durante 1 min. </li><li> Repita los pasos 4.6. y 4.7. otras dos veces. </li><li> Resuspender las células en un volumen final de 500 l de tampón PHF y utilizar las células para la experimentación dentro de 1 hr. </li><li> Opcional: células de recuento para determinar la concentración de células y usan 5 × 10 4 - 1 x 10 5 células por medición. </li></ol> 5. Flujo CytConfiguración ometer <ol><li> Iniciar el citómetro de flujo, abrir el cajón de fluidos y activa el interruptor de palanca de válvula de ventilación para aumentar la presión de aire del tanque de fluido de funda. </li><li> &quot;Prime&quot; el instrumento para eliminar posibles burbujas de aire que residen dentro de las cámaras de aire y la cámara de flujo. </li><li> En el software de citometría de flujo, abrir dos ventanas de la trama de puntos. <ol><li> El primer gráfico de puntos requiere luz dispersada hacia adelante (FSC) para el parámetro X y luz dispersada lateral (SSC) para el parámetro Y para el control de la calidad de las células dentro de la muestra a través de su tamaño y su granularidad, respectivamente. </li><li> El segundo gráfico de puntos mide la intensidad de la fluorescencia del colorante de calcio unido. Seleccione el canal de detección de fluorescencia adecuado para el parámetro Y usando una escala logarítmica y el tiempo en segundos para el parámetro X en una escala lineal. </li></ol></li><li> Ajuste el caudal de &quot;alto&quot;. </li></ol> 6. Citometría de Flujo Measurement <ol><li> Realizar las mediciones a temperatura ambiente. En un tubo de citometría de flujo de la muestra (11,5 x 75 mm), añadir tampón de PHF 480 l. </li><li> Añadir 20 l de suspensión celular y vortex brevemente para mezclar. </li><li> Mover el brazo de soporte de tubo a un lado y posicionar el tubo de muestra sobre el tubo de inyección de la muestra hasta que se forme un sello hermético. Devuelva el brazo de soporte del tubo a su posición centrada originales. </li><li> Optimizar la medición mediante el ajuste del canal de fluorescencia de tal manera que la intensidad de fluorescencia media de la muestra es de aproximadamente 10 2 en el eje y. Guardar y utilizar para experimentos posteriores. </li><li> Para iniciar un experimento, repita los pasos 6.1 a 6.3. </li><li> Fluorescencia basal Record de 50 seg. </li><li> Pausa de medición, retire el tubo de la muestra, añadir compuesto de interés, vórtice brevemente y volver al tubo de inyección de la muestra. Este paso no debe tomar más de 15 segundos. </li><li> Reanudar la medición y continuar por un total de 204,8 seg. </li><li> Use un i calcioonophore, tales como ionomicina (10 mM), y un quelante de calcio, tal como etilenglicol tetraacético (EGTA), MnCl 2 o CoCl 2 (2 mM), para los controles positivos y negativos, respectivamente. </li></ol> Análisis 7. Datos <ol><li> Analizar datos utilizando el software citometría de flujo dedicado para análisis fuera de línea, como WinMDI (Windows Interfaz de documentos múltiples para citometría de flujo), un paquete de software libre desarrollado por Joe Trotter en el Instituto Scripps, Fondo de Citometría de Flujo. </li><li> Abrir un gráfico de puntos con los parámetros del SSC y FSC. </li><li> Seleccione la región de las células para el análisis utilizando la herramienta &quot;Regiones&quot; (botón derecho del ratón en la imagen) para excluir las células muertas o restos de células que se encuentra en la esquina inferior izquierda del análisis de datos (Figura 1). </li><li> Cuadrante análisis (Figura 2) <ol><li> Abrir una gráfica de densidad con el tiempo en el eje x y la intensidad de fluorescencia en el eje y. Utilice todos los eventos. </li><li> Nosotrose la misma región gating como en 7.3. </li><li> Cuantificar los datos mediante el uso de la herramienta &quot;Cuadrante&quot;. </li><li> Ajuste los separadores de cuadrante de modo que la línea vertical se coloca en el momento de la adición del compuesto y la línea horizontal se coloca en el centro de la fluorescencia basal en los controles. Asegúrese de que la colocación de los separadores de cuadrante es igual en todas las muestras. </li><li> El porcentaje de células en cada cuadrante se muestra en cada esquina (Figura 2). Compare el cuadrante superior derecho (UR) entre las muestras. </li></ol></li><li> Análisis de histograma (Figura 3) <ol><li> Abra los datos de control en una ventana del histograma con la intensidad de fluorescencia en el eje x y eventos en el eje y. Utilice todos los eventos. </li><li> Para una visión pictórica, agregar los datos de las pruebas para ser comparado con la parcela de control como parcelas de superposición (vaya a Archivo → Abrir Archivo → → Seleccionar archivo de superposición). </li><li> Para el análisis cuantitativo, solo histograma ganardows deben ser utilizados. Puerta de la población celular utilizando la región R1 desde el paso 7.3. </li><li> En el control no tratado, utilizar la función de marcador (&quot;marcadores&quot;) para marcar el área para el análisis de partida desde el punto medio entre el mínimo y el máximo de fluorescencia del pico de control y terminando en la intensidad de fluorescencia máxima. El porcentaje de células en esta área se calcula. </li><li> Recuperar los datos de la ventana de estadísticas. Repita para el resto de los ficheros de datos usando la misma zona marcada para el análisis. </li></ol></li><li> Análisis de la intensidad de fluorescencia (Figura 4) <ol><li> Abrir un gráfico de puntos con el tiempo en el eje x y la intensidad de fluorescencia en el eje y. Utilice todos los eventos. </li><li> Habilitar &quot;Modo Cinética&quot; y &quot;Superposición línea Cinética&quot;. Una línea azul aparecerá en el gráfico de puntos que representa la intensidad media de fluorescencia. </li><li> Cuantificar la entrada de calcio en relación con la creación de varias regiones rectangulares. Cada región debe tener awAncho de la de &quot;50&quot;, que es equivalente a &quot;10 sec&quot;. Definir hasta 15 regiones rectangulares. </li><li> Recuperar la cuantificación de la ventana de las estadísticas y de la copia en una hoja de cálculo. </li><li> Utilice los datos-y media para el análisis. Calcular la media de R2 a R6, que es equivalente a 20 a 50 seg. Este es el valor de línea de base. </li><li> Elija un intervalo de tiempo apropiado para el análisis del flujo de calcio (depende de inicio, duración e intensidad). </li><li> Calcular las señales de calcio de cada región dentro de este intervalo de tiempo con respecto al valor basal media, es decir, la señal de fluorescencia antes de la adición del compuesto, que se establece a 100%. Determinar la media y la desviación estándar de las regiones Publicación de la adición del compuesto; esta es la señal de calcio media evocada por el compuesto. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El calcio es un acontecimiento clave en múltiples procesos celulares que actúan como una segunda molécula de señalización mensajero y también como un medio para comunicar entre el ER y las mitocondrias. La capacidad de medir los cambios en las concentraciones de calcio libre citosólico es una técnica útil que puede aplicarse a todas las áreas de la biología celular. Hay varios métodos para detectar señales de calcio citosólico. Clásicamente, las señales de un indicador de calcio radiométrico, como Fura-...

El calcio es un segundo mensajero importante responsable de la transmisión de señales fisiopatológicos 1 fisiológica celular y. Las concentraciones de calcio citosólico se mantienen bajos a través de la actividad de las bombas y los intercambiadores de calcio de calcio. La ATPasa de calcio del retículo / endoplasmático sarcoplásmico (SERCA) rellena el retículo endoplasmático (ER) de la tienda de calcio como parte de un sistema de &quot;fuga de la bomba&quot;, mientras que la ATPasa de calcio de la membrana plasmática (PMCA) extruye calcio para el compartimiento extracelular, tanto en modales dependientes de ATP 2. Mensajeros fisiológicos, tales como hormonas o neurotransmisores, transmiten sus señales a través de receptores acoplados a proteína G, activación de la fosfolipasa C, que hidroliza fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) en la membrana de plasma para generar diacilglicerol e inositol trifosfato (IP3) 3. Mientras diacilglicerol permanece en la membrana plasmática, IP3 se difunde en el citosol y se une al receptor de IP3s (IP3Rs), que son los canales de calcio activados ligando, que se encuentran en la membrana del RE y el calcio se libera de la tienda luminal ER que culmina en un aumento de las concentraciones de calcio citosólico 4. Una ruta alternativa para el calcio para alcanzar el citosol es a través de los canales de calcio e intercambiadores presentes en la membrana plasmática. Diafonía entre estos dos compartimentos se han descrito: la liberación de calcio inducida por calcio (CICR), donde el calcio extracelular induce la liberación de calcio desde las tiendas ER 5, y la tienda que funciona la entrada de calcio (SOCE) donde el vaciado de las tiendas ER es detectada por STIM y provoca la apertura de Orai canales de calcio en la membrana plasmática para promover la recarga de las tiendas ER 6. En condiciones fisiopatológicas, la respuesta de calcio celular está desregulado y citosólicas aumentos de calcio en la ausencia de estimuladores fisiológicos 1. La respuesta de calcio puede verse afectada en un número de maneras: calcio prolongaseñal, retraso en la eliminación de calcio desde el citosol, el agotamiento de las reservas de calcio o cambios localizados en el calcio. Además, las mitocondrias asumen un papel central en el almacenamiento en búfer y la liberación de calcio 7. Prolongado y / o aumento de calcio citosólico supramáximo conduce a la muerte celular. De hecho, el calcio es más a menudo que no participa en la respuesta fisiopatológica celular y es un evento clave en una amplia gama de enfermedades, tales como enfermedad neurodegenerativa, enfermedad del corazón, cáncer, enfermedad ósea y la enfermedad de riñón, que se asocia principalmente con la muerte celular y la pérdida o alteración de la función de órgano o tejido 8-10. Por otra parte, la perturbación de las señales de calcio se ha vinculado a la adaptación celular y cambios en las funciones celulares y las respuestas. Tradicionalmente, las señales de calcio se miden con un indicador de calcio fluorescente cargado negativamente que se carga en las células en una forma de éster de acetoximetilo celular permeable (AM). Una vez escindida por esteras celulareses, los indicadores fluorescentes permanecen dentro del compartimento intracelular y el aumento de la intensidad de fluorescencia cuando se une el calcio. El indicador de calcio más conocido y utilizado es el radiométrico Fura-2 desarrollado por Roger Tsien y sus colegas 11. Indicadores de calcio con diferentes afinidades para calcio permiten diferentes piscinas de calcio para ser monitoreados. Los métodos de detección incluyen imágenes de células vivas, lector de microplacas de fluorescencia y citometría de flujo. La cinética relativamente rápidas de señales de calcio (por lo general dentro de un par de segundos a minutos) hace que células vivas imágenes del mejor método para ganar la mayoría de la información sobre las características de la señal de calcio. Aparte de la cinética rápida de señales de calcio (dentro de milisegundos), imágenes de células vivas es un mejor método para el estudio de la compartimentación celular de señalización de calcio dentro de una sola célula 12. Las concentraciones de calcio absolutos se pueden calcular mediante la determinación de la fluorescencia mínima y máxima de la ind calcioicator mediante la adición de un quelante de calcio y de permeabilización de las células, respectivamente, como se describe por Grynkiewicz et al. 11. El uso de citometría de flujo para medir las señales de calcio fue desarrollado por primera vez en la década de 1980 en las células inmunológicas, donde la oportunidad de medir varios parámetros, tales como la integridad de la membrana y la separación de la población celular, y la exigencia de células en suspensión combinada con el desarrollo de la única longitud de onda indicadores de calcio hacen citometría de flujo de un método ideal y convenientdetection 13-15. En las células adherentes, imágenes de células vivas proporciona la mayoría de la información acerca de la señalización de calcio, lo más importante la cinética, pero requiere una instalación complicada que comprende un microscopio de fluorescencia, un sistema de perfusión, el mantenimiento del entorno celular, tales como la temperatura, y software especializado microscopio para la adquisición de y analizar los datos. Los métodos alternativos, tales como un lector de microplacas de fluorescencia o Pharmacolmedios gico a través del uso de quelantes de calcio son incomparables en términos de la información obtenida. La citometría de flujo es cada vez más ampliamente utilizados para monitorear el calcio citosólico en células adherentes, sin embargo, en la mayoría de estudios, sólo punto final de las mediciones se realizan. Utilizando el método desarrollado inicialmente por Gergely et al. En las células B inmunológicos 16, los cambios en la concentración de calcio libre citosólico mediante citometría de flujo con la cinética en tiempo real y el seguimiento de la intensidad de fluorescencia en las células individuales a partir de una población de muestra se han medido con éxito en las células epiteliales de cáncer y de células madre de cáncer híbridos 17. Este método fue adaptado, además, para su uso en células epiteliales adherentes, que son difíciles de cargar con indicadores de calcio 18. Aquí, usando una línea celular epitelial adherente inmortalizada derivada del segmento S1 del túbulo proximal del riñón de rata (WKPT-0293 CL.2) 19, se describe un m simplificado optimizadoétodo para la medición de los cambios en la concentración de calcio citosólico por citometría de flujo. Dado que muchas células epiteliales poseen un número de transportadores orgánicos de compuestos aniónicos, la carga de las células con un indicador de calcio puede llegar a ser un reto. Para evitar que el flujo de salida de indicadores de calcio, probenecid, el inhibidor prototípico de los transportadores de aniones orgánicos y originalmente desarrollado para reducir la excreción renal de la penicilina 20, se aplica simultáneamente en el medio de incubación. Las células se mantienen en monocapas de indicador de calcio de carga, llevados en señales de suspensión y de calcio pueden ser detectados inmediatamente después de la adición del compuesto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Para aumentar el calcio citosólico, dos compuestos farmacológicos se aplicaron a células renales proximales tubulares (WKPT-0293 CL.2) cargadas con colorante de unión a células de calcio permeable, Fluo-3 AM. Muestras de control no tratadas se cargaron con colorante de unión a calcio en presencia de probenecid y se mezclaron, pero sin la adición de ningún compuesto. Tapsigargina (TG) es un inhibidor de la bomba clásica SERCA dando lugar a fugas fuera de la ER y resulta en aumento de calcio citosólico. Tunicami...

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Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

El calcio está implicado en numerosas vías de señalización fisiológicos y fisiopatológicos. Imágenes de células vivas requiere equipo especializado y puede llevar mucho tiempo. Un método rápido, simple utilizando un citómetro de flujo para determinar los cambios relativos en el calcio citosólico en las células epiteliales adherentes puestas en suspensión fue optimizado.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.2K vistas.  University of Witten/Herdecke.  El calcio está implicado en numerosas vías de señalización fisiológicos y fisiopatológicos. Imágenes de células vivas requiere equipo especializado y puede llevar mucho tiempo. Un método rápido, simple utilizando un citómetro de flujo para determinar los cambios relativos en el calcio citosólico en las células epiteliales adherentes puestas en suspensión fue optimizado. 

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Investigación

Biología

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endorreduplicación medición por citometría de flujo de protoplastos aislados de tubérculos

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Medida de alto rendimiento de macropinocitosis discoideum de Dictyostelium por citometría de flujo

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Detección y caracterización de autoensamblaje de proteínas en Vivo por citometría de flujo

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana en células madre hematopoyéticas y células T por citometría de flujo

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...