Name: a highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening
Uploaded: 2014-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening at JoVE.com

We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico della ricerca di KU Leuven ed erano in stretta conformità con le Comunità europee Direttiva del Consiglio del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e con la legislazione belga (KB 29 maggio 2013). È stato fatto ogni possibile sforzo per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e per ridurre il numero di animali. 1 Trattamento e Anesthetics animali <ol><li> Anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato (75 mg / ml) e medetomidina cloridrato (1 mg / kg) in soluzione salina. </li><li> Controllare i riflessi pizzicando le dita dei piedi con una pinza per garantire il mouse è completamente sedato. </li><li> Applicare il 70% di etanolo per disinfettare le palpebre e della regione circostante l&#39;occhio con una punta di cotone. Controllare il riflesso palpebrale per valutare ulteriormente il grado di sedazione. </li></ol> 2 Rimuovere la Eye <ol><li> Assicurarsi che l&#39;animale si trova su una superficie piana, asciutta esuperficie liscia. </li><li> Sterilizzare una pinza con una curva, punta seghettata (formato di punta preferita: 0,5 x 0,4 millimetri). </li><li> Premere delicatamente sul canto (angolo dell&#39;occhio) con la pinza fino a quando il bulbo oculare viene spostata dalla presa e il nervo ottico è raggiungibile. </li><li> Guida la pinza dietro l&#39;occhio. Premere e tenere premuto il nervo ottico saldamente, preferibilmente con l&#39;inizio della curva e non la punta della pinza. Ciò contribuirà a sollevare il globo dalla presa e per bloccare il nervo ottico completa. </li><li> Effettuare movimenti circolari con la mano che tiene la pinza nella direzione con la minima resistenza mentre il mouse rimane sulla superficie piana. Il mouse oscillerà lungo la superficie secondo la direzione del movimento della mano. </li><li> Eseguire questa azione con aumentando gradualmente la velocità fino a quando il nervo ottico è ristretto a due (di solito tra i 7 a 15 movimenti circolari, a circa metà di un giro completo al secondo). Quindi, il bulbo oculare è distaccatorimosso. </li></ol> Cura 3. post-operatorio <ol><li> In caso di sanguinamento (raro), riempire l&#39;orbita con un coagulo viscoso e agente emostatico. </li><li> Invertire l&#39;anestesia iniettando 1 mg / kg di atipamezol cloridrato in soluzione fisiologica per via intraperitoneale. </li><li> Somministrare 1 mg / kg di meloxicam per via intraperitoneale ogni 24 ore per alleviare il dolore. </li><li> Applicare unguento occhio a occhio rimanente per prevenire la disidratazione della cornea. </li><li> Sia l&#39;animale recuperare su una piastra riscaldante o avvolgere l&#39;animale in materiale isolante in una gabbia separata per controllare la temperatura corporea. </li><li> Misurare il peso del mouse ogni giorno per almeno 2 giorni. La perdita di peso può indicare sofferenza e in questo caso, continuare il trattamento meloxicam finché l&#39;animale è completamente recuperato. </li></ol>

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	<li>Toldi, J., Feh&#233;r, O., Wolff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+induced+by+neonatal+monocular+(and+binocular)+enucleation.">Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation.</a> Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).</li><li>Steeves, J. K. E., Gonz&#225;lez, E. G., Steinbach, M. 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The authors have nothing to disclose.

Per eseguire una enucleazione di successo secondo il nostro metodo, i passaggi più critici da considerare sono: 1) utilizzando una pinza con punta ricurva e seghettata di dimensioni adeguate; 2) eseguire l&#39;enucleazione su una superficie liscia e asciutta; e 3) gradualmente accelerare i movimenti circolari in senso con il minimo attrito. Per un risultato efficace, è indispensabile utilizzare un appropriato pinza caratterizzate da una punta ricurva e seghettata (preferito il formato di punta: il mouse: 0,5 x 0,4 mm ratto: 2,15 x 1,3 mm). La curvatura consente un facile accesso al nervo ottico dopo spostamento bulbo oculare ed è necessaria per il posizionamento corretto mano durante l&#39;esecuzione dei movimenti circolari. Punte lisce non sono raccomandati in quanto manca il grip necessario quando si tiene il nervo ottico. La mancata tenere il nervo ottico correttamente durante i movimenti circolari provoca rottura dell&#39;arteria oftalmica, scarsa distacco dell&#39;occhio e quindi scarsa riproducibilità.Pertanto, si raccomanda di prima pratica questa tecnica su animali eutanasia per l&#39;ottimizzazione delle pinze di movimentazione in modo da garantire la massima protezione degli animali una volta che l&#39;applicazione del metodo in vivo. Enucleazione dell&#39;occhio successo è stato recentemente eseguito anche nel ratto nel nostro laboratorio utilizzando la stessa tecnica tranne per trasformare il corpo animale manualmente e mantenere la pinza stazionaria. Una limitazione di questa tecnica è che si potrebbe danneggiare la retina. Pertanto questo metodo è meno adatto per la raccolta retine effettuare istologia 5. Inoltre, il nostro metodo è limitato a postare l&#39;apertura dell&#39;occhio secoli da quando il bulbo oculare deve essere spostato dalla presa, senza asportazione o il taglio delle palpebre. Enucleazione dell&#39;occhio in diverse specie, tra cui roditori, viene eseguita di routine con metodi alternativi, che spesso comportano la rimozione delle palpebre e il taglio del nervo ottico 18,23-25. Questi Methods tendono ad essere più invasivi e hanno una curva di apprendimento superiore alla tecnica qui descritta. Senza la necessità di rimuovere o sutura delle palpebre, il tempo di recupero post intervento chirurgico è ridotto al minimo, con conseguente incremento del benessere degli animali e risultati più riproducibili.

Rimozione di un occhio e quindi irreversibilmente distruggendo la superficie del recettore sensoriale (retina), impone una notevole perdita di input sensoriali lungo il percorso visivo. Il modello enucleazione nel sistema visivo giovanile e adulta ha dimostrato di essere utile nella comprensione dello sviluppo, plasticità e la funzione dei diversi centri visivi 1-4. Le conseguenze molecolari, cellulari e fisiologici di questa deprivazione sensoriale in grado di fornire intuizioni su come normale sviluppo è regolato e come definiti, circuiti corticali affrontare e cambiano la loro struttura e funzione in risposta a una tale vasta alterazione esperienza. Esistono diversi metodi di deprivazione visiva e tutti hanno i loro vantaggi specifici di ricerca sulla visione-correlati. Per esempio allevamento scuro specificamente elimina l&#39;attività guidata visivamente ma non influenza l&#39;attività retinica spontanea. Visua Allo stesso modo, suture coperchio o patch occhi Togliere modellatol ingresso senza disturbare l&#39;attività spontanea, ma permettono la penetrazione della luce dispersa attraverso gli occhi chiusi. Tali metodi sono reversibili e hanno dimostrato di essere utile nella comprensione del ruolo della fantasia visione e di basso livello di correlazione degli ingressi binoculari a scolpire circuiti corticali durante lo sviluppo 6-8. Nella ricerca glaucoma, il nervo ottico modello cotta in animali adulti è stato ampiamente utilizzato perché stabilisce una progressiva perdita di ingressi cellule gangliari della retina che costituiscono il nervo ottico 9,10. D&#39;altra parte, enucleazione, dove l&#39;occhio e quindi la retina è completamente ed immediatamente rimosso, è la scelta appropriata di privazione quando lo scopo è quello di eliminare irreversibilmente visione sia spontanea e modellata in una volta. Induce anche una robusta attività di squilibrio intraoculare che può migliorare il rapporto segnale-rumore negli studi di mappatura dell&#39;attività 11,12. Confrontando cambiamenti funzionali e strutturali in risposta a enucleazione con those dopo deprivazione con metodi meno drastici come il coperchio di sutura per esempio, potrebbe anche esporre nuove intuizioni sul ruolo dell&#39;attività spontanea retinica in entrambi i tipi omeostatici e di plasticità sinaptica. Enucleazione innesca una perdita di influenze trofiche negli obiettivi diretti della retina. Ad esempio, i livelli di BDNF sono significativamente inibiti nel nucleo genicolato laterale (LGN) e collicolo superiore di ratti adulti enucleati 13. Le specie reattive dell&#39;ossigeno, che funzionano come molecole messaggere di mediare rimodellamento strutturale, sono state rilevate anche in strutture sottocorticali del ratto adulto sistema visivo 14. Inoltre, microglia e l&#39;attivazione astrogliale attraverso diverse strutture di destinazione visive sottocorticali nel topo si verificano in un determinato lasso di tempo post-enucleazione di una settimana 15. Insieme, i risultati deafferentazione ottica in diverse risposte sottocorticali a gliale, piano strutturale e molecolare. Nonostante questi sottocorticaleeffetti, che non necessariamente implicano effetti a livello corticale 16. Degno di nota, plasticità corticale cross-modale, comprese le modifiche in altre aree sensoriali accanto al rafforzamento degli ingressi non visive alla corteccia visiva privato si verificano dopo sia monoculare (ME) 3,4,17,18 e binoculare (BE) 1,17 enucleazione. Oltre a contribuire alla neuroscienza visiva, enucleazione come un tipo di deafferentazione può essere usato per studiare l&#39;equilibrio tra neuroprotettivi 19 e neurodegenerative 20-22 proprietà del sistema nervoso centrale. Diverse procedure per eseguire l&#39;enucleazione sono già descritti in letteratura. Alcune metodologie per in vivo ME su ratti e topi sono meno semplici a causa di inutili sezionamento dei muscoli e dei tessuti orbitali 23-25. Altre pubblicazioni come Mahajan et al. (2011) 5 forniscono un protocollo dettagliato con<html> scollamento per una collezione high-throughput di occhi per studiare le correlazioni genotipo-fenotipo, probabilmente post-mortem. Per il loro scopo, il metodo è comodo e veloce. Tuttavia, questo metodo è meno adatto in vivo enucleazione quando si opta per studiare il percorso visivo afferente seguente enucleazione (animali vivi), piuttosto che l&#39;occhio stesso. In un tale ambiente, la sopravvivenza post-enucleazione è di grande importanza. Inoltre, minimal danni vivo e la conservazione del nervo ottico e del tessuto orbitale è favorevole. Qui, presentiamo un metodo alternativo enucleazione, più simile a quello descritto da Faguet et al (2008) 26, che offre alcune caratteristiche positive. Esso è associato ad un rapido recupero post-operatorio ed è caratterizzata da una soglia di apprendimento molto bassa per i ricercatori. In generale, diversi metodi sono complementari a seconda del focus della ricerca successiva: morfologia dell&#39;occhio o di ricerca via visiva. ve_content &quot;&gt; In sintesi, l&#39;enucleazione può essere applicato dalla ricerca di visione verso ricerche di plasticità omeostatica e cross-modale cervello, proprietà di risposta gliali, e la stabilità assone. In questo articolo visualizzato, dimostriamo un metodo fattibile e affidabile per in vivo degli occhi enucleazione in il mouse.

<table><tbody><tr><td>Ketamine hydrochloride (Anesketin)</td><td>Dechra Veterinary Products (Eurovet)</td><td>BE-V136516</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine hydrochloride (Domitor)</td><td>Orion Corporation (Janssen Animal Health)</td><td>BE-V151742</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol hydrochloride (Antisedan)</td><td>Orion Corporation (Elanco Animal Health)</td><td>BE-V153352</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics (cefazolin, Kefzol)</td><td>Eurocept Pharmaceuticals</td><td>BE 106267</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment (Fucithalmic)</td><td>Leo Pharma nv-sa</td><td>BE 144654</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC31 Forceps - Serrated Curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td>For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps - curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-13</td><td>For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td></tr><tr><td>Hemostatic cotton wool</td><td>Qualiphar</td><td>N/A</td><td>Other hemostatic agents are equally suitable (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Viscostat, #649, Ultradent Products)</td></tr></tbody></table>

a highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening

Enucleazione o la rimozione chirurgica di un occhio possono generalmente essere considerate un modello per nervo deafferentazione. Esso fornisce un valido strumento per studiare i diversi aspetti della visuale, cross-modale e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi 1-4. Qui, dimostriamo una tecnica elegante e diretto per la rimozione di uno o entrambi gli occhi nel topo, che viene convalidato in topi di 20 giorni di età fino agli adulti. In breve, un disinfettati pinze curve viene utilizzato per bloccare il nervo ottico dietro l&#39;occhio. Successivamente, movimenti circolari vengono eseguiti per costringere il nervo ottico e rimuovere il bulbo oculare. I vantaggi di questa tecnica sono alta riproducibilità, minimo a nessun sanguinamento, rapido recupero post-operatorio e una soglia molto bassa di apprendimento per lo sperimentatore. Quindi, una grande quantità di animali può essere manipolato e trattati con sforzo minimo. La natura della tecnica può indurre lievi danni alleretina durante la procedura. Questo effetto collaterale rende questo metodo meno adatti rispetto a Mahajan et al. (2011) 5, se l&#39;obiettivo è quello di raccogliere e analizzare tessuto retinico. Inoltre, il nostro metodo è limitata ad aprire post-eye età (mouse: P10 - 13 in poi) in quanto il bulbo oculare deve essere spostato dalla presa senza rimuovere le palpebre. La tecnica di enucleazione in vivo descritto in questo manoscritto è stato recentemente applicato con successo con piccole modifiche nei ratti e sembra utile studiare il percorso visivo afferente dei roditori in generale.

La figura 1 illustra la rimozione successo dell&#39;occhio utilizzando il protocollo descritto ed è caratterizzato dall&#39;assenza di sanguinamento o qualsiasi danno fisico apparente al tessuto orbitale o cavità oculare (figure 1A, 1B). Inoltre, l&#39;occhio rimosso ha una cornea liscia, coroide e disco ottico, indicativo di un globo completamente intatto (Figura 1C). Dal nostro protocollo comprende il bloccaggio del nervo ottico dietro l&#39;occhio e tornitura meccanica, il nervo ottico dell&#39;occhio rimossa è ristretto alla base della retina (Figura 1D). Eseguire i risultati descritti procedura in un nervo ottico clean-cut, senza alcun danno per l&#39;area del cervello circostante (Figura 1E). Enucleazione monoculare, in combinazione con la mappatura dell&#39;attività (Figura 2), permette di delineare nettamente le regioni ingresso funzionali o occhio specifiche nel visua controlateralel corteccia del mouse 12,27 o colonne di dominanza oculare, anche nei mammiferi di ordine superiore come le scimmie 28. Negli esperimenti con i topi, la rimozione di uno (ME) o entrambi gli occhi (BE) in combinazione con mirata stimolazione visiva e il rilevamento di zif268 mRNA o di c-Fos livelli di espressione della proteina è stata applicata per scoprire attivazione neuronale regionale nella corteccia visiva 12,27 . Contrariamente ai controlli stimolati visivamente (Figura 2A), BE topi hanno mostrato attività basale nella corteccia visiva causa completare mancanza di input visivo (Figura 2B). Come tale, i confini tra la corteccia visiva con non-visiva (ad esempio. Corteccia somatosensoriale in più sezioni anteriori e corteccia uditiva in più sezioni posteriori) sono stati scoperti. I risultati di ME topi con un tempo di sopravvivenza di una settimana visualizzate le specifiche regioni ingresso oculari nella corteccia visiva controlaterale. Le due regioni monocularmente guidate erano ipoattivo e trova mediAl e laterale della zona centrale binoculare (Figura 2C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51936/51936fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Valutazione qualitativa dello stato post-enucleazione della cavità oculare, l&#39;occhio rimosso e il nervo ottico. Dopo la rimozione degli occhi con una pinza curva (A) assenza di sanguinamento o danni si osserva nella cavità oculare (B). L&#39;occhio è rimosso completamente intatto come riflesso da un normale aspetto della cornea e della coroide (C, D). Il nervo ottico viene costretto a disco ottico in cui lascia l&#39;occhio (D). L&#39;esame della parte ventrale del cervello rivela un nervo ottico taglio netto (asterisco) e nessun danno apparente di altre strutture (E). Barre di scala in C, D: 1 mm. Bar Scala in E: 5 mm. A: anteriore; L: sinistro; P: posteriore; R: destro. Figura 2.-eye ingresso funzionali suddivisioni nel topo corteccia visiva come rivelato dalla enucleazione. Linee nere e grigie che collegano gli occhi e la corteccia rappresentano il passaggio sopra di afferenze retiniche e delle specifiche regioni di ingresso oculari. L&#39;attività neurale viene visualizzato su sezioni coronali di controllo (A), BE (B), e ME (C) topi radioattivi ibridazione in situ (ISH) per zif268 (scala di grigi) attorno al livello Bregma -3,40 mm. Negli animali di controllo (A), la corteccia visiva in entrambi gli emisferi esprime ad alta attività dopo stimolazione visiva. Quando uno o entrambi gli occhi (s) sono estirpato, una netta diminuzione del segnale di attività è visibile nelle corrispondenti regioni corticali svantaggiate. Monocularmente enucleato (C) topi mostrano una zona di alta actività nella zona binoculare della corteccia visiva circondato da un segnale ridotto nelle zone monoculare controlaterale all&#39;occhio rimosso. Scala bar: 2 mm. Ristampato con il permesso di Van Brussel et al 12.

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A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

La rimozione degli occhi, chiamato anche enucleazione, fornisce una strategia utile per studiare gli aspetti di visual, cross-modale, e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi poiché induce irreversibile parziale (monoculare) o completa (binoculare) perdita della vista. Qui si descrive un approccio altamente riproducibile e semplice da eseguire in vivo enucleazione.

Un metodo altamente riproducibile e semplice da eseguire<em&gt; In Vivo</em&gt; Oculare enucleazione del mouse dopo apertura degli occhi

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

23.3K Views.  KU Leuven - University of Leuven.  La rimozione degli occhi, chiamato anche enucleazione, fornisce una strategia utile per studiare gli aspetti di visual, cross-modale, e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi poiché induce irreversibile parziale (monoculare) o completa (binoculare) perdita della vista. Qui si descrive un approccio altamente riproducibile e semplice da eseguire in vivo enucleazione. 

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Ricerca

Medicina

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Video-oculografia in Mouse

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Neuroscienze

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Biologia

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the cortex to the contralateral eye to a stimulus is much stronger than the response of the ipsilateral eye in the binocular segment of the mouse primary visual cortex (V1). During the mammalian critical period, suturing the contralateral eye will result in a rapid loss of responsiveness of V1 cells to contralateral eye stimulation. With the continuing development of transgenic technologies, more and more studies are using transgenic mice as experimental models to examine the effects of specific genes on ocular dominance (OD) plasticity. In this study, we introduce detailed protocols for monocular visual deprivation and calculate the change in OD plasticity in mouse V1. After monocular deprivation (MD) for 4 days during the critical period, the orientation tuning curves of each neuron are measured, and the tuning curves of layer four neurons in V1 are compared between stimulation of the ipsilateral and contralateral eyes. The contralateral bias index (CBI) can be calculated using each cell&#39;s ocular OD score to indicate the degree of OD plasticity. This experimental technique is important for studying the neural mechanisms of OD plasticity during the critical period and for surveying the roles of specific genes in neural development. The major limitation is that the acute study cannot investigate the change in neural plasticity of the same mouse at a different time.

Here, we present detailed protocols for monocular visual deprivation and ocular dominance plasticity analysis, which are important methods for studying the neural mechanisms of visual plasticity during the critical period and the effects of specific genes on visual development.

Deprivazione visiva monoculare e misurazione della plasticità della dominanza oculare nella Corteccia visiva primaria del mouse

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...

Biologia dello sviluppo

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Puntura-indotta di Neovascularization dell'iride come un modello murino di Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Protocolli di danno alle fibre sensoriali corneali per studi sulla rigenerazione degli assoni

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sull'innervazione corneale attraverso modelli innovativi 

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

Microdissection of the Rodent Eye

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, to obtain the anterior and posterior eyecups. With this technique, the sub-parts of the eye, including the corneal tissue, neural tissue, retinal pigment epithelial (RPE) tissue, and lens, can be obtained for wholemounts, cryo-sectioning, and/or single-cell suspensions of a specific ocular tissue. The presence of the third eyelid presents unique and significant advantages, as it benefits the maintenance of the orientation of the eye, which is important for understanding eye physiology following any localized intervention or in studies involving ocular analysis relating to the eye&#39;s spatial topography.
In this method, we enucleated the eyeball at the socket along with the third eyelid by carefully and slowly cutting through the extraocular muscles and severing the optic nerve. The eyeball was pierced through the corneal limbus using a microblade.&#160;The incision was used as the point of entry, allowing for cutting along the corneal-scleral junction by inserting micro-scissors through the incision point. Small and continuous cuts along the circumference were made until the cups separated. These could be further dissected by gently peeling the translucent layer of the neural retina using Colibri suturing forceps to obtain the neural retina and RPE layers. Further, three/four equidistant cuts were made from the periphery perpendicularly to the optic center until the optic nerve was reached. This opened the hemispherical cups into a floret shape so that they fell flat and could be easily mounted. This technique has been used in our lab for corneal wholemounts and retinal sections. The presence of the third eyelid delineates the nasal-temporal orientation, which allows for the study of various cell therapy interventions post-transplantation and, thus, the targeted physiological validation vital for visualization and accurate representation in such studies.

This paper presents a protocol for ocular micro-dissection in rodents. The process involves the enucleation of the eyeball along with the nictitating membrane (i.e., the third eyelid). This is then followed by the separation of the posterior and anterior eye cups.

Microdissezione dell'occhio del roditore

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

Un metodo altamente riproducibile e semplice da eseguire

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

Video-oculografia in Mouse

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Deprivazione visiva monoculare e misurazione della plasticità della dominanza oculare nella Corteccia visiva primaria del mouse

Puntura-indotta di Neovascularization dell'iride come un modello murino di Rubeosis Iridis

Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Microdissezione dell'occhio del roditore