Los autores desean agradecer a E. de la Rosa y Valenciano AI en busca de ayuda inicial con el establecimiento de los cultivos organotípicos y U. Laub y Gerster U. de asistencia técnica.

Todos los equipos y reactivos para comprar estéril o tiene que ser calor o vapor esterilizado o esterilizado con EtOH al 70%. Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Duisburg-Essen (Alemania). Parte 1: La enucleación de ojos murino de diferentes etapas de desarrollo Enucleación de ojos embrionarias <ol><li> Apareamientos vez embarazadas se establecen y la mañana del día en que se detecta un tapón vaginal en el apareamiento las hembras se designa 0 días de gestación. </li><li> La mujer embarazada se sacrificaron por dislocación cervical cuando el desarrollo de los embriones se ha llegado a la etapa deseada (en este caso: el día embrionario (E) 15) y se fija en una tabla de cera 6. </li><li> La pared abdominal se humedece con EtOH al 70%, corte a lo largo de la línea media y los colgajos de piel se fijan lateralmente por los pines 6. </li><li> El uterusses se retiran del abdomen, individual y se transfiere a un recipiente con PBS frío 6. </li><li> Los embriones se separan, se transfirió a una placa de Petri y la pared del útero y las membranas embrionarias son retiradas por el uso de fórceps 6. </li><li> Los embriones son sacrificados por decapitación. </li><li> Los ojos son enucleados ser el uso de unas pinzas finas, curvas, &quot;peeling&quot; de los ojos de la cuenca del ojo. </li></ol> Enucleación de ojos postnatal y adulto <ol start="1" type="1"><li> Los cachorros son muertos por decapitación, cachorros y adultos mayores por dislocación cervical. </li><li> Hasta la etapa postnatal P15, el punto de tiempo en que los ratones que abras sus ojos, aberturas del ojo tiene que ser mecánicamente abierta por el uso de fórceps y ampliada por dos cortes transversales de los párpados con una tijera de primavera. </li><li> Los ojos son enucleados con la ayuda de pinzas curvas, aplicando presión a la órbita. </li></ol> Nota: Como en el día postnatal 2, los huesos orbitales son aún cartilaginosos, es importante no aplicar demasiada presión al intentar quitar los ojos. Por el contrario, en los ratones adultos, los huesos orbitales son firmes. Por lo tanto, con el fin de la enucleación de los ojos es suficiente para aplicar presión en la órbita sin ampliar las ranuras del ojo por adelantado. Parte 2: La disección de embriones murinos retinas, postnatal y adulto La disección de la retina <ol><li> Los ojos se colocan en una pequeña placa de Petri con PBS estéril y las capas del ojo lo rodea se retiran bajo un microscopio de disección. </li><li> Para eliminar las capas externas del ojo, en las etapas post-natal y los ojos de adultos en el nervio óptico tiene que ser cortado por la ayuda de unas tijeras de primavera o fuera aplastado por unas pinzas tan cerca de la base como sea posible. </li><li> A su vez a los ojos, para que la parte de atrás con el orificio por donde el nervio óptico originalmente residía hacia usted. Entrar en el espacio subretinal entre la retina y el epitelio pigmentario con las puntas de dos pinzas muy bien desde el lugar donde el nervio óptico penetrado en las capas del ojo. Nota: Normalmente, el epitelio pigmentario pueden ser fácilmente identificados por su color oscuro. En algunas cepas de ratones mutantes - especialmente en los animales albinos - esta capa de pigmento sin embargo, puede no ser de color y por lo tanto no puede ser fácilmente de detectar. </li><li> Eliminar el epitelio pigmentario de la membrana coroides y la esclerótica conectado con cuidado desgarro a ambos lados con las dos pinzas. </li><li> Pelar las capas hasta el nivel de la córnea, luego gire el ocular hacia el objetivo y eliminar la córnea, junto con el epitelio pigmentario, membrana coroides y la esclerótica, mientras que la celebración de la copa de retina restante por las pinzas de otros. </li><li> Captar el humor vítreo junto con el pequeño lente y un desgarro, mientras que con una pinza, mantenga el wholemount la retina en su lugar con las pinzas de segundo. Nota: Cuando la disección de los ojos embrionarias, asegúrese de eliminar por completo el triangular, tienda-como plexo capilar por debajo del cuerpo vítreo junto con el humor vítreo. En el ojo del adulto, el vítreo se ha de descubrir a los lados y el cuidado tiene que tener cuidado de no perforar el vítreo con la punta de la pinza que su contenido es viscoso y se adhiere a la pinza, lo que dificulta su eliminación. </li><li> Para la cultura wholemount organotípicos las copas de retina se recogen en una placa de 96 pocillos con 200 l de Dulbecco modificado medio de Eagle (ver más abajo). </li></ol> Nota: Entre la disección de las retinas individuales, mantener la placa de recolección de 96 pozos que contienen el medio de cultivo en la incubadora como el pH del medio de cultivo es provocado por el CO 2 a través del sistema de carbonato. Parte 3: murino wholemount retina organotípicoscultura <ol><li> Preparar 500 ml de la cultura por medio modificado de ponderación de 7,8 g de Dulbecco Eagle / mezcla de nutrientes F-12 HAM (DMEM) y 0,6 g de NaHCO3 y la disolución de ambos en el agua MiIliQ. Ajustar el pH a 7,15. Añadir 50 mg apo-transferrina, 50μl putrescina (stock: 60mg/ml), 50μl selenito de sodio (stock: 52μg/ml), progesterona (stock: 60μg/ml), y 2,5 ml de gentamicina (200 mM) bajo el capó. Mezclar y filtrar a través de un filtro de tapa de la botella. Inmediatamente antes de añadir el uso de glutamina 10μl (200 mm) por medio de cultivo ml. Nota: Este medio sin suero y sin la insulina se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de dos semanas y se utiliza para experimentos de inducción de apoptosis como no contrarresta los efectos de la insulina. Si la incubación de wholemounts por más de 24 horas que se desea y las tasas de muerte celular no se evaluarán, de insulina en suero (por ejemplo, suero fetal bovino, FCS) o suplementos deben ser añadidos para mejorar las tasas de supervivencia. </li><li> Antes de iniciar la cultura, la wholemounts retina se pre-incubaron durante 15 min a 37 ° C con 200 ul caliente, con pH balanceado DMEM conteniendo hialuronidasa 0.5mg/ml para pre-digerir la hialuronidasa que contiene la membrana limitante interna y externa de las células de Müller M las células, facilitando la penetración de las sustancias aplicadas exógenamente. </li><li> Retinas se transfieren a una placa de 24, así como con el menor número posible de hialuronidasa y culta como wholemounts organotípicos en 2 ml de constitución química definida medio de Dulbecco modificado del águila. Nota: Para la transferencia de las retinas, el uso de una pipeta de 1 ml y cortar la punta de la pipeta a unos pocos milímetros para ensanchar la abertura. Para los ojos de embriones, una punta de pipeta de 200 l es suficiente. Los filos de corte se pulirán con la inserción y la torsión de un segundo punta de la pipeta. Por 24-48 horas a corto plazo las culturas, todas las medidas se pueden realizar en el banco, pero si la contaminación de las culturas resulta ser un problema, se debe trabajar bajo el capó. </li><li> Culturas se mantienen durante 24 a 48 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera y por ejemplo, sometidos a tratamiento farmacológico con factores recombinantes. </li></ol> Parte 4: La disociación de la culta wholemounts retina <ol><li> Después del tiempo de la cultura deseada, la retina se recogen en tubos Eppendorf de 2 ml con fondo redondo, que contiene 850 l de PBS y 50 l de albúmina sérica bovina (BSA, 30 mg / ml). </li><li> Colocar tubos Eppendorf con retinas en un bloque de calefacción, calienta a 37 ° C. </li><li> Añadir 25 l de colagenasa (200 U / ml) y 25 l hialuronidasa (20mg/ml) a cada tubo Eppendorf y empezar a disociar la retina en suspensión de células individuales en un 3 pasa a través de una pipeta Pasteur siliconada. </li><li> Añadir 10 l de tripsina (1mg/ml), espere 3-5 minutos, y luego, lentamente, una pipeta 3-5 veces arriba y abajo con silicona pipeta Pasteur para disociar mecánicamente el tejido. </li><li> Añadir 10 l de DNasa I (5mg/ml), de nuevo esperar 3-5 minutos, luego, lentamente, una pipeta 3-5 veces arriba y abajo con silicona pipeta Pasteur. Nota: El tiempo de incubación para la disociación enzimática es variable y depende del tamaño de los ojos y la etapa de desarrollo, respectivamente. Compruebe la etapa de la digestión enzimática del tejido con cuidado pipeteando arriba y abajo. </li><li> Si la suspensión celular no es homogénea, por ahora, pero todavía contiene grandes agregados de células, añadir otros 10 l de tripsina y 10 l DNasa I. </li><li> Cuando la suspensión celular es homogénea, la digestión de los tejidos se detiene mediante la adición de 10 l de EDTA (0,5 M), los tubos Eppendorf se retiran de la estufa y las suspensiones de células se fijan para 1h de la adición de 1 ml fresca, bien fría paraformaldehído 8% (PFA) a temperatura ambiente en un agitador de rotación. </li></ol> Parte 5: Lavado de suspensiones de células disociadas <ol><li> La suspensión celular se centrifugó durante 5 min a 4 ° C y en el 0,2 fcr en una centrífuga de refrigeración. </li><li> Se desecha el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 1 ml de PBS que contenía BSA 3mg/ml. </li><li> Después de repetir los pasos de lavado dos veces, la pastilla es finalmente resuspendidas en 500 l de PBS que contiene 3mg/ml BSA, 5 mM EDTA y 0,1% de azida de sodio. </li></ol> Nota: La adición de ácido de sodio permiten el almacenamiento de la suspensión celular durante varios días a 4 ° C. Sin embargo, si una tinción inmunocitoquímica va a seguir, no añada ácido de sodio para el buffer de resuspensión, ya que esto resulta en la pérdida de la calidad de la tinción. Parte 6: Cytospin de suspensiones de células de la apoptosis y el análisis cuantitativos proliferación <ol><li> Un portaobjetos esmerilado final, un filtro citospina con uno o dos agujeros y un embudo citospina se insertan en una imagen en la diapositiva cytospin. El clip de presentación se cierra y se coloca en el rotor cytospin. </li><li> La suspensión de células disociadas se homogeniza suavemente pipeteando arriba y abajo. Nota: Dependiendo de la etapa de desarrollo de la retina, la suspensión de células a partir de el procedimiento de disociación que tenga quediluirse con PBS para obtener un número contable de las células. </li><li> Una alícuota (100 l) de la suspensión celular se aplica a un embudo de cytospin. Nota: Al pipetear la suspensión de células en el embudo, la punta de la pipeta debe recorrer todo el camino hasta la parte inferior del embudo. Es importante no empujar a través del segundo punto de resistencia de la pipeta ya que esto crea burbujas de aire, que será visible en el lugar de células después de la citocentrifugación y dificulta el recuento de células. </li><li> La suspensión celular se detecta en una diapositiva a 700 rpm durante 7 minutos. </li><li> Para la determinación del efecto de factores exógenos aplicados en los niveles de apoptosis de las células se pueden teñir con 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 2μg/ml), montado con fluorescentes medio de montaje. Los cambios en la apoptosis de las células puede ser determinado por el recuento mínimo de 1000 células (que comprende al menos 10 núcleos picnóticos) en los lugares de células citospina y la tasa de muerte celular se calcula como porcentaje de las células de la cuenta total de 3,4. Nota: Como alternativa, la distribución de los núcleos apoptóticos pueden ser evaluados en flatmounts 3 o criostato sections4 de cultivo wholemounts la retina por TDT mediada por dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL). </li><li> Para la detección de la proliferación celular, BrdU (5 M) se pueden añadir 6 horas antes del fin de la cultura y la incorporación de BrdU visualizado en cytospins de los homogeneizados de células por tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-BrdU (por ejemplo, hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, Iowa, EE.UU.). </li><li> El efecto del tratamiento sobre los diferentes tipos de células de la retina pueden ser visualizados en cytospins por los anticuerpos específicos de neuronas como Brn3a (marcador de las células ganglionares) o opsina (fotorreceptores marcador) y contratinción con DAPI. </li></ol> Parte 7: Resultados de Representante <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1: Pasos en la preparación de la retina murina wholemounts organotípicos A la cabeza de ratón con los dos ojos. B murino ojo con lente de lado, todas las capas siguen en su lugar. Murino ojo C de la parte posterior con el nervio óptico todavía unido. Ojos D murino con esclera y el epitelio pigmentario parcialmente removido. E retina murino con epitelio de la córnea, esclera y el pigmento eliminado por completo, pero la lente y vítreo sigue en pie. eliminado F murino taza de la retina wholemount con la lente y el vítreo. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figura 2" /> Figura 2: Análisis de las culturas organotípicos wholemount la retina por citocentrifugación y secciones Para el análisis de la apoptosis, cytospins de suspensiones de células disociadas se tiñen por DAPI y núcleos picnóticos se pueden distinguir por la fragmentación nuclear o condensación de la cromatina (puntas de flecha en A). Por otra parte, las secciones wholemount (CE, día retina murina postnatal (P) 2) o flatmount retina (F) puede ser sometido a un ensayo de TUNEL y de contraste con DAPI (E). El efecto del tratamiento sobre los diferentes tipos de células de la retina pueden ser visualizados en cytospins por los anticuerpos específicos de neuronas como las células ganglionares marcador Brn3a (flechas en B) GCL, capa de células ganglionares;. INL, prospectivo capa nuclear interna. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2.

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

La ventaja de 2-5 murino organotípicos retina culturas wholemount sobre la disociación, monocapa, retinospheroid o volver a agregar las culturas 3D esferoide 1 se encuentra en la preservación de las interacciones neuronales y las conexiones, imitando la situación in vivo. En comparación con informes anteriores 2, nuestro artículo de vídeo ofrece una demostración detallada de las peculiaridades de la enucleación de ojos murino y la disección de las retinas de l...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

Ablaciones específica de genes y el análisis de modelos animales es la estrategia clásica para inscribir a la función de genes específicos de retina. Sin embargo, transgénicos, modelos knockout específicos retina-o condicional del ratón a menudo muestran letalidad temprana o sufren de malformaciones severas, impidiendo un análisis más allá de las etapas embrionarias o postnatal temprano. Cultivo de células primarias es una alternativa para investigar los efectos de la aplicación exógena de factores recombinantes, la sobreexpresión de los genes o siRNA mediada por caída de genes en un ambiente controlado. Cultivo de células disociadas tiene la ventaja de que las señales endógenas alcanzar las células diana se reducen, lo que facilita la identificación de forma exógena efectos activados después de la manipulación farmacológica. Sin embargo, importantes interacciones célula-célula son inicialmente destruidas por digestión enzimática o la disociación mecánica, aunque reagrupadas culturas retinospheroid 1 se utilizan. Por el contrario, las culturas organotípicos wholemount retina proporcionar un sistema de cerca las necesidades fisiológicas en la situación in vivo de interacciones neuronales y las conexiones de 5.2 aún se conservan. En este artículo ofrecemos un vídeo paso a paso la demostración de (1) el establecimiento de in-vivo como organotípicos culturas retina wholemount incluyendo las peculiaridades de los ojos de la disección de embriones murinos, postnatal y adulto, y (2) un procedimiento de disociación y citospina para el análisis de las neuronas la apoptosis y la proliferación de las células de la retina en wholemounts organotípicos, por ejemplo, después de la cultura en la presencia de factores exógenos aplicados recombinante.

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In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Este artículo video demuestra el establecimiento de cultivos de retina organotípicos wholemount y un procedimiento citospina para el análisis de los efectos inducidos exógenamente. Organotípicos culturas wholemount imitar la retina<em&gt; In vivo</em&gt; Situación y facilitan significativamente la accesibilidad de las retinas murino de manipulaciones experimentales eludiendo las desventajas de los clásicos modelos animales murinos.

En vivo-como organotípicos Cultura murino wholemount retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

in-vivo-like-organotypic-murine-retinal-wholemount-culture

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

17.7K vistas.  University of Duisburg-Essen. Este artículo video demuestra el establecimiento de cultivos de retina organotípicos wholemount y un procedimiento citospina para el análisis de los efectos inducidos exógenamente. Organotípicos culturas wholemount imitar la retina In vivo Situación y facilitan significativamente la accesibilidad de las retinas murino de manipulaciones experimentales eludiendo las desventajas de los clásicos modelos animales murinos.

Video: In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Cultura organotípicos de retina de un conejo adulto

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Investigación

Biología

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Cultura Cortar organotípicos de los cerebros de ratas E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...