Este trabajo fue apoyado por becas de investigación G0400268 y MR / K018396 / 1 del Consejo de Investigación Médica, y por la Acción de Investigación Médica. Más apoyo fue proporcionado por el Instituto Nacional de Londres Hospitales Centro de Investigación Biomédica Escuela Universitaria de Investigación en Salud.

Todos los experimentos con animales llevados a cabo en este estudio se ajustaban a la legislación nacional y europea y fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Farmacia de la UCL y el Ministerio del Interior británico (HO). Todo el trabajo de los animales se llevó a cabo bajo el proyecto HO licencias PPL, 80/2243 y 70/7773 PPL. 1. Preparación de la rata <ol><li> Llevar a cabo todos los experimentos in vivo utilizando ratas Wistar neonatales libres de patógenos. </li><li> Conserve todas las crías de rata (12 neonatos por colonia) en jaulas individuales con sus madres lactantes (9-11 semanas de edad las hembras), en condiciones óptimas (19-21 ° C, 45 - 55% de humedad, 15 a 20 cambios de aire / hora y 12 horas de luz / oscuridad ciclo). </li></ol> 2. Preparación de la célula bacteriana <ol><li> Tienda E. stocks coli K1 en 20% (v / v) de glicerol a -80 ° C. Para cada experimento, la placa de las bacterias de valores Onto Mueller-Hinton (MH) placas de agar, y se incuba a 37 ° CO / N. </li><li> El día antes de la alimentación, inofinales de los 10 ml de caldo de MH con un solo E. coli K1 colonia y cultivo O / N a 37 ° C, 200 rpm. Como control para la contaminación medio, preparar 10 ml de caldo MH sin inocular e incubar a 37 ° C a 200 rpm. </li><li> Transferir 100 l de suspensión O N / bacteriana en 9,9 ml de caldo MH (1: 100 v / v), y se incuba a 37 ° C, 200 rpm, hasta que se alcanza exponencial media de fase, correspondiente a una densidad óptica de 0,6 medido a una longitud de onda de 600 nm (OD 600). </li></ol> 3. La alimentación de ratas recién nacidas con E. coli K1 <ol><li> Aplique suavemente el animal en posición vertical en un lado de la piel del cuello, permitiendo que la boca se abra. Lentamente inserte la punta de pipeta estéril en la boca del animal, y la pipeta 20 l del inóculo (~ 37 ° C) en la boca del animal durante un período de tiempo de 30 seg. Volver al animal a su madre inmediatamente después de la alimentación. </li><li> Verifique que 4-8 x 10 6 bacterias han sido alimentados to cada cachorro por dilución en serie del inóculo en PBS y manchado en placas de agar MH. </li></ol> 4. Evaluación de la colonización por E. coli K1 <ol><li> Aplique suavemente al animal en una parte de la piel del cuello. Humedezca un hisopo con punta de algodón estéril en PBS estéril, y luego limpie suavemente el área perianal. Volver al animal a su madre inmediatamente después limpiando. </li><li> Coloque la punta del hisopo en un tubo que contiene 300 l de PBS estéril y almacenar en hielo. </li><li> Determinar el número de bacterias viables por dilución en serie en PBS y enchapado en placas de agar MacConkey. </li><li> Determinar viable E. coli K1 por las pruebas de sensibilidad bacteriófago. Escoja una colonia individual utilizando un bucle microbiológica estéril, se sumerge en 200 l de PBS estéril, a continuación, con sujeción a un mezclador vortex. </li><li> Utilizando un asa microbiológica estéril, sub-cultivo en agar MH en una línea recta. Deje que la placa se seque durante 30 segundos, y luego pipeta de 10 l de bacK1E teriophage (10 9 unidades formadoras de placa / ml (PFU / ml)) en el centro de la línea. Incubar la placa de O / N a 37 ° C. </li><li> Al día siguiente, examine la placa para la lisis mediada por bacteriófago. </li></ol> 5. Evaluación de la gravedad de la enfermedad <ol><li> Evaluar la gravedad de la enfermedad de cada animal 4 - 5 veces al día usando el sistema de calificación de siete puntos se indica en la Tabla 1. </li><li> Si un puntajes animales ≥3 de 7, sacrificar inmediatamente al animal para minimizar el sufrimiento. Registre el animal muerto. </li></ol> 6. eutanasia de ratas recién nacidas y de extracción de sangre <ol><li> Aplique suavemente el animal en una mano, dejando al descubierto la cabeza y el cuello. Desinfectar el cuello del animal frotando con un algodón con alcohol. Desinfectar un gran par de tijeras que utilizan etanol al 70%, antes de enjuagar en PBS estéril para eliminar el etanol rastro. </li><li> Aplique suavemente el animal directamente sobre una placa de Petri. Decapitar al neonato mediante surgi agudotijeras cal, lo que garantiza que la sangre gotea en la placa de Petri. Evitar el contacto con la cabeza para evitar la contaminación de la sangre con flora de la piel. </li><li> Inmediatamente recoger la sangre con una pipeta estéril y mezclar con la sal de sodio de heparina a una concentración de 20 - 50 unidades / ml en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. </li><li> Determinar el número de bacterias viables por dilución en serie en PBS y enchapado en placas de agar MacConkey. Determinar el número de E. viable coli K1 mediante pruebas de la susceptibilidad de las bacterias viables para K1E bacteriófago. </li></ol> 7. Disección <ol><li> Después de la decapitación de la rata neonatal, utilice condiciones asépticas para escindir y recoger tejidos de interés. Lavar todos los instrumentos (que se muestran en la Figura 1) en etanol al 70% y PBS estéril. </li><li> Limpie la junta disección y mojar el abdomen completamente con etanol al 70%. Coloque el cadáver en su parte posterior y fijar a la placa de disección por (i) fijar la pata trasera izquierda ala mesa de operaciones con una aguja estéril, (ii) estirar el cadáver y la fijación de la pata delantera derecha a la mesa de operación, (iii) fijar la pata trasera derecha y la pata delantera izquierda a la mesa de operación. </li><li> Tire de la piel a lo largo del lado izquierdo de la parte inferior del abdomen utilizando fórceps, luego se corta a lo largo del lado izquierdo del cadáver desde la parte inferior del abdomen al esternón mediante pequeñas tijeras de disección. </li><li> Extienda la extirpación a través del esternón, y luego hacia abajo a la derecha del cadáver desde el esternón hasta el bajo vientre utilizando pinzas y pequeñas tijeras de disección, lo que garantiza que ninguna de las estructuras subyacentes están dañados. </li><li> Por último, tire suavemente hacia abajo el colgajo de piel desde el esternón hasta el bajo vientre usando iris pinzas de disección curvas para exponer el peritoneo. </li><li> Elevar suavemente el peritoneo con una pinza y corte vertical para exponer los órganos internos, asegurando que ninguno de los órganos subyacentes están dañados. </li></ol> 8. Recolecciónel tracto gastrointestinal <ol><li> Identificar el estómago, intestino delgado, ciego, colon y sistema linfático mesentérico. </li><li> Retire el estómago por transección suavemente a cada lado, entonces coloque en un bijou que contiene 1,6 ml de PBS estéril usando fórceps estériles. </li><li> Seccionar el colon en el recto. Tire con cuidado toda la masa intestinal del cadáver utilizando pinzas de disección y colocar en un plato de Petri estéril. Asegúrese de que esto se hace con cuidado para que la estructura intestinal y estructuras linfáticas mesentéricas no se separan. </li></ol> 9. Separación del tracto gastrointestinal y el sistema linfático mesentérico (Figura 2) <ol><li> Verter 30 ml de PBS estéril en la placa de Petri, asegurando el tracto GI está completamente sumergido. </li><li> Identificar la masa central del sistema linfático mesentérico, y pellizcar utilizando pinzas de disección finas. Identificar la parte más proximal del intestino delgado, y pellizcar el uso de fórceps de disección finas. </li><li> Tire lentamente del Central masa de sistema linfático mesentérico y el intestino delgado distal en direcciones opuestas hasta que los dos tejidos están completamente separadas una de la otra. Realizar este proceso con cuidado para asegurarse de que el intestino delgado no se estiran, ya que esto evita la colección reproducible de proximal, medio y distal regiones. Coloque el sistema linfático mesentérico en 300-500 l de PBS estéril y colocar en hielo. </li></ol> 10. La sección del tracto gastrointestinal <ol><li> Seccionar el tracto GI en el ciego para separar el intestino delgado desde el colon. </li><li> Coloque los dos puntos en 300-500 l de PBS estéril y colocar en hielo. </li><li> Recoger los tejidos representativos de las regiones proximales, intermedias y distales del intestino delgado. Alinear el intestino delgado desde el punto medio. </li><li> Entonces, (i) recoger los últimos 2 cm de tejido antes de la ciego como el intestino delgado distal, (ii) recoger el tejido 5-7 cm por encima del punto medio como el intestino delgado proximal, y(Iii) recoger el tejido de 3 - 5 cm por debajo del punto medio como el intestino delgado medio. </li></ol> 11. Recogida de Hígado <ol><li> Identificar los tres lóbulos del hígado de la rata después de la eliminación del estómago. </li><li> Tire lóbulos lejos de la cavidad abdominal utilizando pinzas de disección finas. </li><li> Retire el hígado mediante la reducción de los ligamentos que sujetan con unas tijeras finas. Coloque hígado en 300-500 l de PBS estéril y el lugar en el hielo. </li></ol> 12. Recogida del Bazo <ol><li> Identificar el bazo. </li><li> Tire de bazo de distancia desde el estómago y el uso de tijeras finas para cortar el ligamento gastroesplénico. </li><li> Coloque el bazo en 300-500 l de PBS estéril y colocar en hielo. </li></ol> 13. Recopilación de los Riñones <ol><li> Identificar los riñones que se harán visibles en la parte posterior de la cavidad abdominal después de la retirada del tracto gastrointestinal y otros órganos. </li><li> Uréteres Cut y cualquier ligamentos que unen ucantar tijeras de disección finas y eliminar riñones utilizando unas pinzas finas. Retire las glándulas suprarrenales y cualquier material graso (si todavía unido) usando pinzas finas y tijeras de disección. </li><li> Coloque ambos riñones en 300-500 l de PBS estéril y colocar en hielo. </li></ol> 14. Recogida del cerebro <ol><li> Después de la decapitación, mantenga la cabeza en posición vertical utilizando pinzas curvas. Apriete la piel en la parte superior de la cabeza longitudinalmente utilizando otro conjunto de pinzas curvas, y hacer una incisión con tijeras de disección finas. Cortar la piel que queda cerca del cuello, de nuevo longitudinalmente con tijeras de disección finas. </li><li> Tire de la piel en una dirección hacia el exterior utilizando unas pinzas finas en ambos lados para revelar el cráneo y extraer colgajos de piel con unas tijeras de disección finas. Coloque las tijeras de disección finas en la apertura de la columna vertebral y hacer una incisión a lo largo del cráneo hacia la tribuna. </li><li> Tire de las dos secciones del cráneo en una dirección hacia el exterior utilizando unas pinzas finas. Cortar para eliminar segmentos del cráneo. </li><li&gt; Eliminar cerebro utilizando pinzas anchas, usando un movimiento hacia arriba recogiendo desde la apertura de la médula hacia la tribuna. Lavar el cerebro en PBS dos veces para eliminar cualquier sangre de procedimiento de la decapitación. </li></ol> 15. Procesamiento de tejido y homogeneización <ol><li> Para los experimentos que requieren recuentos de viabilidad o la extracción de ADN, tejidos lugar en tubos que contenían PBS estéril. Inmediatamente determinar el número de bacterias viables por dilución en serie en PBS y enchapado en placas de agar MacConkey, o almacenar a -20 ° C con 20% de glicerol para corto plazo. Para la extracción de ADN, tejidos almacenar a -20 ° C. </li><li> Para los experimentos que requieren la extracción de RNA, lugar tejidos en volúmenes apropiados de solución RNAlater (10 l por cada 1 mg de tejido), a continuación, guarde inmediatamente a -20 ° C para el corto plazo o a -80 ° C de almacenamiento a largo plazo. </li><li> Para los experimentos de formación de imágenes, los tejidos que requieren lugar en solución 10 ml methacarn (60% de metanol, 30% de cloroformo y ácido acético al 10%), a continuación, almacenar unat RT (20 - 25 ° C) durante un máximo de 3 semanas. </li><li> Calcular el peso del tejido por comparación de peso de los tubos antes y después de la adición de los tejidos. Homogeneizar los tejidos utilizando un homogeneizador. Lavar el homogeneizador una vez en etanol al 70% y dos veces en PBS estéril entre la homogeneización de cada muestra. NOTA: la fijación methacarn es deseable para la fijación de las muestras intestinales a fin de preservar las estructuras de defensa de la mucosa relacionada con mucina; la fijación con formalina se puede utilizar para los tejidos sistémicos. </li></ol>

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	<li>Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+meningitis+in+the+newborn:+a+prospective+study+of+mortality+and+morbidity.">Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity.</a> 23 (5), 218-225 (1999).</li><li>Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+diagnosis,+and+antimicrobial+treatment+of+acute+bacterial+meningitis.">Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).</li><li>Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queir&#243;s, F., Nova, C. V., Lucena, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+newborn+bacterial+meningitis+and+sepsis+during+the+pregnancy+period+for+public+health+care+system+participants+in+Salvador,+Bahia,+Brazil.">Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil.</a> J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).</li><li>Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+of+the+newborn:+basic+mechanisms+and+clinical+correlates.">Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).</li><li>Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K1+capsular+polysaccharide+associated+with+neonatal+meningitis.">Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis.</a> N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).</li><li>Korhonen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hemolysin+production,+and+receptor+recognition+of+Escherichia+coli+strains+associated+with+neonatal+sepsis+and+meningitis.">hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis.</a> Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).</li><li>Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysialic+acid+in+the+plasticity+of+the+developing+and+adult+vertebrate+nervous+system.">Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).</li><li>Koedel, U., Pfister, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+experimental+bacterial+meningitis.">Models of experimental bacterial meningitis.</a> Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).</li><li>Tunkel, A. R., Scheld, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+pathophysiology+of+bacterial+meningiits.">Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits.</a> Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+K1+capsule+is+the+critical+determinant+in+the+development+of+Escherichia+coli+meningitis+in+the+rat.">The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).</li><li>Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+Escherichia+coli+share+common+virulence+factor+profiles,+serotypes+and+phylogeny+with+other+extraintestinal+E.+coli.">Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli.</a> Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).</li><li>Sarff, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Escherichia+coli+K1+in+healthy+and+diseased+newborns.">Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns.</a> Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).</li><li>Schiffer, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+relation+between+invasiveness+and+the+K1+capsular+polysaccharide+of+Escherichia+coli.">A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli.</a> Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).</li><li>Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+infant+intestinal+microbiota.">Development of the human infant intestinal microbiota.</a> PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).</li><li>Nassif, X., Bourdoulous, S., Eug&#232;ne, E., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+extracellular+pathogens+cross+the+blood-brain+barrier.">How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier.</a> Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).</li><li>Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infant+rat+as+a+model+of+bacterial+meningitis.">The infant rat as a model of bacterial meningitis.</a> J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).</li><li>Birchenough, G. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+innate+defenses+in+the+neonatal+gastrointestinal+tract+in+response+to+colonization+by+neuropathogenic+Escherichia+coli.">Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).</li><li>Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+antimicrobial+peptides+of+innate+immunity.">Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).</li><li>Bevins, C. L., Salzman, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells,+antimicrobial+peptides+and+maintenance+of+intestinal+homeostasis.">Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).</li><li>Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+meningitis+in+infant+rats+after+intranasal+inoculation.">Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation.</a> J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).</li><li>Bortolussi, R., Ferrieri, P., Bj&#246;rkst&#233;n, B., Quie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+K1+polysaccharide+of+Escherichia+coli:+relationship+to+virulence+in+newborn+rats+and+resistance+to+phagocytosis.">Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis.</a> Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).</li><li>Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+neonatal+Escherichia+coli+meningitis:+induction+of+bacteremia+and+meningitis+in+infant+rats+fed+E.+coli+K1.">Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1.</a> Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).</li><li>Pluschke, G., Mercer, A., Kuse&#263;ek, B., Pohl, A., Achtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+bacteremia+in+newborn+rats+by+Escherichia+coli+K1+is+correlated+with+only+certain+O+(lipopolysaccharide)+antigen+types.">Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types.</a> Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+capsule-selective+endosialidase+E+minimizes+changes+in+organ+gene+expression+induced+by+experimental+systemic+infection+with+Escherichia+coli+K1.">Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+polysialyl+capsule+during+blood-to-brain+transit+of+neuropathogenic+Escherichia+coli+K1.">Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+cure+of+systemic+Escherichia+coli+K1+infection+by+modification+of+the+bacterial+phenotype.">Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).</li><li>Achtman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+widespread+bacterial+clones+among+Escherichia+coli+K1+isolates.">Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates.</a> Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+Escherichia+coli.+infection+with+recombinant+bacteriophage-derived+capsule+depolymerase.">Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).</li><li>Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacteriophages+specific+for+the+K1+polysaccharide+antigen+of+Escherichia+coli.">Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El modelo animal descrito aquí se basa en el trabajo previo que tuvo como objetivo reproducir las características más destacadas de las infecciones de origen natural en los seres humanos. Ratas neonatales fueron empleados inicialmente para estudiar la meningitis infantiles debidas a H. influenzae tipo b como la especie cumplía los criterios clave para un modelo robusto de la infección. Por lo tanto, la puerta de entrada del agente patógeno debe reflejar la de la infección humana natural y reproducible dan lugar a patología similar de duración suficiente para permitir la intervención terapéutica. Las técnicas utilizadas no debe limitar la aplicabilidad del procedimiento y no deben contribuir a la evolución de la enfermedad 20. El modelo de H. influenzae meningitis en ratas infantiles desarrolladas por Moxon y sus colegas satisface estos criterios de 20; la infección natural se produce después de la colonización de las membranas mucosas del tracto respiratorio superior y esta característica importante fue replicado en las crías de rata por no traumatic de la instilación de las bacterias sobre las membranas de los pasajes nasales. Es importante destacar que la naturaleza dependiente de la edad de la infección se repitió en el modelo. El mismo grupo también fueron los primeros en desarrollar un modelo no-invasiva de E. coli K1 NBM en la rata neonatal 22. Cachorros Sprague-Dawley libres de patógenos fueron colonizados por la alimentación de 10 agosto hasta 10 octubre bacterias a través de una sonda gástrica por vía oral; El inóculo fue, por tanto, considerablemente más alta que la empleada por nosotros. La colonización con las tres cepas K1 examinaron, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) y LH (O75: K1: H3), se produjo en una proporción relativamente alta (48-74%) de K1 animales alimentados, pero la incidencia de bacteriemia, meningitis y la mortalidad fueron variables y significativamente inferiores a las tasas de colonización. La naturaleza clonal de E. infección experimental coli K1 se estableció más tarde 23 y ahora es evidente que sólo O18: K1 y, en menor medida, O7: K1 serotipos son capacespara causar consistentemente infección sistémica. Por esta razón, estas investigaciones de la patogénesis de E. neuropatogénico coli K1 se basa en el uso de la O18 virulencia mejorada: K1 cepa A192PP. Una comparación de E. coli K1 alimentación de ratas neonatales a través de un tubo gástrico, como el usado por Glode y sus colegas 22, y un método de alimentación por goteo como se emplea por el grupo de Achtman 23 reveló un número excesivo de muertes utilizando el método anterior, es casi seguro que debido a los daños a las superficies mucosas por parte de la tubo gástrico. Como las tasas de colonización son comparables con estos dos métodos, se recomienda utilizar el método menos invasivo de la alimentación de las bacterias utilizando una pipeta con una punta estéril, tal como se describe en esta comunicación. E. coli cepa A192PP utilizado en nuestros estudios es O18: K1. Es un derivado más virulento de la cepa clínica E. coli A192 que se recuperó originalmente de un paciente con septicemia 27 </sup&gt;. El aumento de la virulencia de la cepa se obtuvo mediante pases en serie a través de ratas neonatales 26. La cepa provoca una gravedad de la enfermedad depende de la edad, con un 100% de bacteriemia y mortalidad cuando se administra hasta 2 días de edad los animales 28. En contraste, 9 días de edad los animales son completamente resistentes a la enfermedad. -K1 específica bacteriófago lítico se puede utilizar para diferenciar E. coli K1 de otras E. coli cepas 29. En este estudio, la susceptibilidad de las bacterias viables para K1E bacteriófago se debe utilizar para (i) comprobar la pureza de la E. suspensiones coli K1 preparados para ser alimentados a los animales, y (ii) para diferenciar E. coli K1 de otros coliformes para calcular la viabilidad en hisopos perianales, sangre y muestras de tejido. Si la colonia es E. coli K1, será susceptible a la lisis K1E bacteriófago, y el crecimiento bacteriano se inhibió en el sitio de la inoculación bacteriófago. Si la colonia no es E. coli K1, se bresistente a la lisis KIE bacteriófago e, y debe haber un área de crecimiento bacteriano en el sitio de la inoculación bacteriófago. Debe tenerse en cuenta que los modelos animales no pueden reflejar todas las características de la enfermedad de origen natural. El modelo actual puede ser modificado para examinar las características de virulencia de bacterias distintas de E. neuropatogénico coli A192PP y las variaciones en el tamaño del inóculo colonizar pueden ser acomodados. Las futuras aplicaciones de la técnica pueden incluir la evaluación de medicamentos muy necesarios para el tratamiento de la enfermedad y para descubrir los detalles de la respuesta del huésped a la invasión y colonización de los tejidos. El método descrito aquí es simple pero eficaz. Se utilizaron 12 crías como grupos de prueba o de control y este enfoque dentro de la camada asegura un alto grado de reproducibilidad y validez estadística - camadas individuales de 10. Es imperativo que los cachorros son devueltos a sus madres naturales tan pronto como sea posible después de cualquier procedurcorreo y camadas no deben, por tanto, comprender los animales sometidos a diferentes intervenciones. Es importante que el inóculo Fed ser calentada de otro modo los cachorros rechazarán la cultura ofrecido. Las crías se desarrollan rápidamente una microbiota compleja y dentro de los dos días de nacer, el tracto gastrointestinal está colonizado con una amplia gama de bacterias de los filos establecido como las más abundantes microbios en el niño y el adulto intestino. Los cachorros que no han sido alimentados con E. coli A192PP no llevan E. coli K1 en el tracto GI 17 y así la determinación de las tasas de colonización es relativamente sencillo. Sin embargo, el método -basado Neus qPCR para la detección de la colonización de E. coli K1 es mucho más sensible que los métodos de cultivo tradicionales y se recomienda 17.

Infecciones bacterianas sistémicas son una gran amenaza para el bienestar y la supervivencia del recién nacido; los bebés prematuros son especialmente vulnerables. La meningitis bacteriana neonatal (NBM), frecuentemente asociada a la sepsis bacteriana, sigue siendo una fuente importante de mortalidad y morbilidad durante las primeras semanas de vida y el problema se ve agravado por la continua evolución de la resistencia a los fármacos antibacterianos de primera línea de 1,2. Un caso de NBM es una emergencia médica que lleva a una alta carga médica, social y económica 3; en consecuencia, hay una necesidad urgente de nuevos agentes terapéuticos y, en particular, nuevas estrategias profilácticas para reducir la carga de la infección. Algunas características de NBM son inusuales: en el mundo desarrollado, Escherichia coli y estreptococos del grupo B son responsables de la gran mayoría de los casos y la capacidad de estas cepas para obtener NBM está casi siempre asociada con la presencia de un polisacárido ca protectorapsule que permite al patógeno para evadir el reconocimiento inmune procesa 4. Una proporción muy elevada (80-85%) de neuroinvasiva E. coli exprese la cápsula K1 5,6, un polímero de ácido polisiálico ligada α-2,8 que es estructuralmente idéntico al anfitrión de moduladores de la plasticidad neuronal 7. La evaluación de nuevos productos terapéuticos y profilácticos para NBM y bacteriemia asociada y la sepsis se beneficiaría claramente de un modelo animal robusto de la infección que imita las características clave de la enfermedad en el recién nacido humano, en particular, la fuerte dependencia de la edad y de la vía natural de infección . Una amplia gama de modelos para la meningitis bacterianas Gram-positivas y Gram-negativas están disponibles 8,9 y estos tienen amplió considerablemente nuestro conocimiento de las opciones patogenia, fisiopatología y el tratamiento de estas infecciones. Por lo tanto, las infecciones experimentales en ratas, ratones, conejos y monos se han utilizado para estudiar la meningitis en tanto el neonate y el adulto. Sin embargo, muchos de estos modelos emplean la inyección intracisternal o subcutánea directa de bacterias para la iniciación de la infección, la creación de un patogénesis artificial sin pasar por procesos naturales de difusión desde el sitio de la colonización. En algunos casos estos métodos de inoculación condujeron a cambios significativos en la patología; por ejemplo, la administración subcutánea de E. cepas de coli K1 abrogadas la dependencia de la edad asociada con la infección natural, la producción de bacteriemia y la invasión del sistema nervioso central (SNC) tanto en recién nacidos y adultos 10. Predisposición a E. coli NBM es críticamente dependiente de la transmisión vertical del agente causal de la madre al bebé durante o poco después del nacimiento 11. Maternalmente derivado de E. bacterias coli K1 colonizan el tracto gastrointestinal neonatal 11-13 (GI), que es estéril al nacer, pero rápidamente adquiere una microbiota compleja 14. En los recién nacidos colonizados, E. coliK1 bacterias tienen la capacidad de trasladar desde la luz intestinal hacia la circulación sistémica antes de entrar en el SNC a través de la sangre-cerebro o barreras sangre-líquido cefalorraquídeo 9,15. El diseño de modelos sólidos de infección experimental debería tomar estos datos en cuenta. Aunque los ratones han sido ampliamente utilizados para el estudio de algunas formas de meningitis bacteriana 8, que no son adecuados para el estudio de la infección neonatal: están abrumados por la infección sistémica y no muestran la fuerte dependencia de la edad característica de los bebés humanos 16. Además, α-defensinas, péptidos clave del tracto GI proporcionar protección contra la invasión sistémica por E. coli K1 17, son altamente expresado en las células de Paneth y neutrófilos en seres humanos y ratas, pero no en ratones 18. Hay un notable grado de duplicación, la redundancia y la heterogeneidad en defensinas ratón y los genes relacionados cryptidin no se encuentra en otro unimals 19. La rata neonatal fue utilizado inicialmente por Moxon y compañeros de trabajo de 20 a investigar la patogenia de la meningitis por Haemophilus influenzae después de la inoculación intranasal, replicando el sitio natural de la colonización de este patógeno neonatal en el ser humano, y posteriormente adaptado para la edad dependiente E. coli K1 bacteriemia y meningitis. Bortolussi et al. 21 inyección intraperitoneal empleada del inóculo bacteriano para iniciar la infección, pero el estudio clave de Glode y compañeros de trabajo el 22 de alimentación gástrica oral utilizado en paralelo la vía natural de infección después de la colonización gastrointestinal. A medida que el tubo gástrico puede dañar las superficies mucosas, el procedimiento se perfeccionó para incluir la alimentación del inóculo a los recién nacidos 23. Aquí, el método para GI colonización y procedimientos para el seguimiento de la infección en crías de ratas susceptibles se describen tracto; Adicionalmente, se discuten las aplicaciones terapéuticas y preventivas del modelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td>
			<td>Harlan, UK</td>
			<td>www.harlan.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K1 A192PP</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriophage K1E</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0337</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P4417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>E7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>84020 
			Prepare 20-50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Solution</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R0901 
			10&#181;l/mg tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>320099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>C2432</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>322415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped swabs</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>11542483</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcotip Swabs</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>www.scientificlabs.co.uk</td>
			<td>SWA1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P5856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL Universal Tube</td>
			<td>AlphaLaboratories, UK</td>
			<td>www.alphalabs.co.uk</td>
			<td>CW3890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1405-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1415-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;l calibrated loops</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-0112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped spreaders</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-1005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>10594175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12780036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with blunt tips</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12391369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps watchmaker&#39;s curved with very fine points&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12740926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight with very fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12972055</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Scissors</td>
			<td>VWR, UK</td>
			<td>www.vwr.com</td>
			<td>USBE4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Syringe Needles</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
			<td>N2525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>PerkinElmer, UK</td>
			<td>www.perkinelmer.co.uk</td>
			<td>L60000BB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unitemp Incubator</td>
			<td>B&#38;T, UK</td>
			<td></td>
			<td>OP958</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>INFORS HT, UK</td>
			<td>www.infors-ht.com</td>
			<td>AJ118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td>
			<td>IKA Werke</td>
			<td>www.ika.com</td>
			<td>0003737000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

La investigación de las interacciones entre huésped animal y patógeno bacteriano sólo tiene sentido si el modelo de infección empleada replica las principales características de la infección natural. Este protocolo describe los procedimientos para el establecimiento y la evaluación de la infección sistémica debido a neuropatogénico K1 Escherichia coli en la rata neonatal. La colonización del tracto gastrointestinal conduce a la difusión del patógeno a lo largo del curso de gut-linfático-sangre-cerebro de la infección y el modelo muestra una fuerte dependencia de la edad. Una cepa de E. coli O18: K1 con la virulencia mejorada para la rata neonatal produce excepcionalmente altas tasas de colonización, la translocación al compartimento de la sangre y la invasión de las meninges siguiente tránsito por el plexo coroideo. Como en el huésped humano, la penetración del sistema nervioso central se acompaña de inflamación local y un resultado invariablemente letal. El modelo es de probada utilidad para el estudio de los mecanismosde la patogénesis, para la evaluación de las intervenciones terapéuticas y para la evaluación de la virulencia bacteriana.

El E. coli K1 modelo de infección sistémica se describe aquí se replica muchas de las características de la infección natural en los seres humanos. Las bacterias se ingieren, colonizar el tracto GI, trasladar en el compartimiento de sangre a través de los ganglios linfáticos mesentéricos antes de establecer la enfermedad específica de órgano con la inflamación del cerebro asociada 24. Es importante destacar que el modelo muestra una fuerte dependencia de la edad; como se muestra en la Figura 3, de dos días de edad (P2) crías de rata son altamente susceptibles a la enfermedad invasiva, pero durante un período de siete días los animales se vuelven progresivamente más refractario a la infección, pero no para la colonización del tracto GI 17. Después de tránsito desde el lugar de GI colonización al compartimento de sangre, las bacterias pueden ser visualizados en muestras de sangre por microscopía de fluorescencia (Figura 4) antes de entrar en el SNC predominantemente en el plexo coroideo 25. En algunos animales, hay una extensa invasión de otros órganos principales, tales comopulmón, bazo y riñón 25. El número de bacterias en los tejidos pueden variar sustancialmente entre crías individuales 25, pero cuando la carga biológica se anotó como presente o ausente existe un alto grado de reproducibilidad con respecto a la invasión de órganos. Con una camada de 12 cachorros como una única cohorte de prueba, cálculos de potencia utilizando G Software * Potencia determinaron que este tamaño de la muestra equivale a un 98.6% de probabilidad de encontrar un efecto sobre la base de la supervivencia usando seis animales de la cohorte y&gt; 99% de probabilidad si todo doce son tomados en consideración. El modelo es por lo tanto adecuado para la evaluación de nuevos agentes específicamente adaptados para el tratamiento de infecciones bacterianas neonatales y se ha utilizado en el procedimiento para evaluar el potencial terapéutico de la cápsula despolimerasa EndoE que elimina selectivamente la cápsula K1 de la superficie bacteriana 24-26. También se puede utilizar para investigar las interacciones huésped-bacteria que inciden en la pathogenesis de E. neuropathogens coli; dentro de este contexto, se ha empleado para los estudios de E. coli A192PP colonización y diseminación. Se ha demostrado que la E. células coli A192PP persisten en el tracto GI de P2, P5 y P9 cachorros en grandes números; aspectos temporales de la colonización en estos tres grupos fueron muy similares (Figura 5) y refleja la capacidad de las bacterias de replicar y mantener la densidad de población en el intestino. La virulencia de la cepa clínica A192 fue realzada por paso en serie en ratas neonatales con el fin de asegurar poca o ninguna redundancia del uso de animales. E. coli A192 colonizada P2 ratas neonatales con una eficiencia del 100%, provocó la bacteriemia en el 35% de los animales y produjo un efecto letal en el 25% 27. El A192PP derivado passaged coloniza el tracto GI, produce bacteriemia y causa letalidad en todos los cachorros P2. Así, el modelo se puede emplear para investigar la virulencia de diferentes cepas K1 con respecto a su capacidad para invadir el SNC otros sistemas de órganos y desde el sitio de la colonización. En este contexto, Pluschke y compañeros de trabajo 23 utilizaron un modelo de infección neonatal de rata para determinar la capacidad de 95 E. coli K1 cepas de origen humano para causar bacteremia después de la colonización del intestino; observaron grandes variaciones en la eficiencia de tanto la colonización y la capacidad invasiva, que sustenta la naturaleza clonal de E. coli K1 neuropathogens. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Materiales para la recogida de tejidos: (A) balanza, (B) tubos previamente pesados ​​que contienen los medios necesarios, (C) operación mesa, regla y agujas de precisar el animal, (D) 70% (v / v) etanol y PBS para esterilizar el equipo de recogida de tejidos, <strong&gt; (E) kit de recogida de tejido incluyendo un gran par de tijeras para decapitación y tijeras y pinzas y cuchillas de diversos tamaños y formas, (F) de hielo para preservar los tejidos, (G) 70% (v / v) de etanol para la esterilización la mesa de operaciones y sus alrededores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Separación del tracto GI y el sistema linfático mesentérico. (A) Agarre la masa central del sistema linfático mesentérico con unas pinzas de disección finas. (B) Sujete la parte proximal del intestino delgado, y tirar en direcciones opuestas. (C) El tracto gastrointestinal y el sistema linfático mesentérico hará plenamente separate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. La supervivencia de las crías de rata neonatal de entre dos días (P2) a nueve días (P9) después de la administración oral de E. coli A192PP, que ilustra la fuerte dependencia de la edad de la infección sistémica. Cada grupo representa a 24 recién nacidos. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Las imágenes de fluorescencia de E. células coli A192PP en un frotis de sangre de un cachorro infectado; P2 después de la administración oral de bacterias. El antígeno O del lipopolisacárido en la superficie bacteriana era stobjetivó con conejo anti-O18 anticuerpo policlonal y de cabra anti-conejo conjugado con Alexa546 segundo anticuerpo. La cápsula K1 se visualizó con el reactivo EndoE-GFP. Prácticamente todas las bacterias detectadas en muestras de sangre muestran la cápsula protectora K1. Las imágenes fueron capturadas por el Dr. Andrea Zelmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. E. coli A192PP colonización intestinal tras la administración del inóculo bacteriano de ADN. Se extrajo el conjunto delgado y E. coli K1 unidades formadoras de colonias / g (CFU / g) de tejido determinada por la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) la orientación del gen polysialyltransferase (Neus) como se describe en otra parte 17 </sup&gt;. LD: límite de detección. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Característica </td><td> Saludable </td><td> Insalubre </td></tr><tr><td> El color de la piel </td><td> Rosa </td><td> Pale / Amarillo </td></tr><tr><td> Agilidad (reflejo de enderezamiento) </td><td> Pup invierte inmediatamente en la colocación hacia atrás </td><td> Dificultad en la reversión de la colocación hacia atrás (&gt; 3 s) o no se puede lograr </td></tr><tr><td> Una suave presión sobre el abdomen </td><td> No hay sonido </td><td> Sonido de agitación </td></tr><tr><td> Estómago / línea de leche </td><td> Visible y blanco </td><td> No visible </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> Cálido </td><td> Relativamente frío * </td></tr><tr><td> Peso </td><td> Ganancia de 1,5 a 2 g por día </td><td> Sin aumento de peso o pérdida de peso </td></tr><tr><td> Comportamiento cuando se coloca en la jaula </td><td> Se mueve hacia la madre y comienza feeding </td><td> No se puede mover hacia la madre y muestra dificultad para la alimentación </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Siete-punto sistema de puntuación: Los tres primeros resultados de la siguiente lista son por lo general los signos iniciales observados. * Los recién nacidos con infección sistémica experiencia elevada temperatura corporal (&gt; 2 ° C). Sin embargo, debido a la falta de agilidad de los animales para llegar a su madre a mantener la temperatura corporal, los animales no saludables pueden separarse de la zona de arena y sentir frío a la mano desnuda.

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Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Aquí, se describe un procedimiento para el establecimiento de la infección sistémica en la rata neonatal con cultivos de Escherichia coli K1. Este procedimiento no invasivo permite la colonización del tracto gastrointestinal, la translocación del patógeno a la circulación sistémica, y la invasión del sistema nervioso central en el plexo coroideo.

Modelo no invasiva de neuropatogénico<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La infección en Neonatología Rata

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.8K vistas.  University College London.  Aquí, se describe un procedimiento para el establecimiento de la infección sistémica en la rata neonatal con cultivos de Escherichia coli K1. Este procedimiento no invasivo permite la colonización del tracto gastrointestinal, la translocación del patógeno a la circulación sistémica, y la invasión del sistema nervioso central en el plexo coroideo. 

Video: Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Investigación

Inmunología e Infección

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...