Nos gustaría reconocer el Fondo FCCC Animales de Laboratorio, por su apoyo en este proyecto. Damos las gracias a Wolfe Laboratories, Inc. por su asistencia en el análisis de los niveles de paclitaxel en el plasma y el tejido. Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones K01CA120091 a EHB, y CA06927 a Fox Chase Cancer Center.

Este protocolo ha sido aprobado por el Comité de Animales Cancer Center Institucional de Cuidado y Uso de Fox Chase y por el Fondo para los Animales de Laboratorio, y se encontró que de acuerdo con las directrices institucionales para el tratamiento humanitario de los animales. 1. Preparación Preliminar <ol><li> Preparación de catéter: Preparar un catéter de una longitud corta de tubo de polietileno, modificado para formar un adelgazada, el extremo romo (Figura 3A). Hacer múltiples catéteres con antelación y guardar indefinidamente. <ol><li> Enciende un mechero Bunsen, y ajuste para establecer una llama estable bajo. Sostenga el tubo cerca de la llama para suavizar polietileno. Cuando la tubería comienza a derretirse, tire lentamente aparte los dos extremos para crear una sección adelgazada de la tubería, de aproximadamente 0,25 mm de diámetro exterior. </li><li> Corte un extremo biselado de aproximadamente 0,75 cm a lo largo de la sección delgada. Esto asegura suficiente tubería para ser asegurado en la arteria, sin crear un catéter demasiado largo. NOTA: Un final largo y delgado en el the catéter tiene una propensión a obstruir. Un final demasiado largo también puede contener suficiente líquido para cambiar significativamente la capacidad de volumen de líquido del catéter. </li><li> Embotar el extremo biselado pasando rápidamente a través de la llama - cuando está debidamente climatizada, al final se convierte en ligeramente redondeada y ampliada. Los ganchos de punta ligeramente hacia atrás, lo que ayuda a anclar el tubo mientras se inserta en la arteria. </li><li> Cortar el tubo de 6,0 cm alrededor del punto donde comienza a adelgazarse. Esto hace que un catéter muy manejable, que es el tiempo suficiente para enhebrar a través de la salida desde el cuello, y ocupar y trabajar con comodidad, pero lo suficientemente corto como para evitar que el ratón de roer en exceso de tubo o que requieren demasiado volumen de infusión extra para despejar salina inicial . </li><li> Prepare una jeringa de aproximadamente 0,2 ml de solución de heparina, rematado con una aguja roma. Insertar la aguja en el extremo ancho del catéter (Figura 3B). Llenar el catéter con heparina, con cuidado para asegurarse de que no haya burbujas enel tubo. Ajuste la jeringa con heparina y el catéter a un lado en un área estéril. Esterilizar catéteres mediante irradiación gamma, mediante la colocación de catéter (s) en una placa de Petri, y exponiendo a 20 Gy de irradiación gamma. Si usted no tiene acceso a una fuente de radiación gamma, consulte con su instalación de animales para investigar otros medios de esterilización, tales como gas o químico-esterilización. No esterilice en autoclave, como el polietileno no se puede esterilizar calor. </li></ol></li><li> Creación de una ventaja de solución salina (Figura 3B). <ol><li> Preparar una segunda jeringa de aproximadamente 0,5 ml de solución salina estéril, con cuidado para asegurar una línea libre de burbujas. </li><li> Cortar una segunda pieza de tubo, aproximadamente 15 cm, y el deslizamiento en la aguja de la jeringa roma. Adjuntar un puerto de conector en el extremo libre de la tubería. </li><li> Prueba de que el flujo de solución salina no está obstruido por el avance sin problemas un pequeño volumen de solución salina a través de la iniciativa. Utilice este cable salina después de la inserción del catéter, para comprobar el flujo a través deel catéter, y para limpiar la línea de sangre. Ajuste la jeringa con solución salina a un lado en un área estéril. </li></ol></li><li> Antes de la cirugía, esterilizar el equipo en autoclave, o alternativamente por la esterilización por gas o esterilización de perlas de vidrio. </li><li> Prepare el área quirúrgica estéril. <ol><li> Limpie banco y microscopio superficies con desinfectante como el 70% de etanol o dióxido de cloro. Cubra banco y base del microscopio con una almohadilla absorbente desechable limpio. </li><li> Preparar una tabla quirúrgica cubriendo con dos capas de papel absorbente y limpia, con apego seguro con cinta adhesiva. </li></ol></li><li> Coloque todos los suministros quirúrgicos (como catalogada en la Lista de Materiales) de modo que sean fácilmente accesibles. <ol><li> Corte tres longitudes de sutura estéril, 8 cm cada una, y dejar de lado a otros suministros. Coloque un puerto donde será fácilmente disponible (Figura 3B). </li></ol></li></ol> 2. Cirugía <ol><li> Preparación del animal <ol><li> Anesthetize ratón por la exposición a un 2-3% isoflurano en la cámara conectada a la anestesia vaporizador de precisión. Retirar del ratón de la cámara, y afeitar el pelo del cuello / parte superior del torso del ratón, y por debajo de la oreja derecha (sitio de salida del catéter). Administrar veterinaria vaselina pomada oftálmica para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Asegúrese de que el animal no despertar durante las preparaciones quirúrgicas permitiendo ratón tiempo suficiente en la cámara de inhalación antes de la preparación de (al menos dos min), o mediante la administración de isoflurano al ratón por medio de un cono de la nariz durante la preparación. Ratón Vuelta a la cámara de la anestesia. </li><li> Cuando ratón es suficientemente inerte, mover a la zona quirúrgica estéril, colocar cono de la nariz anestesia sobre la nariz del ratón y la boca, y desviar el flujo de isoflurano al cono de la nariz. Confirmar anestesia adecuada pellizcando la pata con fórceps; cuando el ratón no muestra ninguna reacción, proceder al siguiente paso. </li><li> Coloque el ratón sobre la espalda, con frente a la cabeza en dirección a lainvestigador. Asegure las orejas, patas delanteras y patas traseras a bordo quirúrgica con cinta adhesiva u otro dispositivo de retención para mantener el ratón estacionario. Limpie el área de la incisión con povidona yodada y etanol al 70%. </li></ol></li><li> Aislamiento de la arteria carótida <ol><li> Hacer un corte longitudinal de 1 cm ligeramente a la derecha de la línea media del cuello. El uso de fórceps para separar la grasa y el músculo para exponer la tráquea (Figura 4A). Localice la arteria carótida paralela a la tráquea (Figura 4B). </li><li> Utilizar con cuidado unas pinzas a la fascia separada que recubren la arteria (Figura 4C). Tirar ligeramente el nervio vago, aparte de la carótida, e insertar los fórceps en el espacio entre. Pinzas suavemente abiertos para crear un vacío en la fascia, y cuidadosamente se alejan del nervio de la arteria, desde el tenedor en la arteria cerca de la laringe (extremo anterior), hacia arriba (posterior) en la medida de lo posible (por lo menos 3 mm) ( Figura 4D). </li><li> Desactive la basura cualquier refascia restante hasta que la arteria está bien aislado (Figura 4E). Añadir una gota de solución salina a la zona de la cirugía de vez en cuando para mantener el tejido húmedo, y por lo tanto menos frágil y menos propenso a la rotura al azar. </li></ol></li><li> Colocación de la sutura y la preparación para la inserción del catéter de la arteria (Figuras 4, 5). <ol><li> El uso de fórceps para extraer un hilo de sutura de seda debajo de la arteria. Ate un nudo seguro para cerrar la arteria en la medida hacia la parte anterior como sea posible (Figura 4F). </li><li> Dibuja un segundo hilo por debajo de la arteria. Haga un nudo retráctil para cerrar temporalmente la arteria en la medida hacia la parte posterior de lo posible (Figura 4F). </li><li> Dibuje un tercer hilo por debajo de la arteria. Haga un nudo muy suelto entre los dos primeros puntos de sutura, que se utiliza para asegurar rápidamente el catéter después de la colocación (Figura 4G). </li><li> Mantenga todos los extremos de las suturas fuera del camino por mojar con un poco de etanol al 70%. </li></ol></li><li&gt; La inserción del catéter <ol><li> Con la sutura, agarra el nudo inferior para tirar de la arteria un poco tensa. Nick la arteria por encima, pero muy cerca, la sutura anterior (Figura 4H). Tenga cuidado de no cortar demasiado profundamente, pero revise la ranura para asegurarse de que la apertura esté obstruido. </li><li> Retire el catéter con heparina lleno de aguja de la jeringa, tratando de evitar la creación de grandes bolsas de aire en los extremos. Manipular el catéter hasta la posición de bisel a un ángulo cómodo, en general, a la baja, y ligeramente a la derecha (para los diestros). </li><li> Mientras se aferra a la sutura para mantener la arteria queda ligeramente tenso, inserte suavemente el catéter en hendidura (Figura 4E). Utilice las pinzas para sujetar la sutura anterior y tire de la arteria hacia abajo sobre catéter (empujando hacia arriba en exceso con el catéter puede hacer que el extremo biselado para punzar la arteria). Libere cuidadosamente el catéter y anterior de la sutura. </li></ol></li><li> Aseguramiento de catéter y el inicio del flujo sanguíneo (Las figuras 4J, 5B). <ol><li> Asegurar el catéter apretando el nudo de la sutura media, cerca de la entrada del catéter en la arteria. Hacer un apretado nudo triple, pero asegúrese de no tirar tan fuerte como para obstruir el flujo a través del catéter. Además asegurar el catéter mediante la vinculación de abajo con la sutura anterior, debajo de la entrada a la arteria. </li><li> Una el plomo solución salina al catéter por medio de la clavija del conector, de nuevo tratando de evitar la introducción de burbujas de aire en la línea. </li><li> Sujete los extremos de la sutura posterior y tire suavemente para liberar el nudo. Maniobra de la sutura por la arteria, sobre el extremo del catéter (no quite el hilo). La sangre debe fluir en el catéter; si no hay flujo de sangre, mover suavemente el catéter para intentar eliminar la constricción. </li><li> Cuando el flujo aparece sin obstrucciones, utilice el último hilo (de la sutura posterior) para atar un nudo adicional, ligeramente por encima de la sutura media. </li></ol></li><li> Temporary de sellado de catéter. Enjuague el catéter de la sangre, a continuación, utilizar una pinza hemostática para sujetar el extremo del catéter cerca de la clavija del conector. Retire el conector y sustituirlo por el tapón del puerto para sellar el extremo del catéter, y retire la pinza hemostática. </li><li> Reposicionamiento catéter para salir de la parte posterior del cuello. <ol><li> Con fórceps en cada mano, utilizar un par de fórceps para mantener al catéter justo debajo de la sutura anterior, y con la otra, pulse un retorcimiento en el catéter de manera que se dobla fácilmente hacia un lado. Repita el procedimiento para crear una segunda torcedura. Esto permite que el extremo libre del catéter que se tire hacia la parte posterior de la cabeza del ratón, sin forzar la punta del catéter para girar lateralmente contra la pared de la arteria. </li><li> Ponga el ratón sobre su lado (izquierda), manteniendo el cono de la nariz colocada sobre la boca y la nariz, y limpiar el área de la incisión con 70% de etanol y povidona yodada. Haga una pequeña incisión (aproximadamente 4 mm) por debajo y detrás de la oreja derecha. </li&gt; <li> El uso de fórceps para sujetar la solapa abierta de la piel, mientras se trabaja la sonda hueca romo debajo de la piel para crear un canal a través de la mejilla, a la cavidad en el cuello. Es recomendable llevar la sonda alrededor de la glándula salival, en vez de tratar de ir entre la glándula y la piel. El uso de fórceps para liberar cuidadosamente un espacio para la sonda para salir. </li><li> Pase puerto enchufe / catéter a través de la sonda para salir en el cuello. No tire demasiado duro; asegúrese de que el catéter no está aplastando o constricción de los vasos sanguíneos u órganos. </li></ol></li><li> El cierre y la recuperación. Administrar analgésico tópico (por ejemplo, bupivacaína) a la incisión del hombro, y cubrir la herida con a prueba de agua, cinta adhesiva quirúrgica. Aplicar un segundo trozo de cinta adhesiva para asegurar aún más el catéter. <ol><li> Administrar analgésico tópico para la incisión en el pecho, y cerca de la herida con seda o grapas. </li><li> Eliminar de ratón de la anestesia, y permitir que los animales se recupere en un lugar limpio, calentado espacio (lugar jaula en la parte superior de una almohadilla térmicao bajo una lámpara de calor), durante al menos 30 min. </li></ol></li></ol> 3. Infusión <ol><li> Preparar alícuotas de 5 mg / ml de solución de paclitaxel / metanol. <ol><li> Mida 50 mg de paclitaxel en un tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 10 ml de metanol estéril. Tubo Cap. Girar a mano o en un agitador rotatorio a temperatura ambiente hasta que se disuelva el polvo. </li><li> Alícuota de 500 l de solución en tubos seguras 20 pequeño, congelador, y almacenar a -20 ° C. </li><li> Alícuota individuo Descongelar a temperatura ambiente o en el baño a 37 ° C, inmediatamente antes de la infusión. </li></ol></li><li> Prepare la bomba de infusión (Figura 6). <ol><li> Corte un largo tramo de tubo de polietileno de aproximadamente 40 cm. Adjuntar una aguja roma en un extremo, y un puerto de conector a la otra. </li><li> Elaborar drogas en una jeringa con un diámetro interior conocido (la mayoría de las bombas programables requerirán el diámetro del cilindro de la jeringa, con el fin de calcular la velocidad de ºbrazo de la bomba e). Coloque la aguja de la jeringa y cargar el fármaco a través de la aguja y el tubo. </li><li> Situar la jeringa en la bomba de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Cebar la bomba de manera que el fármaco está fluyendo sin problemas a cabo el enchufe del conector, y está listo para perfusión. </li></ol></li><li> Conecte el ratón para bombear. <ol><li> Mantenga el ratón estable y utilizar la pinza para sujetar el catéter, cerca del tapón del puerto. Retire el tapón y reemplazar con el conector unido a la jeringa y el tubo. NOTA: La sangre puede comenzar a fluir de nuevo a través de la tubería. </li><li> Administrar rápidamente una bomba rápido como para borrar el volumen del catéter (calculado empíricamente mediante la observación de que el volumen de 6 cm de tubo), a continuación, cambiar inmediatamente a la velocidad de infusión deseada. </li></ol></li><li> Continúe la infusión de paclitaxel para el curso de tres horas. <ol><li> Monitorear la tubería de vez en cuando para comprobar que no haya fugas en las uniones, ya que es a menudo un signo de una obstrucción en el flujo para el ratón.Mira el ratón para las reacciones esperadas o inesperadas a la infusión (letargo o hiperactividad, síntomas de malestar). </li><li> Dependiendo de la duración y la naturaleza de la infusión, el ratón no puede comer o beber, pero asegúrese de proporcionar acceso a la alimentación y al agua de acuerdo con la política establecida de la institución. Sea consciente de la posibilidad de deshidratar el ratón a través de la recolección de grandes cantidades de sangre. </li><li> Siga manteniendo la jaula caliente con una almohadilla térmica o una lámpara, a menos que el ratón parece desear que se mantenga alejado del calor. Si los animales no se practicó la eutanasia dentro de varias horas después de la cirugía, aplicar el plan de tratamiento post-quirúrgico de los animales, incluyendo las condiciones de vivienda estériles y tratamiento para el dolor post-quirúrgico. </li><li> Mantenga una estrecha vigilancia sobre el ratón, sobre todo en los primeros minutos, para asegurarse de que no tire de la tubería a través de la hiperactividad, o irritación de la tubería (que puede ser un signo de una mala inserción). Si el ratón no está sobre-activa, monito constanteanillo puede no ser necesario, pero revise el ratón de forma rutinaria para asegurarse de que el animal no se enrede en el tubo. Arnés y sistema de sujeción están disponibles comercialmente, pero su uso está más allá del alcance de este protocolo. </li></ol></li><li> Recogida de muestras. <ol><li> Recoger muestras de sangre a intervalos regulares por hemorragias submandibular o retro-orbital (Si su protocolo no hace uso de modelos de tumores mamarios, considere la posibilidad de acumulación de sangre a través de un catéter yugular insertado al mismo tiempo que el catéter de la carótida). Tenga cuidado de no tirar de la línea de infusión. Si la recogida por hemorragias retro-orbital, ligeramente anestesiar el ratón con un anestésico por inhalación (por ejemplo, metoxiflurano) por lo que uno necesita no agarrar por el pescuezo para asegurar el ratón. </li><li> Girar la sangre en la centrifugadora hematocrito para separar las células sanguíneas del plasma. Use una lima de diamante o la punta del lápiz para anotar tubo en la cara de la separación de fases. Rompe tubo y recoger el plasma sólo, en el tubo pequeño, con congelador seguro. Almacene en -80 ° C hasta el análisis. NOTA: Si una centrífuga de hematocrito no está disponible, transferir la muestra de sangre en un tubo de microcentrífuga, y el giro en un micro-centrífuga a alta velocidad para separar las células sanguíneas del plasma. Recoger el plasma en un segundo tubo, y almacenar a -80 ° C. </li><li> La eutanasia ratón por asfixia de CO 2. Recoger tejido (alrededor de 20 - 50 mg) a partir de órganos de interés y la congelación de flash en nitrógeno líquido. Almacenar a -80 ° C hasta su análisis. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de la muestra NOTA: Todas las muestras de este protocolo se analizaron a través de un laboratorio externo por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC - MS / MS), que calcula las concentraciones de paclitaxel de la siguiente manera: <ol><li> Extracto de paclitaxel a partir de muestras. Homogeneizar muestra de tejido en ácido acético al 0,1%, metanol al 50% antes de la extracción. Extracto de paclitaxel por extracción líquido / líquido, usando éter metil-terc-butilo (MTBE) fortificada con un estándar analógico interno (docetaxel). Retire MTBE y muestras secas. Resuspender en 50% de acetonitrilo, solución de ácido acético al 0,1%. </li><li> Preparar los estándares de calibración. Añadir una concentración conocida de paclitaxel para apropiarse de C57BL / 6 para obtener una matriz de rango final de los estándares (de 1 a 20.000 ng / ml para muestras de plasma, de 0,1 a 5000 ng / ml para muestras de tejido). Extraer estándares por duplicado, utilizando el mismo método que para las muestras de estudio anteriores. Mida pico de paclitaxel en las muestras por HPLC / MS / MS utilizando ionización por electrospray. </li><li> Calcular la concentración usando la relación de área de paclitaxel a patrón interno. Utilice estándares de calibración para crear una curva estándar, y muestras de estudio interpolados por ajuste de la curva. Normalizar la concentración de muestras de estudio por el peso inicial de la muestra antes de la homogeneización. </li></ol>

<ol>
	<li>Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+P-Glycoprotein+on+Paclitaxel+Brain+and+Brain+Tumor+Distribution+in+Mice.">The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice.</a> Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).</li><li>Sonnichen, D. S., Relling, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Pharmacokinetics+of+Paclitaxel.">Clinical Pharmacokinetics of Paclitaxel.</a> Clinical Pharmacokinetics. 27 (4), 256-269 (1994).</li><li>Gianni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+Pharmacokinetics+and+Metabolism+of+Paclitaxel+and+Its+Pharmacokinetic+/+Pharmacodynamic+Relationship+in+Humans.">Nonlinear Pharmacokinetics and Metabolism of Paclitaxel and Its Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Relationship in Humans.</a> Journal Clinical Oncology. 13 (1), 180-190 (1995).</li><li>Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+Pharmacokinetics+of+Paclitaxel+in+Mice+Results+from+the+Pharmaceutical+Vehicle+Cremophor+EL.">Nonlinear Pharmacokinetics of Paclitaxel in Mice Results from the Pharmaceutical Vehicle Cremophor EL.</a> Cancer Research. 56 (9), 2112-2115 (1996).</li><li>Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+paclitaxel+and+metabolites+in+mouse+plasma,+tissues,+urine+and+faeces+by+semi-automated+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography.">Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).</li><li>Bradshaw-Peirce, E. L., Eckhardt, S. G., Gustafson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Physiologically+Based+Pharmacokinetic+Model+of+Docetaxel+Disposition:+from+Mouse+to+Man.">A Physiologically Based Pharmacokinetic Model of Docetaxel Disposition: from Mouse to Man.</a> Clinical Cancer Research. 13, 2768-2778 (2007).</li><li>Eiseman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Pharmacokinetics+and+Tissue+Distribution+of+Paclitaxel+in+CD2F1+Mice.">Plasma Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Paclitaxel in CD2F1 Mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 34 (6), 465-471 (1994).</li><li>Schinkel, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Viability+and+Altered+Pharmacokinetics+in+Mice+Lacking+mdr1-type+(drug-transporting)+P-glycoproteins.">Normal Viability and Altered Pharmacokinetics in Mice Lacking mdr1-type (drug-transporting) P-glycoproteins.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 4028-4033 (1997).</li><li>Fraser, I. J., Dear, G. J., Plumb, R., L&#8217;Affineur, M., Fraser, D., Skippen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Capillary+High+Performance+Liquid+Chromatography+with+Electrospray+Mass+Spectrometry+for+the+Analysis+of+Small+Volume+Blood+Samples+from+Serially+Bled+Mice+to+Determine+the+Pharmacokinetics+of+Early+Discovery+Compounds.">The Use of Capillary High Performance Liquid Chromatography with Electrospray Mass Spectrometry for the Analysis of Small Volume Blood Samples from Serially Bled Mice to Determine the Pharmacokinetics of Early Discovery Compounds.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 13 (23), 2366-2375 (1999).</li><li>Bateman, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Animal+Usage+by+Serial+Bleeding+of+Mice+for+Pharmacokinetic+Studies:+Application+of+Robotic+Sample+Preparation+and+Fast+Liquid+Chromatography+&#8211;+Mass+Spectrometry.">Reduction of Animal Usage by Serial Bleeding of Mice for Pharmacokinetic Studies: Application of Robotic Sample Preparation and Fast Liquid Chromatography &#8211; Mass Spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 754 (1), 245-251 (2001).</li><li>Berndt, K., Vogel, J., Buehler, C., Vogt, P., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+repeated+drug+infusion+into+the+femoral+artery+of+mice.">A new method for repeated drug infusion into the femoral artery of mice.</a> J. Am. Assoc. Lab Animal Sci. 51 (6), 825-831 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squibb+&amp;+Sons,+L.L.C..">Squibb &amp; Sons, L.L.C..</a> Drug Information for TAXOL (Paclitaxel) Injection. , (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abraxis+BioScience+L.L.C.">Abraxis BioScience L.L.C.</a> Full Prescribing Information ABRAXANE for Injectable suspension (paclitaxel protein-bound particles for injectable suspension) (albumin-bound). , (2013).</li><li>Fergusson, G., Ethier, M., Zarrouki, B., Font&#233;s, G., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+of+Chronic+Nutrient+Infusion+in+the+Rat.">A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat.</a> J. Vis. Exp. (78), (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Infusión de la arteria carótida es una técnica importante en este estudio de farmacocinética de paclitaxel. Infusión de la arteria carótida es un método para distribuir rápidamente drogas en todo el sistema circulatorio 14. El 3 hr de infusión es un imitador más cerca de la administración clínica de los medicamentos tales como taxanos que las inyecciones en bolo. La cirugía se puede realizar de forma fiable por una sola persona, el tiempo de cirugía es relativamente corto, y las tasas de éxito ...

Infusión de medicamentos a través de la carótida se puede realizar de forma fiable y reproducible por el equipo y la técnica la optimización. El procedimiento no es complicado, aunque sí requiere un control preciso y la atención al detalle. Superior cuidado y destreza se necesitan para aislar la arteria carótida e insertar el catéter, lo que generalmente se puede adquirir a través de la práctica. Cirugía por un técnico con experiencia no debe ser superior a una hora. Después de la cirugía con éxito, el ratón debe aparecer normal y saludable (aunque el ratón puede reaccionar a la infusión de fármaco real), y el fármaco (s) pueden administrarse en una forma controlada, la dosificación continua y uniforme. Las muestras de sangre deben tomarse de un punto que no sea el de la arteria carótida; hemorragias retro-orbital resultaron fáciles de recoger y satisfactoria para el análisis de las concentraciones de fármaco. Los catéteres de tamaño y la forma óptima son un activo muy valioso en la realización de una infusión de éxito 11. Encontramos el catéteres commerciall disponibleY a menudo es demasiado grande y / o demasiado flexible como para permitir un cómodo acceso a la arteria carótida del ratón. Demostró preferible catéteres de moda de la tubería de polietileno se utiliza para conectar el ratón a la jeringa de infusión. Así, todos los tubos, conectores y agujas eran de dimensiones coherentes, que simplificó conjunto de infusión. Usando esta técnica, no es necesario empujar la punta del catéter en la arteria más allá del punto donde aún es visible, y el flujo sanguíneo a la arteria carótida no se restaura hasta después de que el catéter se fija inicialmente. Esto reduce los riesgos de punción de la arteria o de tener el catéter expulsados ​​por la alta presión del flujo de sangre. El diseño del catéter en el presente documento no incorpora un &quot;golpe&quot; para mantenerla en su lugar, de modo asegurando el catéter bien con suturas y cinta quirúrgica es una prioridad. Las infusiones pueden ser preferibles a las inyecciones en bolo iv comunes, como una mejor imitador de administración clínica defármacos tales como taxanos 3, 12, 13. La técnica descrita aquí fue desarrollado originalmente para permitir la infusión en modelos de ratón en el que el acceso a la vena yugular o femoral fue excluida por el crecimiento del tumor mamario y / o vascularización excesiva de la zona de inserción. Este método a menudo puede ser apropiado incluso en ratones libres de tumor: aunque el aislamiento y la cateterización de la arteria carótida es un poco más invasiva, nos pareció preferible a la yugular, porque la propensión de la pared yugular a rip resultó en inserciones y fracasos para completar más fallidos el curso de tiempo de 3 h. Mientras que los resultados que se muestran aquí son de C57BL / 6J (in-house de raza) los ratones, hemos utilizado esta técnica para infundir éxito paclitaxel en varias cepas de ratones, incluyendo FVB y mixtos-cepas, para seguir la farmacocinética en modelos de ratones manipulados transgénicamente para regular a la baja las funciones transportadoras celulares. Las muestras de sangre y tejidos recogidos mostraron niveles esperados de paclitaxel, en el rango de los niveles observados después de las infusiones yugulares 1. Esta técnica se puede esperar que funcione igualmente bien en otros modelos de ratón y con otras soluciones para infusión.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="846">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:293px;">Table of specific reagents and equipment:</td>
			<td style="width:185px;">Source:</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:259px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Polyethylene tubing 0.024&#8221;OD X 0.011&#8221;ID&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">PE10</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Stainless steel port plug (30 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">NB-30</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">2 Stainless steel connector plugs (28 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">PP-28</td>
			<td style="width:259px;">Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">3 Blunted needles (30 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">C-30</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">3 1cc syringes</td>
			<td style="width:185px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:111px;">309659</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Sterile 0.9% Saline solution</td>
			<td style="width:185px;">Hospira</td>
			<td style="width:111px;">0409-7984-37</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">HGS</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Silk suture</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">SUT-S&#160;113</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Vanna Scissors (micro-scissors)</td>
			<td style="width:185px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">14122</td>
			<td style="width:259px;">This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Hartman Mesquito Hemostatic Forceps</td>
			<td style="width:185px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">501705</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Betadine Swabsticks</td>
			<td style="width:185px;">Perdue Products L.P.</td>
			<td style="width:111px;">BSWS1S</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:185px;">Hospira</td>
			<td style="width:111px;">0409-1160-01</td>
			<td style="width:259px;">May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:185px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">P-9600</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Methanol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">32213</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">22-362-566</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">&#160;Capillary Tube Sealant&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-678</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:185px;">Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">API 4000 Q-Trap mass spetrometer</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice

Al proponer el uso de un fármaco, combinación de fármacos, o la administración de fármacos en un sistema novedoso, se debe evaluar la farmacocinética del fármaco en el modelo de estudio. Como el uso de modelos de ratón son a menudo un paso vital en el descubrimiento de fármacos y desarrollo de fármacos preclínica 1-8, es necesario diseñar un sistema para introducir fármacos en ratones en una manera uniforme, reproducible. Idealmente, el sistema debería permitir la recogida de muestras de sangre a intervalos regulares durante un curso de tiempo establecido. La capacidad de medir las concentraciones de fármaco por espectrometría de masas, ha permitido a los investigadores a seguir los cambios en los niveles de fármaco en plasma con el tiempo en ratones individuales 1, 9, 10. En este estudio, el paclitaxel se introdujo en ratones transgénicos como una infusión continua a lo largo de tres arterial hora, mientras que las muestras de sangre fueron tomadas simultáneamente por sangrados retro-orbital en los puntos de tiempo establecidos. Infusiones arteria carótida son una alternativa potencial para infusiones vena yugular, cuando factores tales comotumores mamarios u otros obstáculos hacen infusiones yugulares poco práctico. Usando esta técnica, las concentraciones de paclitaxel en el plasma y el tejido lograron niveles similares en comparación con la infusión yugular. En este tutorial, vamos a demostrar cómo cateterizar con éxito la arteria carótida mediante la preparación de un catéter optimizado para el modelo individual del ratón, a continuación, mostrar cómo insertar y asegurar el catéter en la arteria carótida del ratón, pase el extremo del catéter a través de la parte posterior del cuello del ratón, y conectar el ratón a una bomba para suministrar una velocidad controlada de afluencia de drogas. Múltiples bajo volumen hemorragias retro-orbital permiten el análisis de las concentraciones plasmáticas del fármaco a través del tiempo.

<html> Paclitaxel distribución sigue patrones predecibles durante un régimen de dosificación 3 h de una infusión de 15 min de alta velocidad, seguido de una infusión de 165 min a baja velocidad. La Figura 1 muestra una comparación de la vena de la infusión de paclitaxel concentraciones de plasma yugular y la arteria carótida-infusiones. Las concentraciones de paclitaxel caen rápidamente en los primeros 15 minutos después de una infusión inicial de alto volumen, y l...

Watch this Scientific Journal Video about Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice at JoVE.com

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Este método fue desarrollado con el objetivo de ofrecer una solución de fármaco constante a través de la arteria carótida, para evaluar la farmacocinética de nuevos fármacos en modelos de ratón.

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

carotid-artery-infusions-for-pharmacokinetic-pharmacodynamic-analysis

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Medicine

Unit 1

Pharmacokinetic Models

SCIENTISTS IN ACTION

22.7K vistas.  Fox Chase Cancer Center.  Este método fue desarrollado con el objetivo de ofrecer una solución de fármaco constante a través de la arteria carótida, para evaluar la farmacocinética de nuevos fármacos en modelos de ratón. 

Video: Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

Un modelo de Disturbed inducida por el flujo de Aterosclerosis en la arteria carótida del ratón por la ligadura parcial y un método sencillo para el aislamiento de ARN del endotelio carótida

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Investigación

Medicina

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Técnica modificada para la ligadura de la arteria coronaria en ratones

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce atherosclerosis (reviewed in 1 and 2). The role of shear stress has been extensively studied in vitro investigating the influence of flow dynamics on cultured endothelial cells 1,3,4 and in vivo in larger animals and humans 1,5,6,7,8. However, highly reproducible small animal models allowing systematic investigation of the influence of shear stress on plaque development are rare. Recently, Nam et al. 9 introduced a mouse model in which the ligation of branches of the carotid artery creates a region of low and oscillatory flow. Although this model causes endothelial dysfunction and rapid formation of atherosclerotic lesions in hyperlipidemic mice, it cannot be excluded that the observed inflammatory response is, at least in part, a consequence of endothelial and/or vessel damage due to ligation.
In order to avoid such limitations, a shear stress modifying cuff has been developed based upon calculated fluid dynamics, whose cone shaped inner lumen was selected to create defined regions of low, high and oscillatory shear stress within the common carotid artery 10. By applying this model in Apolipoprotein E (ApoE) knockout mice fed a high cholesterol western type diet, vascular lesions develop upstream and downstream from the cuff. Their phenotype is correlated with the regional flow dynamics 11 as confirmed by in vivo Magnetic Resonance Imaging (MRI) 12: Low and laminar shear stress upstream of the cuff causes the formation of extensive plaques of a more vulnerable phenotype, whereas oscillatory shear stress downstream of the cuff induces stable atherosclerotic lesions 11. In those regions of high shear stress and high laminar flow within the cuff, typically no atherosclerotic plaques are observed.
 
In conclusion, the shear stress-modifying cuff procedure is a reliable surgical approach to produce phenotypically different atherosclerotic lesions in ApoE-deficient mice.

The constricting cuff presented in this article is designed to induce atherosclerosis in the murine common carotid artery. Due to the conical shape of its inner lumen the implanted cuff generates well-defined regions of low, high and oscillatory shear stress triggering the development of atherosclerotic lesions of different inflammatory phenotypes.

Implantación de un manguito de la carótida para provocar esfuerzo cortante aterosclerosis inducida en ratones

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Un modelo murino de la implantación de un stent en la arteria carótida para el Estudio de la reestenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Adultos Mouse hipertensión venosa: Modelo: arteria carótida común a la vena yugular externa anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Carrera Modelado en ratones: Coagulación permanente de la arteria cerebral media Distal

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

La cateterización de la arteria carótida y la vena yugular para realizar mediciones hemodinámicas, Infusiones y muestras de sangre en un modelo de rata Consciente

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and cellular mechanisms involved in vascular smooth muscle dedifferentiation, neointima formation and vascular remodeling. Male Sprague-Dawley rats are the most frequently employed animals for this model. Female rats are not preferred as female hormones are protective against vascular diseases and thus introduce a variation into this procedure. The left carotid is typically injured with the right carotid serving as a negative control. Left carotid injury is caused by the inflated balloon that denudes the endothelium and distends the vessel wall. Following injury, potential therapeutic strategies such as the use of pharmacological compounds and either gene or shRNA transfer can be evaluated. Typically for gene or shRNA transfer, the injured section of the vessel lumen is locally transduced for 30 min with viral particles encoding either a protein or shRNA for delivery and expression in the injured vessel wall. Neointimal thickening representing proliferative vascular smooth muscle cells usually peaks at 2 weeks after injury. Vessels are mostly harvested at this time point for cellular and molecular analysis of cell signaling pathways as well as gene and protein expression. Vessels can also be harvested at earlier time points to determine the onset of expression and/or activation of a specific protein or pathway, depending on the experimental aims intended. Vessels can be characterized and evaluated using histological staining, immunohistochemistry, protein/mRNA assays, and activity assays. The intact right carotid artery from the same animal is an ideal internal control. Injury-induced changes in molecular and cellular parameters can be evaluated by comparing the injured artery to the internal right control artery. Likewise, therapeutic modalities can be evaluated by comparing the injured and treated artery to the control injured only artery.

This protocol uses a balloon catheter to cause an intraluminal injury on the rat carotid artery and henceforth elicit neointimal hyperplasia. This is a well-established model for studying the mechanisms of vascular remodeling in response to injury. It is also widely used to determine the validity of potential therapeutic approaches.

Lesión Vascular Globo y Administración intraluminal en rata arteria carótida

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Trombosis modelo de ratón de la arteria carótida y Mesenterio Embarcaciones inducida por cloruro férrico-

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...