We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

NOTA: Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Cuidado de Animales de Ottawa, la adhesión a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. Preparación 1. Pre-quirúrgico y de los Materiales <ol><li> Preparación de plásmido: <ol><li> Preparar plásmidos utilizando el Qiagen Megaprep de acuerdo con el protocolo del fabricante. Inocular al menos 400 ml de caldo LB con bacterias transformadas para asegurar un alto rendimiento de ADN y se incuba durante la noche. </li><li> Plásmido Resuspender en 100-200 l TE a una concentración final de al menos 5 g / l. ADN Alícuota y almacenar a -20 ° C. Si la concentración es demasiado baja, no precipitan y resuspender ya que esto puede añadir impurezas. Empezar de nuevo con una nueva preparación. </li><li> Antes de la cirugía, diluir un único plásmido (Cre-GFP por ejemplo) a 2 g / l en agua estéril con 1 l de 0,1% (w / v) de colorante Fast Green por 10 o 20 l de solución de plásmido diluido. Si las buenas prácticas agrariasy el gen de interés están a ser co-electroporación en plásmidos separados, inyectar el plásmido GFP y el plásmido que lleva el gen de interés en una proporción de 1: 4 para maximizar la probabilidad de que todas las casillas marcadas con GFP se electroporación-Co con tanto plásmidos. </li></ol></li><li> Tire tubos microcapilares vidrio (1 mm de diámetro exterior - en adelante como agujas) en un extractor de aguja estándar, utilizando un solo tirón paso a los 62 ° C. </li><li> Autoclave un paquete quirúrgico que contiene los siguientes: porta-agujas, retractor de heridas, pinzas, tijeras para cirugía, tijeras para agujas, grapadora, grapas, gasas, cubiertas de heridas, paños quirúrgicos (Figura 1A, B, Tabla de Materiales). </li><li> Recoge otras herramientas necesarias: electroporador, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 o 7 mm), solución salina, sutura, 5 ml jeringa (Tabla de Materiales). </li></ol> 2. Prepare ratón de Cirugía <ol><li> Para el manejo del dolor, inyectar un p-cronometradoratón reinante con buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) una hora antes de la cirugía. Aplicar este protocolo para ratones cronometrados en cualquier lugar de embriones día 12,5 (E12.5) a E17.5. </li><li> Utilice Microloader puntas de pipeta para respaldar carga sacó agujas con la solución de plásmido. No llene hasta el final en la punta de la aguja todavía porque esto hará que la aguja se obstruya. </li><li> Anestesiar ratón utilizando gas isoflurano 2-5% con 1 L / min O 2. Una vez inmóvil, coloque en la máscara de la cara y aplique el ungüento en los ojos para evitar que se seque. Inyectar con 1 ml de solución salina (NaCl al 0,9%) por vía subcutánea en la espalda. NOTA: Cuando se trabaja con gas isoflurano, use un eliminador de gas para recuperar el exceso de gas y evitar que se escapen a la habitación. </li><li> Afeitado abdomen. Lave abdomen con Chlorohexadine matorrales, enjuague con agua y aplicar una solución final de preparación de chlorohexadine y etanol al 70%. Ratón cubierta con paño o una gasa estéril para cubrir la piel, pero dejan abdomen descubierto (Figura 1 C, D). </li></ol>En electroporación in utero <ol><li> Hacer una incisión en la piel sobre el abdomen, entre los pezones inferiores. Tire de la piel de la capa muscular subyacente por desgarro del tejido conectivo, luego se corta a través del peritoneo a la cavidad abdominal a lo largo de la línea alba. Insertar el retractor de la herida para tirar de los bordes de la herida aparte. </li><li> Extirpar el útero de la cavidad abdominal y ponerlo hacia fuera como se muestra (Figura 1E). <ol><li> Si son diferentes crías para ser inyectado con diferentes plásmidos (tales como GFP vs. GFP con el gen de interés), contar los cachorros en cada lado y decidir cuáles y cuántos para inyectar con cada plásmido. Reemplazar un lado del útero en el abdomen para mantener los embriones cálido y lubricado. Inmediatamente humedecer el útero expuesta con solución salina (preferiblemente calentado a la temperatura corporal). </li><li> Si la inyección de todos los cachorros con el mismo plásmido (por ejemplo, cuando la inyección de Cre-GFP en embriones transgénicos) ONLy eliminar un cuerno del útero a la vez. </li></ol></li><li> Ponga una aguja colocada en la cabeza de agarre de la varita de inyección y corte cuidadosamente la punta con un par de pequeñas tijeras quirúrgicas o unas pinzas finas. Cortar la punta de modo que la aguja se mantiene tanto tiempo como sea posible mientras que todavía permite que el fluido pase a través (Figura 1Ji-iv). <ol><li> Ajuste la longitud de la inyección (en segundos) y la presión de inyección en el microinyector modo que una pequeña gotita pero fácilmente visible de 0,1-0,2 l aparece en la punta de la aguja cuando se presiona la paleta pie. Mantenga el volumen de esta gotita tan consistente como sea posible entre las diferentes agujas. NOTA: este paso es crucial para la supervivencia de los embriones (véase el debate). </li><li> Utilice los siguientes parámetros de inyección para la FemtoJet: la inyección de presión (pi) = 250-300 hPa; tiempo de inyección (ti) = 0,8-1,2 seg; presión compensación = 10 a 50 hPa. Si es necesario, ajustar estos parámetros para adaptarse a la variación entre las agujas. </li></ol></li><li> Selegir un embrión y suavemente colóquelo en su espalda, la cabeza inclinada hacia arriba (Figura 1F). NOTA: Esto puede requerir girar o cambiar el embrión; tenga cuidado de no aplicar demasiada presión y evitar la ruptura del saco amniótico durante la manipulación del embrión. </li><li> Una vez que el embrión está en su lugar, localizar el ventrículo, que se presenta como una forma de media luna sombra paralela al seno sagital. Toque la punta de la aguja en el útero por encima del ventrículo en un ligero ángulo y guiar la aguja a través de la pared uterina. La cantidad de presión requerida depende de la nitidez de la aguja. Introducir la aguja a través de la corteza hacia el ventrículo. NOTA: A pesar de que no suele haber resistencia detectable adicional, la cabeza del embrión se empuja a menudo lejos un poco y luego retrocede cuando la aguja pasa a través de la corteza hacia el ventrículo. </li><li> Bombear el paddle pie para inyectar la solución de plásmido. Continuar bombeando hasta que un área verde es visible y se ajusta a laforma de arco del ventrículo (Figura 1G). En los embriones jóvenes (E12.5 a E14.5) el colorante a menudo se difundirá en el ventrículo contralateral. NOTA: El número de bombas depende del diámetro de la punta de la aguja, la edad del embrión (y tamaño resultante del ventrículo) y el volumen de inyección deseado. Mantenga el volumen inyectado tan consistente como sea posible entre los embriones. </li><li> Inyectar tres o cuatro embriones. Mantenga todos los embriones expuestos húmedas con solución salina durante todo el procedimiento. </li><li> Volver a los primeros embriones inyectados y colocar las paletas tal que el electrodo positivo atraerá el plásmido en la región deseada del cerebro (Figura 1H). Ángulo el electrodo negativo de modo que el camino más corto entre los electrodos pasa directamente a través de la estructura específica para la electroporación (Figura 2). </li><li> Una vez que las palas estén en su lugar, aplique el choque. Dependiendo de la edad y el tamaño de los embriones, utilizar 5 pulsos de 35-50 V (ver T1 poder). Utilice los siguientes parámetros de electroporación: longitud de pulso de 5 ms, con un intervalo de pulso de 950 ms. Repita el procedimiento con todos los embriones inyectados. </li><li> Cortar la punta de aguja nueva pre-cargado como en el paso 3.3, según la última aguja probable seca y se obstruyen durante el paso 3.9. Inyectar el siguiente conjunto de tres o cuatro embriones, ya sea con el mismo plásmido o un plásmido diferente y luego aplicar el choque como en el paso 3.9. Cuando se inyectan todos los cachorros en un lado del útero, retire el segundo lado del útero del abdomen de la hembra y luego vuelva a colocar el lado completado para mantenerlo caliente. </li><li> Volver ambos lados del útero a la hembra teniendo cuidado de mantener la superficie húmeda con solución salina y no aplicar demasiada presión para evitar traumatismos en las bolsas amnióticas. Suturar la capa muscular cerrado usando un simple puntada continua. Grapa la piel cerrada. Si las grapas no están disponibles, suturar la piel con una puntada simple interrumpida. (Figura 1I) </li><li> Mientras suturing, gire progresivamente el isoflurano para permitir la anestesia de la mujer embarazada para aclarar. NOTA: Esto acelerará el despertar de la presa después de la cirugía es completa; manteniendo la hembra anestesiados durante un tiempo tan corto como sea posible mejorará la supervivencia del embrión. Tiempo quirúrgico total, a partir de cuando la hembra está anestesiado primero, debe ser de aproximadamente 30 min. </li></ol> 4. Cuidados postoperatorios <ol><li> Coloque la hembra suturado en una incubadora o en una almohadilla de calefacción para recuperarse de la anestesia. Su cama en ropa de cama limpia y colocar un gel de recuperación estándar en la jaula a mantener la hidratación. Para el manejo del dolor después de la cirugía, darle las mujeres tres dosis de buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) en intervalos de 8 h después de la cirugía, luego cuatro dosis adicionales a intervalos de 12 h. </li></ol> 5. Los cerebros de cosecha NOTA: Los cerebros se pueden cosechar en cualquier edad hasta la edad adulta. Se aplica lo siguientepara la recogida de cerebros antes del nacimiento. Tenga en cuenta que una vez que nacen las crías, el orden dentro del útero se pierde, así que o cada cachorro de la camada debe ser inyectado con el mismo plásmido, u otro método para diferenciar entre el control y los animales de experimentación se debe desarrollar. <ol><li> Preparar frío (4 ° C), se filtró 4% de paraformaldehído (PFA) antes de la eutanasia hembra. </li><li> La eutanasia a la hembra mediante una inyección intraperitoneal de una dosis letal de pentobarbital sódico (100 mg / kg de peso corporal) y cortar abdomen abierto. Tire de ambos lados del útero y diseñar como cuando las crías se inyectaron inicialmente. <ol><li> En el caso en el que todos los cachorros recibieron el mismo plásmido, por ejemplo, cuando la inyección de Cre en una camada transgénicos, orden embrión no es importante, por lo tanto, cortar el útero de la hembra y el lugar en PBS. </li><li> Si se inyectaron cachorros con diferentes plásmidos, asegúrese de ubicar cada cachorro, observando cualquier crías muertas, y determinar cuáles fueron inyectados con el control y experimenplásmidos am- antes de la extirpación del útero de la hembra. Tenga cuidado de no perder de vista que las crías pertenece a qué grupo después de que el útero está en PBS. </li></ol></li><li> Retire cada cachorro individualmente, decapitar con tijeras afiladas o una hoja de afeitar y colocar la cabeza en PBS. En el caso de los ratones transgénicos, recolectar muestras de tejido para el genotipado y mantener cada cabeza separada, tal como en una placa de 12 pocillos. </li><li> Bajo un microscopio de disección, retire el cerebro del cráneo, teniendo cuidado de no cortar la corteza o rasgar la línea media. El uso de un microscopio de fluorescencia, comprobar para ver si el cerebro tienen una GFP + parche, lo que indica que se sometieron a electroporación con éxito. </li><li> Fijar cerebros por inmersión en PFA a 4 ° C durante la noche. NOTA: Compruebe los cerebros para la expresión de GFP antes de la fijación desde PFA menudo apaga la señal. </li><li> Cerebros Cryoprotect través de la inmersión en el 20% de sacarosa durante al menos tres días antes de la congelación. Utilice un gradiente de sacarosa de 10%, 15% y 20% (24 h en cada solución) to prevenir el daño tisular debido a la presión osmótica. Almacenar cerebros congelados a -80 ° C y cortar en un criostato a 10-14 micras de espesor secciones. </li></ol> 6. Co-tinción con anti-GFP NOTA: Si la recuperación de antígenos es necesario para co-mancha con anti-GFP, es importante utilizar un protocolo de recuperación de antígeno suave que no comprometa la señal de GFP. Algunos protocolos de recuperación de antígeno son demasiado duras para utilizar en conjunción con la tinción de GFP (incluso con un anticuerpo contra GFP). Un ácido cítrico básica pre-tratamiento antes de la aplicación del anticuerpo primario tiene éxito para la mayoría de los epítopos 24. <ol><li> Prepare una solución de ácido cítrico 0,01 M en ddH 2 O. pH a 6 utilizando un medidor de pH calibrado. </li><li> Ácido cítrico de calor en la cámara de tinción en el microondas o al baño maría hasta que los ácidos cítrico alcanza 75-80 ° C. Ponga las diapositivas en la cámara de tinción durante 10-15 min. Mantenga la temperatura lo más estable posible. </li><li> Lávese las diapositivas en PBS3x durante 3 min a temperatura ambiente. Aplicar el anticuerpo primario y proceder con la inmunotinción de acuerdo con un protocolo estándar. </li><li> Validar Cre escisión mediada por la co-etiquetado para GFP y el gen de interés para confirmar derribar (Figura 3A). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

Dos de los principales desafíos en la realización en electroporaciones útero son 1) la prevención de letalidad embrionaria y 2) la disminución de la variabilidad entre electroporaciones. Uno de los factores más importantes en la prevención de la letalidad es la calidad de la aguja, como agujas romas infligen más daño al embrión. Al cortar la aguja, mantener la punta el mayor tiempo posible mientras que todavía permite una gotita visible de 0,1-0,2 l de fluido a aparecer después de una bomba...

Migración radial es un proceso fundamental para el desarrollo cortical temprana. Depende de una variedad de factores autónomos celulares, tales como correcta la salida de mitosis y la diferenciación neuronal, la polaridad celular, regulación de la dinámica y la expresión de receptores transmembrana del citoesqueleto, así como los factores autónomos no celulares, tales como la formación del andamio glial radial y secreción de orientación migratoria moléculas 1-3. Desde la interrupción de cualquiera de estos mecanismos puede perjudicar la migración neuronal en un modelo de ratón transgénico 4-8, la determinación de la causa subyacente de un defecto en la migración puede ser un proceso complejo y difícil. En el útero de electroporación (IUE) se puede utilizar para complementar y simplificar interpretación del fenotipo de un modelo genético knock-out y por lo tanto dilucidar los mecanismos importantes que se requieren para la migración radial 7,9-11. En electroporación in utero (IUE) es el proceso por el cual un carryi plásmido<html> ng tanto un gen de interés y un reportero se inyecta en el ventrículo en el cerebro de un ratón o rata embrión y luego introduce en las células que recubren el ventrículo a través del uso de una corriente eléctrica 12-14. Esto permite al investigador analizar el efecto de arriba o hacia abajo regulación de un gen de interés en el desarrollo o la función de las neuronas electroporadas. Después de IUE, cerebros pueden ser procesadas para inmunohistoquímica 7,9-11, electrofisiología 15 o cultivo celular 16,17. La principal ventaja de IUE es que se permite la manipulación altamente específica de la expresión génica. Además, IUE se puede utilizar para apuntar a una región específica del cerebro en desarrollo a través de una corriente (Figura 2) se indica. IUE también se puede utilizar para dirigirse a un tipo celular específico a través de la inyección de plásmidos que llevan genes bajo el control de diferentes promotores o sistemas de activación plásmido (inducida por tetraciclina de la expresión génica es un ejemplo) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE puede ser utilizado en conjunción con el sistema de escisión de genes mediada por Cre-Lox 7-9,11,22. Un plásmido que contiene un gen que codifica el mensaje para la proteína Cre puede someterse a electroporación en un embrión homocigotos para el alelo floxed ( en el que las regiones de genes o ADN específica están flanqueadas por dos sitios loxP para Cre recombinación de ADN mediada). Cre entonces inducir la recombinación del gen de interés específicamente en los precursores neuronales electroporadas, generando un knock-out de la floxed allele.The efecto de proteína desmontables sobre la migración y el desarrollo dentro de las neuronas individuales neural puede entonces ser estudiada. La electroporación de Cre induce la recombinación en una pequeña población de células afectadas, dejando el entorno de apoyo intacto. En cambio, la expresión específica de tejido de Cre bajo el control de un tipo celular específico promotor, se produce a lo largo de todo el tejido de modo que ambos neuroblastos migran y el ambiente circundante podrían verse afectados. Por lo tanto, juxtaposition de estos dos enfoques puede determinar si un defecto migración dada es debido a los teléfonos mecanismos no autónomos autónomos o celulares. La migración defectuosa en ambos sistemas experimentales sugiere que los resultados fenotipo observado desde un mecanismo autónomo de la célula; la migración normal después de la electroporación de Cre con la migración defectuosa en un modelo de Cre específica de tejido indica que el gen de interés está actuando a través de un mecanismo autónomo no celular. IUE también se puede utilizar para llevar a cabo experimentos de rescate por electroporación genes que interactúan potenciales en animales knock out 7,9,10. Por ejemplo, un investigador podría intentar rescatar a un fenotipo de la migración en un modelo transgénico por electroporación un blanco de abajo y determinar si el defecto se corrige en la migración de las neuronas a electroporación. Esto tiene la ventaja adicional de que un rescate exitoso indica que la migración normal puede ser restaurado mediante la manipulación de la expresión de proteínas en un speneurona especí-, a pesar de que el ambiente circundante todavía es deficiente para el gen diana. Una vez más, este enfoque es más tiempo y rentable que cruzar o la generación de líneas transgénicas, con el beneficio añadido de determinar si el mecanismo defectuoso es la célula autónoma. IUE se puede utilizar para realizar un seguimiento de la migración de las neuronas a través de electroporación de un plásmido reportero en knock out embriones (Figura 4C). Como sólo las neuronas que recubren el ventrículo en el momento de la cirugía se electroporan 17, IUE se puede utilizar para seguir las neuronas nacidos en un momento determinado con la ventaja de visualización de su morfología in vivo. Finalmente, es posible utilizar IUE para apuntar regiones del cerebro tales como el telencéfalo o medial dorsal, hipocampo o eminencia ganglionar (Figura 2). Esto le da a los investigadores la facultad de investigar la función de genes en un área específica independiente de complicaciones de Resultadosción de la proteína desmontables en las estructuras vecinas. Proteína retinoblastoma (pRb), p107 y p130 comprenden la familia de proteínas bolsillo y se los reguladores de salida del ciclo celular bien establecido. Sin embargo, cada vez hay más pruebas de que estas proteínas también regulan el ciclo celular aspectos independientes del desarrollo neural. Como hemos demostrado anteriormente, pRb y p107 desempeñan un papel crucial tanto tangencial 4,23 y la migración radial 6. Aquí, nos demuestran el papel de la proteína bolsillo familiares pRb y p107 en la migración neuronal 6 de ejemplificar el uso de electroporación en el útero de la CRE en un modelo transgénico. En resumen, IUE proporciona una poderosa manera de analizar los efectos de células autónomas de supresión de genes (o sobreexpresión). Cuando se combina con específica noquear modelos tejidos, IUE puede proporcionar información adicional con respecto a los mecanismos que controlan la migración neuronal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

Supresión genética utilizando el sistema Cre-Lox en líneas de ratones transgénicos es una herramienta poderosa para estudiar la función de la proteína. Sin embargo, excepto en los modelos muy específicos Cre, la supresión de una proteína a lo largo de un tejido o célula de la población a menudo conduce a fenotipos complejos resultantes de múltiples mecanismos que interactúan. La determinación de si un fenotipo resultados de la interrupción de un mecanismo autónomo celular, que es intrínseca a la célula en cuestión, o desde un mecanismo autónomo no celular, que resultaría de deterioro del medio ambiente de esa célula, pueden ser difíciles de discernir. Para obtener una perspectiva de la función de proteínas en un contexto in vivo, in utero electroporación (IUE) permite la supresión de genes en un pequeño subconjunto de células dentro de la corteza en desarrollo o alguna otra región del cerebro seleccionada. IUE se puede utilizar para apuntar a áreas específicas del cerebro, incluyendo el telencéfalo dorsal, telencéfalo medial, el hipocampo, o eminencia ganglionar. Esto facilita la observación of las consecuencias de célula autónoma deleción del gen en el contexto de un entorno saludable. El objetivo de este protocolo es mostrar cómo IUE se puede utilizar para analizar un defecto en la migración radial en una línea de ratones transgénicos floxed, con énfasis en la distinción entre los efectos de células autónomas autónomos y no celulares de eliminación de proteínas. Al comparar el fenotipo resultante de la deleción del gen dentro de toda la corteza en comparación con deleción del gen mediada por IUE en una población celular limitada, una mayor comprensión de la función de proteínas en el desarrollo del cerebro se puede obtener mediante el uso de cualquiera de las técnicas en el aislamiento.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

La inducción de la proteína a través de Supresión<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación para definir Déficits en Neuronal migración en modelos transgénicos

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.1K vistas.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Video: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...