La investigación ocular en los primeros tiempos se basó principalmente en el tejido ocular de individuos fallecidos. Sin embargo, a lo largo de los años, se han desarrollado muchos modelos de roedores oftálmicos y la necesidad de tejido ocular humano ha disminuido. Debido al pequeño tamaño y al área limitada de operaciones en el ojo del roedor, el acceso efectivo a las subpartes oculares está severamente restringido.
Por lo general, para operar el ojo de un roedor, el ojo se inmoviliza a través del nervio óptico y se realiza la disección. Esta práctica es ardua y puede dañar el tejido frágil a medida que el ojo esférico continúa moviéndose durante la disección. A pesar de ser beneficiosa para aislar las diversas secciones de las capas de la retina, esta técnica no puede demarcar la orientación espacial del tejido tras la disección del tejido.
Además, una intervención dirigida es difícil de localizar después de la disección debido al ensamblaje celular homogéneo de la copa ocular posterior y anterior. En este video, se demuestra un método quirúrgico modificado para la microdisección. La presencia de la membrana nictitante adherida, o el tercer párpado, presenta ventajas únicas y significativas.
En este método, primero el globo ocular se enuclea con el tercer párpado, luego se usa el tercer párpado para inmovilizar el ojo. Es seguido por la perforación del globo ocular a través del limbo corneal, y la incisión se utiliza como punto de entrada. Luego, cortando a lo largo de la circunferencia, se separan las copas oculares anterior y posterior.
Al diseccionar aún más la copa ocular posterior, se identifica la capa translúcida de la retina neural y se despega suavemente. Por lo tanto, las capas neuronales y RPE se obtienen para su posterior procesamiento. El tercer párpado nos permitirá demarcar la orientación espacial de la enucleación posterior al ojo.
Sigamos ahora un procedimiento detallado paso a paso. Dilate los ojos de roedores con una gota de soluciones oftálmicas de tropicamida al 0,8% y fenilefrina al 5% y coloque al animal en un área oscura durante 30 minutos antes del procedimiento. Eutanasia al animal mediante la administración intraperitoneal de cinco veces dosis de anestesia.
Una dosis típica es de 200 microlitros PBS que contiene 10 mg de ketamina y un mg de xilazina. Confirme la falta completa de respuesta al estímulo examinando el reflejo del pedal. Coloque el ratón en reclinación lateral para permitir el acceso completo al ojo.
Mantenga una pinza de sutura Colibrí, una pinza curva, una microcuchilla de 15 grados de tamaño tres milímetros, microtijeras de resorte y una microtijera de resorte en ángulo lista para el procedimiento. Coloque una pinza curva alrededor del globo ocular y pellizque para liberar el ojo de accesorios extraños. El tercer párpado, también conocido como membrana nictitante, se encuentra hacia la esquina superior de la tangente nasal y se puede identificar como una protuberancia translúcida menor con límites pigmentados.
A continuación, use una microtijera de resorte y corte alrededor del globo ocular. Pequeños cortes continuos liberan el globo ocular de las inserciones esclerales. Coloque una microtijera de resorte curva debajo del globo ocular para liberar el ojo cortando el nervio óptico.
Coloque el ojo enucleado en una placa de Petri que contenga tampón PBS de tal manera que el globo ocular se sumerja en PBS. Algunos músculos o tejidos extraoculares comenzarán a flotar lejos del globo ocular. Retírelos cortándolos del globo ocular con microtijeras de resorte.
Luego, retire el nervio óptico de la base del globo ocular para permitir una mejor separación de la retina para preparaciones de montaje completo. No es necesario extraer el nervio óptico para la sección del tejido. Transfiera el globo ocular a un tubo de 1,5 ml que contenga un ml de paraformaldehído al 4% o PFA.
Manténgalo durante dos horas a cuatro grados centígrados para la fijación de tejidos. Es posible hacer una pausa en este paso dejando el tejido en PFA durante un máximo de 12 horas a cuatro grados centígrados. Sin embargo, para el aislamiento de células vivas, los pasos de fijación no deben realizarse y todo el procedimiento debe realizarse en continuo.
Después de la fijación de PFA, transfiera el globo ocular a una placa de Petri que contenga PBS y colóquelo bajo un microscopio de disección para realizar el procedimiento posterior. Inmovilice el globo ocular manteniendo presionado firmemente el tercer párpado con pinzas de sutura Colibrí. El limbo es la unión escleral corneal.
Haga una pequeña incisión en el limbo perforándolo con una microcuchilla. La incisión se realiza preferiblemente frente al tercer párpado. A continuación, utilizando esta incisión como punto de partida, con la microtijera realice pequeños y continuos cortes a lo largo de esta circunferencia del limbo escleral corneal.
Primero, complete un semicírculo de cortes comenzando desde el punto de incisión hasta el tercer párpado. Luego complete el semicírculo restante de cortes en el otro lado. Finalmente, haz un corte alrededor del tercer párpado para separar la copa posterior y la anterior.
Retire el cristalino de la copa posterior con fórceps para obtener la copa posterior que comprende la retina neural y la capa de EPR y la copa anterior corneal. Si se trabaja con tejidos no fijos, las copas anterior y posterior ahora se pueden digerir enzimáticamente para obtener la suspensión de una sola célula corneal o retiniana. Para fijar los tejidos, transfiera estas copas a un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de PFA al 4% durante 12 horas a cuatro grados centígrados.
Después de la fijación, el tejido se puede incrustar en el medio apropiado y se puede realizar una criosección o una sección de parafina para obtener secciones corneales o retinianas. Vuelva a introducir la copa posterior en la placa de Petri que contiene tampón PBS. Una capa opaca en la capa pigmentada de RPE es la retina neural.
Despegue la retina neural con un segundo fórceps. Un movimiento muy suave y ligero de la mano es muy recomendable para no dañar el tejido. En el nervio óptico, salida, las tijeras de resorte curvadas se pueden insertar debajo de la retina neural, y se puede hacer un corte para liberar completamente las capas si la retina neural permanece unida.
La retina también se puede liberar o desprender acariciándola suavemente con un cepillo suave. Reintroduzca las copas anterior y posterior en la placa de Petri que contiene tampón PBS. Use una microtijera de resorte en ángulo para hacer un corte junto al tercer párpado desde la periferia perpendicularmente hacia el centro óptico.
Mantenga un agarre del tercer párpado y haga un corte junto al primer corte. Haga un corte similar entre el segundo corte y el tercer párpado. Tres o cuatro de estos cortes equidistantes abren las copas hemisféricas en forma de flor, que cae plana y se puede montar fácilmente.
No haga cortes muy profundos hasta el centro de la copa, ya que esto puede hacer que las secciones de las hojas se deshagan o se separen fácilmente. El medio líquido permite que la copa ocular anterior alcance una estructura curva. Siga los mismos pasos que se indican para hacer cortes en la copa posterior para hacer tres o cuatro cortes equidistantes en la copa anterior.
Los tejidos ahora están listos para una mayor tinción. En esta figura, se muestra todo el montaje de la copa anterior. El tejido corneal se microdiseccionó como se describe para revelar los vasos linfáticos en el tejido conjuntival adjunto de la valva corneal.
En esta figura, se muestra todo el montaje de la retina neural. La vasculatura retiniana de la retina neural se tiñó con isolectina y es visible como vasos verdes. En este método, el globo ocular enucleado de los ratones se obtiene con el tercer párpado adjunto para un manejo efectivo y fácil.
El tercer párpado inmoviliza el globo ocular por completo y permite que la disección proceda con facilidad y errores mínimos. Este método es ventajoso para el seccionamiento específico del tejido ocular, el análisis de células individuales y los montajes completos. Sin embargo, la necesidad de fijación repetitiva del tejido hace que el tejido sea inviable para el cultivo celular o tales necesidades de células vivas.
Por lo tanto, el procedimiento debe realizarse en continuo para el aislamiento de células vivas.
