Entonces, ¿por qué es importante este protocolo? Bueno, las metástasis cerebrales son muy difíciles de tratar y este protocolo produce un modelo de ratón clínicamente relevante con tumores extracraneales mínimos. Esta técnica permite un análisis objetivo de la distribución del fármaco y la respuesta de los tumores intracraneales.
La principal ventaja de esta técnica es que el modelo es altamente reproducible y las metástasis cerebrales se desarrollan en un tiempo relativamente corto después de la inyección. La progresión de la enfermedad es similar entre los animales, lo que facilita a los investigadores estandarizar los experimentos, los plazos de tratamiento y los puntos finales. Mi consejo para los principiantes es practicar el uso de la pinza y la jeringa mientras miran a través del microscopio de disección, familiarizarse con los puntos de referencia anatómicos alrededor del cuello y practicar el protocolo en presencia de un veterinario.
Comience sembrando células cancerosas BT-474 a una densidad de siembra de dos veces 10 a las seis células en un matraz T-75 utilizando 10 mililitros de medios de crecimiento completos y cultivo hasta que las células alcancen una confluencia de 70 a 80% antes de la inyección. El día de la inyección, deseche los medios de crecimiento y lave la monocapa celular con PBS dos veces y agregue cinco mililitros de reactivo de disociación de cultivo celular precalentado. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos o hasta que las células se hayan desprendido.
Después de cinco minutos, retire el matraz de la incubadora y golpee suavemente para ayudar a la separación de células. Agregue cinco mililitros de medios de crecimiento completos que contengan 10% de FBS para apagar la actividad del reactivo de disociación. Resuspenda suavemente las células en la solución pipeteando para reducir los grupos celulares.
Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros y centrifugar a 180 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 10 mililitros de HBSSS sin calcio y magnesio para minimizar la aglutinación celular. Centrifugar la suspensión celular a 180 G durante tres minutos a temperatura ambiente Decantar el sobrenadante para eliminar el suero residual o el reactivo de disociación y resuspender el pellet celular en tres mililitros de HBSS.
Coloque un colador de células de 100 micrómetros en un tubo cónico fresco de 50 mililitros y pase la suspensión celular para eliminar los grupos de células. Calcule el número de células viables usando azul de tripano y diluya la suspensión celular con HBSS a una concentración celular de 2.5 veces 10 a seis células por mililitro. Mantenga el tubo horizontal sobre hielo y balancee suavemente el tubo periódicamente para minimizar la formación de grumos.
La suspensión celular se puede almacenar en hielo durante un máximo de seis horas. Ratón perforador de orejas para identificar y usar cortapelos eléctricos para afeitar el pelaje de la región del cuello. Limpie el exceso de vello de la piel expuesta con cinta adhesiva.
Aplique lubricante ocular en los ojos para evitar que se sequen. Asegure el ratón suavemente enganchando los dientes incisivos superiores con hilo pegado a la placa quirúrgica, seguido de cinta adhesiva en las patas delanteras y traseras. Este paso extiende el cuerpo y mantiene el cuello recto durante el procedimiento.
Para la preparación preoperatoria de la piel, limpie el cuello con un antiséptico tópico como povidona yodada para reducir la carga de microflora de la piel y eliminar el vello suelto. Limpie desde el centro de la piel, trabajando hacia afuera para evitar la recontaminación del sitio de la incisión. Repita el proceso utilizando etanol al 70% y realice tres rondas alternas de yodo y etanol para la desinfección.
Verifique el reflejo a través de la prueba de pellizco para asegurar la muerte de la anestesia antes de continuar el procedimiento. Coloque una cortina quirúrgica estéril sobre el animal. Bajo el microscopio de disección, haga una incisión vertical de 15 milímetros a lo largo de la línea media en la región del cuello del ratón con tijeras, comenzando desde cinco milímetros por debajo de la mandíbula hasta la entrada torácica.
Usando dos pares de pinzas en ángulo, separe la piel y las glándulas salivales subyacentes y aplique retractores para mantener la tráquea expuesta. Usando dos pares de pinzas en ángulo fino, disecciona sin rodeos el músculo y el tejido graso adyacente a la tráquea para exponer la vaina carotídea derecha. La vaina carotídea es la capa fibrosa que cubre la arteria carótida común, la vena y el nervio vago, y este haz puede ser visualizado por la arteria carótida común de color rojo brillante.
Despejar un segmento de la arteria carótida común caudal a la bifurcación carotídea de la fascia circundante y separarla del nervio vago y las venas. Aísle y elimine la bifurcación carotídea de los nervios y la fascia circundantes. Coloque fórceps finos debajo de la arteria carótida externa y pase una sutura de seda 5-0 debajo de la arteria.
Anude y apriete la sutura y corte el exceso de línea. Coloque fórceps finos debajo de la arteria carótida común y pase una sutura de seda 5-0 debajo de la arteria. Ate un nudo y apriete la sutura en una posición proximal al sitio de inyección propuesto.
Cortar el exceso de sutura, dejando unos 10 milímetros de la línea. Corte y humedezca una tira de limpiaparabrisas desechables de pelusa baja de unos 10 por 5 milímetros. Doble la tira y colóquela debajo de la arteria carótida en el sitio de inyección propuesto.
Esto apoyará el vaso durante la inyección. En la arteria carótida común rostral al sitio de inyección propuesto, coloque una tercera ligadura con un nudo suelto. Esto se aprieta solo después de la inyección.
Agite suavemente la suspensión celular y extraiga 200 microlitros de suspensión celular en una jeringa de insulina con una aguja de calibre 31. Cargue la jeringa en el controlador de la jeringa conectado a un pedal de activación. Coloque una cánula fina con una aguja de calibre 31 en la jeringa y prepare la línea.
Compruebe si la arteria carótida está bien posicionada y presurizada. Usando dos pinzas de ángulo fino, una tensando suavemente el extremo de la primera ligadura y la otra sosteniendo la aguja de calibre 31, inserte lentamente la aguja con el bisel hacia arriba en la luz del vaso sanguíneo, teniendo cuidado de no perforarla. Inyecte lentamente 100 microlitros de suspensión celular preparada anteriormente en la arteria carótida común a 10 microlitros por segundo.
Esto entregará 2.5 veces 10 a la quinta célula en el vaso sanguíneo. La inyección exitosa se puede visualizar a través de la limpieza de sangre del vaso sanguíneo carotídeo. Levante y apriete suavemente la ligadura suelta inmediatamente después de retirar la aguja para evitar el reflujo y el sangrado.
Recorte el exceso de suturas y retire la pieza de limpiaparabrisas desechables humedecidos de baja pelusa. Con una pipeta P-200, enjuague la cavidad quirúrgica dos veces con 150 a 200 microlitros de agua estéril o solución salina. Después de verificar si hay hemorragias, vuelva a colocar el tejido blando, las glándulas salivales y la piel sobre la arteria carótida y la tráquea.
Cierre la capa de piel de la incisión con un soporte de aguja de sutura, fórceps y una sutura de monofilamento 6-0 absorbible o no absorbible en un patrón continuo. Inyecte 50 microgramos por kilogramo de buprenorfina y un miligramo por kilogramo de meloxicam mediante inyección subcutánea como alivio del dolor postquirúrgico. Mueva al animal a una jaula cálida y limpia para recuperarse de la anestesia.
La lectina se inyectó en la arteria carótida común de los ratones con o sin ligadura de la arteria carótida externa. Se observó una reducción en la lectina en los tejidos de las mejillas cuando se ligaba la arteria carótida externa. Los resultados mostraron que la ligadura no afectó la entrega cerebral.
La progresión tumoral se monitorizó utilizando la línea celular de cáncer de mama amplificada por HER2 que expresa luciferasa. El modelo de metástasis cerebral BT474 mostró un aumento en las señales bioluminiscentes a partir de la semana cinco después de la inyección carotídea interna y creció progresivamente a partir de entonces. De las semanas cinco a ocho, la intensidad heterogénea de la señal indicó un tumor intracraneal con perfusión de líquido complejo.
La concentración de gadolinio dentro de la región del tumor aumentó a medida que se filtraba de la circulación sanguínea al tejido tumoral. La acumulación de nanomedicina y metástasis cerebrales se confirmó en los ratones BT-474 mediante niveles más altos de nanomedicina detectados en la región tumoral en comparación con las regiones cerebrales no afectadas. A medida que avanzaba el modelo de metástasis cerebral BT-474, los animales comenzaron a perder hasta un 20% de peso corporal, lo que hace que el tiempo medio de supervivencia sea de nueve semanas después de la inyección.
Los resultados histológicos mostraron que los tumores se localizaron unilateralmente, coincidiendo con el sitio de inyección carotídea donde los tumores aparecieron principalmente como masas sólidas y solitarias. Con frecuencia se observaron bolsas de espacios vacíos y consistían en células necróticas, mientras que las excrecencias más pequeñas también estaban presentes en algunos animales. Lo más importante que debe recordar al intentar el protocolo es preparar y colocar la arteria carótida correctamente antes de insertar la aguja, y luego aplicar la tensión adecuada durante la inserción de la aguja.
Este modelo es útil para los investigadores que exploran la administración de fármacos al cerebro y la eficacia de la nueva terapéutica para el tratamiento de la metástasis cerebral.
