Este protocolo es un ensayo basado en citometría de flujo simple que permite la medición del potencial de membrana mitocondrial y la masa mitocondrial en células vivas. Los ensayos metabólicos estándar fallan cuando se trabaja con poblaciones raras, como las células madre hematopoyéticas. Este método permite a los usuarios perfiles de membrana mitocondrial cuando se trabaja con un número bajo de células y para determinar nuevos moduladores metabólicos de células como los HSC.
Además, puede combinarlo con ensayos funcionales posteriores, como el trasplante de médula ósea o los ensayos formadores de colonias para determinar la funcionalidad de las células después del cultivo. Nuestra técnica puede ser explotada para la identificación de nuevas moléculas capaces de mejorar la función HSC en el contexto del trasplante de médula ósea y la recuperación inmune hematopoyética después de terapias ablativas. Como se describe en nuestro protocolo, nuestro método se puede utilizar para evaluar la aptitud metabólica de las células T inmunes.
Es muy importante que las células tengan una exposición mínima a la luz después de la tinción. Además, el uso de inhibidor de la bomba verapamilo debe incluirse para evaluar la contribución del eflujo de la bomba. Sin embargo, los usuarios tienen que ser conscientes de que el verapamilo perturba profundamente el equilibrio iónico y no se puede utilizar para evaluar el efecto de un modulador metabólico en el potencial de la membrana mitocondrial.
La demostración visual de este método es extremadamente importante porque hay algunos pasos críticos que uno necesita tener en cuenta al trabajar con un número bajo de celdas, y estos pasos faltan muy a menudo en los documentos regulares que los usuarios leen en PubMed. Para la clasificación FAC, se identifica la población LKS, definida por el linaje negativo, Sca1 positivo, cKit positivo. Las células madre hematopoyéticas de alrededor de cinco a 10% de las células de la población LKS se identifican mediante la medición de la población CD150 positiva, CD48 negativa, etiquetada como HSC.
Después de la clasificación de células madre hematopoyéticas, Centrifugar los tubos a 300 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire suavemente la mayor parte del sobrenadante sin desalojar el pellet, y deje de 50 a 80 microlitros encima del pellet celular. Resuspender el pellet celular en el medio de expansión de células madre a un volumen final de 200 microlitros.
Preparar un cultivo de tejido estéril tratado 96 placa de pozo de fondo en U, e identificar los pozos donde se cultivarán las células. Transfiera 100 microlitros de 2x medio basal previamente preparados en estos pozos. En el NR marcado bien, añadir dos microlitros de una solución ribósica de nicotinamida 100x.
Transfiera 100 microlitros de 2x medio basal en pozos para el control de manchas. Semilla 100 microlitros de células madre hematopoyéticas preparadas en la parte superior de los pozos que contienen 2x medio basal. Semilla 100 microlitros de células enteras de médula ósea en pozos marcados como controles de tinción.
Añadir 200 microlitros de agua autoclavada en todos los pozos circundantes para reducir la evaporación de los pozos que contienen células. Coloque la placa intacta en una incubadora a 37 grados Centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Saque el plato para reponer el ribóside de nicotinamida cada 24 horas, y vuelva a colocarlo en la incubadora.
Al final del período de cultivo, agregue dos microlitros de solución TMRM 100x y dos microlitros de solución de tinción fluorescente verde 100x en cada uno de los pozos de prueba. Agregue dos microlitros de 100x TMRM en el pozo de control de tinción TMRM. Agregue dos microlitros de mancha fluorescente verde 100x en el pozo de control de tinción MitoTracker.
Cubra la parte superior de la placa con papel de aluminio. y vuelva a colocar la placa en una incubadora a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos. Retire la placa de la incubadora y centrifugarlo a 300 g durante cinco minutos.
Invierta la placa para quitar el sobrenadante y agregue 200 microlitros de búfer FACS estándar para resuspend. Cubra el plato con papel de aluminio. Centrifugar la placa a 300 g durante cinco minutos.
Repita este paso de lavado tres veces. Resuspender las células en 200 microlitros de tampón FACS, y transferir a tubos FACS. Para ejecutar las muestras en el citómetro de flujo, primero cargue los controles de color único en la máquina y registre al menos 5.000 eventos en cada uno por uno.
En el software, presione Adquirir y, a continuación, Grabar en el panel para adquirir y grabar controles de color único. Presione Configuración de compensación y haga clic en Calcular compensación para calcular la compensación. Una vez aplicada la compensación, adquiera la muestra de células madre hematopoyéticas y registre tantos eventos como sea posible.
Exporte los archivos FACS desde el citómetro y abra el archivo en el software de análisis. En FlowJo, utilice la dispersión hacia delante y la dispersión lateral para identificar la población celular. Identifique singlets en las puertas siguientes y, a continuación, trace la fracción negativa DAPI que representa celdas vivas.
En la puerta celular viva, haga una gráfica de contorno en el canal de tinción fluorescente verde y TMRM para medir el potencial y la masa de la membrana mitocondrial, respectivamente. Exporte la intensidad media de fluorescencia de estos dos canales en la puerta de celda viva. Luego, exporte la proporción de celdas en la puerta baja TMRM en todas las muestras.
El tratamiento con riboside de nicotinamida mostró un claro aumento en la población baja de TMRM. También aumentó significativamente la proporción de células en la puerta baja TMRM y mostró una disminución significativa de la intensidad de fluorescencia TMRM. La masa mitocondrial no cambió a la suplementación con nicotinamida ribósido.
Además, la tinción del marcador de células madre se combinó con la tinción mitocondrial post-cultivo. Con la estrategia de gating para identificar las células madre hematopoyéticas, la exposición a nicotinamida ribóside mostró un aumento significativo en la población baja de TMRM y una disminución significativa en la intensidad de fluorescencia TMRM en HSC bloqueados. La señal verde de la mancha mitocondrial fluorescente verde se mantuvo sin cambios en las dos condiciones.
Es importante cubrir la placa de tinción con papel de aluminio para minimizar la exposición de la luz a las muestras manchadas. Este método se puede combinar con ensayos posteriores, como el trasplante de médula ósea y los ensayos formadores de colonias para determinar la funcionalidad de las células madre. Por lo tanto, esta técnica permite un método de cribado simple para la identificación de nuevos moduladores metabólicos de HSC.
