We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.

Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la investigación de la KU Leuven y eran estrictamente de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo de 22 de septiembre 2010 (2010/63 / UE) y con la legislación belga (KB de 29 de mayo de 2013). Se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales. 1. Animal Tratamiento y Anestésicos <ol><li> Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (75 mg / ml) e hidrocloruro de medetomidina (1 mg / kg) en solución salina. </li><li> Compruebe los reflejos apretando los dedos de los pies con una pinza para asegurar el ratón está completamente sedado. </li><li> Aplicar etanol al 70% para la desinfección de los párpados y la región que rodea el ojo con una punta de algodón. Compruebe el reflejo palpebral para evaluar adicionalmente el grado de sedación. </li></ol> 2. Eliminar el Ojo <ol><li> Asegúrese de que el animal reside en un plano, seco ysuperficie lisa. </li><li> Esterilizar un fórceps con una punta dentada (tamaño de la punta preferido: 0,5 x 0,4 mm) curvada. </li><li> Presione suavemente sobre el canto (en la esquina del ojo) con las pinzas hasta que el globo ocular es desplazado de la toma y el nervio óptico es alcanzable. </li><li> Guía de las pinzas detrás del ojo. Mantenga pulsado el nervio óptico firmemente, preferiblemente con el comienzo de la curva y no la punta de la pinza. Esto ayudará a levantar el globo de la toma y para sujetar el nervio óptico completo. </li><li> Haga movimientos circulares con la mano que sostiene la pinza en la dirección con la menor resistencia mientras que el ratón permanece en la superficie plana. El ratón se moverá a lo largo de la superficie de acuerdo a la dirección del movimiento de la mano. </li><li> Lleve a cabo esta acción con el aumento de la velocidad gradualmente hasta que el nervio óptico está restringido en dos (por lo general entre 7 a 15 movimientos circulares, aproximadamente de media a una vuelta completa por segundo). Por lo tanto, el globo ocular es independienteeliminado. </li></ol> Cuidado 3. postoperatoria <ol><li> En caso de sangrado (poco frecuente), llenar la órbita con un coagulado viscoso y agente hemostático. </li><li> Invertir la anestesia mediante la inyección de 1 mg / kg de clorhidrato de atipamezol en solución salina por vía intraperitoneal. </li><li> Administrar 1 mg / kg de meloxicam por vía intraperitoneal cada 24 horas para aliviar el dolor. </li><li> Aplicar pomada ocular al ojo restante para prevenir la deshidratación de la córnea. </li><li> Deje que el animal se recupere en una placa calefactora o envuelva el animal en material aislante en una jaula separada para controlar la temperatura corporal. </li><li> Medir el peso del ratón cada día durante al menos 2 días. La pérdida de peso puede indicar sufrimiento y en este caso, continuar con el tratamiento Meloxicam hasta que el animal está totalmente recuperado. </li></ol>

<ol>
	<li>Toldi, J., Feh&#233;r, O., Wolff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+induced+by+neonatal+monocular+(and+binocular)+enucleation.">Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation.</a> Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).</li><li>Steeves, J. K. E., Gonz&#225;lez, E. G., Steinbach, M. 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O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+ocular+dominance+plasticity+and+NMDA+receptor+subunit+expression+in+glutamic+acid+decarboxylase-65+knock-out+mice.">Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice.</a> The Journal of Physiology. 587 (12), 2857-2867 (2009).</li><li>Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+functional+subdivisions+in+the+visual+cortex+of+the+adult+mouse.">Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 514 (1), 107-116 (2009).</li><li>Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+expression+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+tyrosine+kinase+B+mRNAs+and+distribution+and+ultrastructural+localization+of+their+proteins+in+the+visual+pathway+of+the+adult+rat.">Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat.</a> Neuroscience. 140 (3), 913-928 (2006).</li><li>Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. 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L., Klistorner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+degeneration+along+the+visual+pathway+after+optic+nerve+injury.">Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury.</a> PLoS ONE. 7 (12), e52061 (2012).</li><li>Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+anterior+visual+system+development+following+early+monocular+enucleation.">Altered anterior visual system development following early monocular enucleation.</a> NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).</li><li>Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+visual+cortex+of+neonatal+monocular+enucleated+rat:+a+proton+magnetic+resonance+spectroscopy+study.">Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 29 (1), 25-30 (2011).</li><li>Dyer, R. S., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+enucleation+in+retinal+degenerate+mice.">Effects of enucleation in retinal degenerate mice.</a> Physiology &amp; behavior. 14 (2), 207-210 (1975).</li><li>Smith, S. A., Bedi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+eye+enucleation+in+adult+rats+causes+neuronal+loss+in+the+contralateral+superior+colliculus.">Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus.</a> Journal of Anatomy. 190 (4), 481-490 (1997).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+monocular+enucleation+on+calbindin-D+28k+and+c-Fos+expression+in+the+lateral+geniculate+nucleus+in+rats.">Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats.</a> Okajimas folia anatomica Japonica. 82 (1), 9-18 (2005).</li><li>Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipsilateral+eye+cortical+maps+are+uniquely+sensitive+to+binocular+plasticity.">Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity.</a> Journal of Neurophysiology. 101 (2), 855-861 (2008).</li><li>Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+protein+and+neuronal+activity+markers+define+regional+architectonic+parcellation+in+the+mouse+visual+cortex.">Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 17 (12), 2805-2819 (2007).</li><li>Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+in+primate+visual+cortex+assessed+by+immunostaining+for+the+transcription+factor+Zif268.">Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268.</a> Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Para realizar una enucleación exitosa de acuerdo con nuestro método, los pasos más importantes a considerar son: 1) el uso de unas pinzas con una punta curvada y dentada del tamaño adecuado; 2) la realización de la enucleación en una superficie suave y seco; y 3) acelerar gradualmente los movimientos circulares en la dirección con la menor fricción. Para un resultado eficaz, es esencial utilizar un fórceps adecuados caracterizados por una punta curvada y dentada (tamaño de la punta preferido: ratón: 0,5 x 0,4 mm; rata: 2,15 x 1,3 mm). La curvatura permite un fácil acceso al nervio óptico después del desplazamiento globo ocular y es necesario para la colocación correcta de la mano al realizar los movimientos circulares. Puntas suaves no son recomendables ya que carecen de la necesaria agarre al sostener el nervio óptico. El fracaso para mantener el nervio óptico correctamente durante los movimientos circulares resulta en la ruptura de la arteria oftálmica, pobres desprendimiento del ojo y por lo tanto mala reproducibilidad.Por lo tanto se recomienda primera práctica esta técnica en animales sacrificados para la optimización de las pinzas de manipulación con el fin de garantizar el bienestar animal máxima una vez que la aplicación del método in vivo. El éxito de la enucleación del ojo también ha sido recientemente realizado en la rata en nuestro laboratorio utilizando la misma técnica, excepto para girar manualmente el cuerpo del animal y mantener estacionario el fórceps. Una limitación de la técnica es que posiblemente podría dañar la retina. Por lo tanto este método es menos adecuado para recoger retinas para llevar a cabo la histología 5. Por otra parte, nuestro método se limita a publicar la apertura del ojo edades ya que el globo ocular debe ser desplazado de la toma sin quitar o cortar los párpados. Enucleación del ojo en diferentes especies, incluyendo roedores, se realiza de forma rutinaria utilizando métodos alternativos, que a menudo conllevan la eliminación de los párpados y el corte del nervio óptico 18,23-25. Estos methods tienden a ser más invasivos y tienen una curva de aprendizaje más alta que la técnica descrita aquí. Sin la necesidad de retirar o sutura de los párpados, el tiempo de recuperación después de la cirugía se reduce al mínimo, lo que resulta en un mayor bienestar de los animales y resultados más reproducibles.

Extracción de un ojo y con ello destruyendo irreversiblemente la superficie del receptor sensorial (retina), impone una considerable pérdida de información sensorial a lo largo de la vía visual. El modelo de la enucleación en el sistema visual juveniles y adultos ha demostrado ser valiosa para comprender el desarrollo, la plasticidad y la función de diferentes centros visuales 1-4. Las consecuencias moleculares, celulares y fisiológicos de esta privación sensorial pueden ayudar a comprender cómo se regula el desarrollo normal y Cómo se forman circuitos corticales hacer frente y cambian su estructura y función en respuesta a un amplio cambio de esta naturaleza en la experiencia. Existen diferentes métodos de privación visual y todos ellos tienen sus ventajas específicas en la investigación relacionada con la visión. Por ejemplo la cría oscuro específicamente elimina la actividad impulsada visualmente, sin embargo, no afecta a la actividad retinal espontáneo. Visua Del mismo modo, las suturas tapa o parches de los ojos Quitar modeladosl entrada sin perturbar la actividad espontánea, sino que permiten la penetración de luz dispersa a través de los ojos cerrados. Estos métodos son reversibles y se ha demostrado ser valiosa en la comprensión del papel de la visión y de bajo nivel modelado correlación de entradas binoculares en esculpir circuitos corticales durante el desarrollo 6-8. En la investigación glaucoma, el modelo de aplastamiento del nervio óptico en los animales adultos se ha utilizado ampliamente debido a que establece una pérdida progresiva de entradas de células ganglionares de la retina que constituyen el nervio óptico 9,10. Por otro lado, la enucleación, donde el ojo y por lo tanto la retina se elimina completamente y al instante, es la elección apropiada de la privación cuando el objetivo es eliminar de manera irreversible la visión tanto espontánea como patrón a la vez. También induce una robusta actividad intraocular desequilibrio que puede mejorar la relación señal a ruido en estudios de mapeo de la actividad 11,12. La comparación de los cambios funcionales y estructurales en respuesta a la enucleación con la famiose después de la privación por métodos menos drásticos tales como sutura tapa por ejemplo, también podría exponer nuevas ideas sobre el papel de la actividad espontánea de la retina en ambos tipos homeostáticos y de la plasticidad sináptica. La enucleación desencadena una pérdida de influencias tróficas en objetivos directos de la retina. Por ejemplo, los niveles de BDNF están regulados a la baja de manera significativa en el núcleo lateral geniculado (LGN) y colículo superior de ratas adultas enucleados 13. Especies reactivas de oxígeno, que funcionan como moléculas mensajeras para mediar remodelación estructural, también se detectaron en las estructuras subcorticales del sistema visual 14 de rata adulta. Además, microglial y astroglial de activación a través de diferentes estructuras subcorticales objetivo visual en el ratón se producen en un marco de tiempo post-enucleación específico de una semana 15. Juntos, los resultados de deaferenciación óptica en diferentes respuestas subcorticales en el glial, nivel estructural y molecular. A pesar de estas subcorticalefectos, que no implican necesariamente efectos a nivel cortical 16. Digno de mención, la plasticidad cortical cross-modal, incluyendo modificaciones en otras áreas sensoriales junto al fortalecimiento de las entradas no visuales a la corteza visual privados se producen después de tanto monocular (ME) 3,4,17,18 y binocular (BE) 1,17 enucleación. Además de contribuir a la neurociencia visual, la enucleación como un tipo de deaferentación se puede utilizar para estudiar el equilibrio entre neuroprotectores 19 y neurodegenerativas 20-22 propiedades del sistema nervioso central. Los diferentes procedimientos para llevar a cabo la enucleación ya se han descrito en la literatura. Algunas metodologías para in vivo ME en ratas y ratones son menos sencillo debido a seccionamiento innecesaria de los músculos orbitales y tejido 23-25. Otras publicaciones como Mahajan et al. (2011) 5 proporcionan un protocolo detallado utilizando<html> disección roma para una colección de alto rendimiento de los ojos para estudiar las correlaciones genotipo-fenotipo, probablemente post-mortem. Para su propósito, el método es conveniente y rápido. Sin embargo, este método es menos adecuado para la enucleación in vivo cuando uno opta para estudiar la vía visual aferente después de la enucleación (en los animales vivos) en lugar del propio ojo. En tal escenario, la supervivencia después de la enucleación es de gran importancia. Además, minimal daños vivo y preservación del nervio óptico y el tejido orbital es favorable. A continuación, presentamos un método enucleación alternativa, más similar a la descrita por Faguet et al (2008) 26, que ofrece ciertas propiedades ventajosas:. Se asocia con una recuperación postoperatoria rápida y se caracteriza por un umbral muy bajo de aprendizaje para los investigadores. En general, los diferentes métodos son complementarios dependiendo del enfoque de la investigación posterior: la morfología de los ojos o la investigación de las vías ópticas. ve_content &quot;&gt; En suma, la enucleación se puede aplicar de investigación de la visión hacia investigaciones de plasticidad homeostática y la cruz-modal cerebro, propiedades de respuesta gliales, y la estabilidad axón. En este artículo visualizado, se demuestra un método factible y fiable para la enucleación del ojo in vivo en el ratón.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (Anesketin)</td>
			<td>Dechra Veterinary Products (Eurovet)</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride (Domitor)</td>
			<td>Orion Corporation (Janssen Animal Health)</td>
			<td>BE-V151742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol hydrochloride (Antisedan)</td>
			<td>Orion Corporation (Elanco Animal Health)</td>
			<td>BE-V153352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment (Fucithalmic)</td>
			<td>Leo Pharma nv-sa</td>
			<td>BE 144654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC31 Forceps - Serrated Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps - Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-13</td>
			<td>For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic cotton wool</td>
			<td>Qualiphar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening

La enucleación o la extirpación quirúrgica de un ojo generalmente se pueden considerar como un modelo para deaferentación nervio. Proporciona una herramienta valiosa para estudiar los diferentes aspectos de la visual, cross-modal y la plasticidad del desarrollo a lo largo del sistema visual mamífero 1-4. Este sentido, demuestran una técnica elegante y sencillo para la extracción de uno o ambos ojos en el ratón, que se validó en ratones de 20 días de edad hasta adultos. Brevemente, un desinfectados pinzas curvas se utiliza para pinzar el nervio óptico detrás del ojo. Posteriormente, se realizan movimientos circulares para constreñir el nervio óptico y quitar el globo ocular. Las ventajas de esta técnica son de alta reproducibilidad, un mínimo o ningún sangrado, rápida recuperación post-operatorio y un umbral muy bajo de aprendizaje para el experimentador. Por lo tanto, una gran cantidad de animales puede ser manipulada y procesada con la cantidad mínima de esfuerzo. La naturaleza de la técnica puede inducir daños leves ala retina durante el procedimiento. Este efecto secundario hace que este método menos adecuado en comparación con Mahajan et al. (2011) 5, si el objetivo es recoger y analizar el tejido de la retina. Además, nuestro método se limita a post-oculares apertura de edades (de ratón: P10 - 13 en adelante) ya que el globo ocular necesita ser desplazados de la toma de corriente sin la eliminación de los párpados. La técnica de enucleación in vivo descrito en este manuscrito se ha aplicado recientemente con éxito con modificaciones menores en las ratas y parece útil para estudiar la vía visual aferente de los roedores en general.

La Figura 1 ilustra la eliminación con éxito del ojo utilizando el protocolo descrito y se caracteriza por la ausencia de sangrado o cualquier daño físico evidente para el tejido orbital o cuenca del ojo (Figuras 1A, 1B). Además, el ojo tiene una córnea eliminado lisa, la coroides y el disco óptico, indicativo de un globo completamente intacto (Figura 1C). Dado que nuestro protocolo incluye la sujeción del nervio óptico detrás del ojo y de giro mecánico, el nervio óptico del ojo eliminado es constreñido en la base de la retina (Figura 1D). Realización de los descritos procedimiento da como resultado un nervio óptico de corte limpio y sin ningún daño a la zona cerebral circundante (Figura 1E). Enucleación monocular, en combinación con el mapeo de la actividad (Figura 2), permite delinear fuertemente las regiones funcionales de entrada u ojo específicos en el visua contralaterall corteza del ratón 12,27 o columnas de dominancia ocular, incluso en los mamíferos de orden superior como los monos 28. En experimentos con ratones, la eliminación de una (ME) o ambos ojos (BE) en combinación con la estimulación visual específica y la detección de ARNm de zif268 o c-Fos los niveles de expresión de proteínas se aplicó para descubrir la activación neuronal regional en la corteza visual 12,27 . En contraste con los controles estimulados visualmente (Figura 2A), BE ratones mostraron actividad basal en la corteza visual debido a la completa falta de información visual (Figura 2B). Como tal, se descubrieron las fronteras entre visual con corteza no visual (es decir. Corteza somatosensorial en más secciones anterior y la corteza auditiva en más secciones posteriores). Los resultados de ME ratones con una semana de tiempo de supervivencia visualizaron las regiones de entrada específicos de los ojos en la corteza visual contralateral. Las dos regiones monocularmente impulsadas fueron hipoactivo y ubicados mediy al lateral de la zona binocular central (Figura 2C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51936/51936fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Evaluación cualitativa del estado post-enucleación de la cuenca del ojo, el ojo eliminado y el nervio óptico. Después de la eliminación del ojo con unas pinzas curvas (A) no hay sangrado o daño se observa en la cuenca del ojo (B). El ojo es eliminado completamente intacto como se refleja por una apariencia normal de la córnea y la coroides (C, D). El nervio óptico se estrecha en el disco óptico donde sale del ojo (D). El examen de la parte ventral del cerebro revela un nervio corte limpio óptica (asterisco) y ningún daño aparente a otras estructuras (E). Las barras de escala en C, D: 1 mm. La barra de escala en E: 5 mm. A: anterior; L: izquierdo; P: posterior; R: derecha. Figura 2. funcionales subdivisiones específicas ojo-de entrada en la corteza visual del ratón según lo revelado por la enucleación. Las líneas negras y grises que conectan los ojos y la corteza representan el entrecruzamiento de las fibras aferentes de la retina y de las regiones de entrada específicos de los ojos. La actividad neuronal se visualiza en secciones coronales de control (A), BE (B) y ME (C) ratones por radiactiva de hibridación in situ (ISH) para zif268 (escala de grises) en torno al nivel Bregma -3.40 mm. En los animales control (a), la corteza visual en ambos hemisferios expresa una alta actividad después de la estimulación visual. Cuando uno o ambos ojos (s) se extirpa, una clara disminución de la señal de la actividad es visible en las regiones corticales privadas correspondientes. Monocular enucleado (C) ratones muestran una zona de alta actividad en la zona binocular de la corteza visual rodeado por una disminución de la señal en las zonas monoculares contralaterales al ojo eliminado. Barra de escala: 2 mm. Reproducido con permiso del Van Brussel et al 12.

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A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

La eliminación de los ojos, también llamado enucleación, ofrece una estrategia útil para estudiar los aspectos de la visual, cross-modal, y la plasticidad del desarrollo a lo largo del sistema visual de mamíferos ya que induce irreversible parcial (monocular) o completa (binocular) pérdida de la visión. Aquí se describe un enfoque altamente reproducible y fácil de realizar en la enucleación vivo.

Un método altamente reproducible y fácil de Perform<em&gt; En Vivo</em&gt; Ocular enucleación en el ratón después de la abertura del ojo

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

23.0K vistas.  KU Leuven - University of Leuven.  La eliminación de los ojos, también llamado enucleación, ofrece una estrategia útil para estudiar los aspectos de la visual, cross-modal, y la plasticidad del desarrollo a lo largo del sistema visual de mamíferos ya que induce irreversible parcial (monocular) o completa (binocular) pérdida de la visión. Aquí se describe un enfoque altamente reproducible y fácil de realizar en la enucleación vivo. 

Video: A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Un método simple para determinar el genotipo exacto

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Investigación

Biología

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Un método para el trasplante de islotes pancreáticos para el epiplón en ratón

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin that is secreted by conjunctival goblet cells (CGCs) onto the ocular surface contributes to multiple ocular surface diseases. The elimination of exogenous sex hormones is essential to obtain consistent results during in vitro study of sex-based differences in CGCs. This paper describes a method to minimize the presence of exogenous hormones in the study of sex-based differences in CGCs while maintaining their physiological function. CGCs from postmortem human donors of both sexes were cultured from pieces of the conjunctiva in RPMI medium with 10% fetal bovine serum (FBS) (referred to as the complete medium) until confluency. Nearly 48 h before the start of the experiments, CGCs were transferred to RPMI medium without phenol red or FBS but with 1% BSA (referred to as phenol-red-free medium). The normal cellular function was studied by measuring the increase in intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) after carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulation using fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopy. The result shows that CGCs maintained normal function in the phenol-red-free media after 48 h. No significant difference in [Ca2+]i response was observed between phenol red-free RPMI medium and complete medium upon Cch stimulation. Therefore, we recommend using the phenol-red free RPMI medium with 1% BSA to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of CGCs in the study of sex-based differences.

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Phenol red-free/fetal bovine serum-free medium is a better option than advanced RPMI to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of conjunctival goblet cells in the study of sex-based differences.

In vitro Método para estudiar las diferencias basadas en el sexo en las células caliciformes conjuntivales

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

Modelado y análisis de la degeneración de la retina

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Autor destacado: Desentrañar la patogénesis de la degeneración macular relacionada con la edad y descubrir posibles terapias 

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.