Los autores desean agradecer al laboratorio de la Dra. Carol Kim para la formación de microinyección, Clarissa Henry para el asesoramiento relativo a la aceleración el desarrollo del embrión y el uso de los equipos, y Nathan Lawson para contribuir FLI1: peces EGFP. Damos las gracias a los miembros del laboratorio Wheeler y Shawn Paredes para la lectura crítica del manuscrito. También nos gustaría agradecer a Mark Nilan para el cuidado de los peces y el asesoramiento, y Ryan Phennicie y Gabor Cristina de asesoramiento técnico sobre este proyecto. Este trabajo fue financiado por una ayudantía de investigación MAFES a los hermanos K., MAFES Hatch subvención E08913-08, y un premio de los NIH CNRR P20RR016463 a R. Wheeler.

Todos los protocolos de atención de pez cebra y los experimentos se realizaron bajo Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC) de protocolo A2009-11-01. 1. Morfolino y platos de larvas de inyección Experimental Duración: * (10-15 minutos) Grado de dificultad: * <ol><li> Para inyecciones de huevo, preparar una solución al 2% de agarosa en agua estéril y microondas. Cuando la solución se haya enfriado vierta un poco de ella en un plato extra profunda Petri (Fisher Scientific) hasta que esté medio lleno. Enfriar en hielo y hacer que la placa esté nivelada. </li><li> Una vez que el plato se ha enfriado, se vierte una capa de 15 ml superior de agarosa al 2%. Rocíe una inyección de huevo molde de plástico acanalado (Adaptive herramientas de la ciencia) con agua estéril con una botella de spray. Coloque con cuidado el lado de la ranura hacia abajo en el molde caliente de agarosa. Cuando la agarosa se haya enfriado, utilizar una espátula de metal plana (VWR Scientific) para disociar el molde de la AGAse levantó. Poco a poco quitar la rejilla de la agarosa. Envuelva los platos de inyección de embriones en Parafilm (VWR Scientific) y la tienda invertida a 4 ° C. </li><li> Para las inyecciones de larvas de peces, preparar una solución al 2% de agarosa como se ha descrito. Vierta la solución en un tamaño estándar de placa de Petri (VWR Scientific) y dejar de lado hasta que solidifique. Envuelva los platos de las larvas de inyección de Parafilm y la tienda invertida a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparación de cultivo de hongos Experimental duración: ** (30 minutos) Grado de dificultad: ** <ol><li> Preparar extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) placas de agar: 10 g / litro de extracto de levadura, 20 g / litro de peptona, 20 dextrosa g / litro, y 20 g / litro de agar en y autoclave. Para líquido YPD preparar 10 g / litro de extracto de levadura, peptona 20 g / litro, 20 dextrosa g / litro y 20-30 minutos autoclave a 121 ° C. </li><li> Dos días antes de las infecciones de preparar un plato de pescado de la racha de congeladosexistencias de Candida albicans culturas en agar YPD para obtener colonias aisladas. </li><li> Incubar a 37 ° C durante la noche. </li><li> Poner 5 ml de caldo de YPD a 16 x 150 mm tubos de cultivo (VWR Scientific). </li><li> El día antes de las infecciones de pescado tomar una pequeña colonia en el agar YPD con una clavija de madera (VWR Scientific). Poner el palo en el tubo de la cultura y la forma de remolino en torno a una nueva suspensión de colonias en el líquido YPD. </li><li> Crecer durante la noche a 37 ° C en un tambor de rodillo Cultura TC-7 tejido equipado con una rueda de prueba de 14 pulgadas tubo (New Brunswick Scientific). </li><li> Al día siguiente, la desaceleración de 1 ml de la cultura en g 14000x durante 1 minuto en un tubo de 1,7 mL (Axygen). Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en el líquido residual con el vórtex (VWR Scientific). </li><li> Añadir 1 ml 1x Tampón fosfato salino (VWR Scientific) y girar como se describió anteriormente. </li><li> Repetir el lavado con PBS 3 veces. </li><li> Diluir dilución 1:100 en PBS 1x (10 l de lavado C. albicans en 990 l P 1xBS). </li><li> Cuente con un hemocitómetro (VWR Scientific). </li><li> Diluir a 10 7 células / ml. </li></ol> 3. Infecciones de pez cebra Experimental Duración: **** (1-3 horas) Grado de dificultad: **** <ol><li> Recoge los embriones de acuerdo a la sección 5 y la tienda en la yema de agua, 60 mg / L de sales de mar instantáneos (Fisher Scientific) en agua desionizada estéril. </li><li> Utilizando un microscopio de disección, tales como la SZ61 Olympus (Olympus), embriones dechorionate en día infección. Use unas pinzas Dumont Dumoxel (VWR Scientific) para sacar el corion 27 pedazos como la apertura de una bolsa de papas fritas, o suavemente la pinza en la posición cerrada en el corion y luego poco a poco a abrir. El pescado debe estallar a la derecha del corion. </li><li> Agitar el plato Petri adicional de profundidad con la tapa en mover el pescado en el centro del plato. Transferir los peces a la tapa de la cápsula. Quitar huevo-agua y sereemplazar con medio fresco. Añada el pescado a los medios. </li><li> Caliente los platos de inyección de larvas en una incubadora a 28 ° C. Preparar tricaína metano sulfonato (Occidental Chemical Inc.) la dilución a 200 mg / ml para anestesiar a los peces. </li><li> Contar el número deseado de las larvas de la infección (20-50 pescado). Coloque el pescado en una solución tricaína metano sulfonato y esperar 1-2 minutos hasta que deja de moverse. </li><li> Encienda la unidad MPPI-3 de la inyección (Applied Scientific Instruments). Asegúrese de que el interruptor de presión es el &quot;pulso&quot; y la &quot;duración de impulso&quot; se ajusta a 9 con 3 PSI para la unidad de contrapresión. Abrir la válvula al tanque de nitrógeno hasta que la presión en la unidad de inyección lee 30 PSI. </li><li> Cargar una tira micropipeta 28 con 5 l de vórtex Candida albicans a una concentración de 1x10 7 células / ml. Colocar la micropipeta en el titular de la micropipeta (Applied Scientific Instruments). Llenar un vacío plato extra de Petri con agua profunda. Mueva la micropipeta hasta que la punta is dentro de vista simplemente tocando la superficie del agua a través de microscopio de disección y el uso Dumont Dumoxel pinzas (VWR Scientific) para recortar la aguja aproximadamente 3 mm desde la punta de la pipeta sacó. </li><li> Pulse el interruptor de pie (Applied Scientific Instruments) para verificar que la aguja ha sido recortada. Usted debe ver el líquido se dispersan si tuvieron éxito. El diámetro del bolo líquido no debe ser más grande que el diámetro de la pupila de la larva de pez cebra prim 25 (0,21 mm, dando una esfera de 4,9 nL en volumen). Ajustar la presión de acuerdo a si el bolo de líquido es demasiado grande o demasiado pequeño. </li><li> Se anestesia a los peces en metano sulfonato tricaína (200 ug / ml). Una vez que los peces han dejado de moverse, girar el plato con la tapa puesta hasta que el pescado se encuentran en el centro. Recoge el 50 peces utilizando una pipeta de transferencia (Fisher Scientific). Toque en el lado de la pipeta para liquidar a los peces hacia la punta. Suavemente pipetear pescado en el plato de larvas de agarosa utilizando como líquido poco como sea posible. </li><li> Cubra el pescado con una varilla de vidrio liso (tenga cuidado de no aplastarlos!). Aspirar el líquido que sea posible, fuera del plato. Use un KIMWIPE que absorbe y expulsa a la basura cualquier humedad. </li><li> Coloque el plato de larvas de peces de agarosa bajo el microscopio hasta que obtener una buena vista de los peces y la aguja, al mismo tiempo. Mueva la aguja de cristal hacia el pez. Zoom sobre los peces y la aguja a medida que la posición de la aguja hacia el pez. Cuidadosamente mueva la aguja de vidrio en la vesícula ótica 27, 29 (del oído) de los primeros peces. Usted sabrá una vez que haya movido la aguja en el pescado, porque cuando se presiona el interruptor de pie (Applied Scientific Instruments), el ventrículo cerebro posterior se levante un poco. </li><li> Pulse el interruptor de pie (Applied Scientific Instruments) y ver que el líquido se dispersan en el interior posterior del cerebro de los peces del ventrículo 27. Retirar la aguja de los peces y los peces se mueven a la siguiente. Repita el procedimiento hasta que se ha inyectado todo el pescado en el plato. Retire cualquier dead peces e inyectar reemplazos para mantener el número correcto (50 peces). Para cada grupo de 50 peces inyecta una aguja de microinyección nueva debe estar preparado, o C, el albicans se asienta en la parte inferior de la aguja y obstruye, o lanza de la concentración inyectada. </li><li> Lave el pescado fuera del plato se coloca la fuente y rociar agua sobre los huevos de los peces en un recipiente limpio plato extra profunda de Petri que contiene 60 ml de huevo y agua. Es importante no dejar el pescado en la agarosa durante más de 15-20 minutos o se sequen y mueran. </li><li> Repita todo el proceso de inyección hasta que termine. No te olvides de PBS y no patógenas controles inyectados. </li><li> Cuando haya terminado, mantener el pescado a 28 ° C. </li><li> Cierre la válvula del tanque de nitrógeno. Mueva el interruptor de la unidad de inyección de &quot;pulso&quot; a la &quot;continua&quot; para aliviar la presión en el conducto del tanque, la presión debe caer a cero en este punto. Cambiar la unidad de inyección de nuevo a &quot;pulso&quot;. Apague la unidad de inyección y limpiar el área de trabajo. </li></ol&gt; 4. Preparación del pescado de la Imagen Experimental duración: ** (30 minutos) Grado de dificultad: ** <ol><li> Preparar metano sulfonato tricaína solución como antes (200 mg / mL). ¡Fuera los peces infectados, y transferirlos a tricaína. </li><li> Preparar 47,9 ml 0,4% de agarosa de bajo punto de fusión (VWR Scientific) en el huevo y agua. Calentar la solución en el microondas. Enfriar a 37 ° C y añadir metano sulfonato tricaína (200 mg / mL) a la mezcla de </li><li> Una vez que los peces se inmovilizan en metano sulfonato tricaína, pescado pipeta individual en una placa de Petri (VWR Scientific) que contenía 0,4% de agarosa de baja fusión (VWR Scientific). </li><li> A continuación, desplace el pescado de agarosa de bajo masa fundida en pocillos individuales de una placa de fondo de cristal (MatTek Corporation) para la imagen. El uso tan poco agarosa de bajo fundido como sea posible para los peces descansa plana sobre la parte inferior de la cápsula. Sólo utilizar suficiente de la tricaína-agarosa para llenar el enner los círculos del plato con fondo de cristal. </li></ol> 5. Modificaciones relacionadas con Júpiter Protocolos Micropipetas para la microinyección Experimental Duración: * (10-15 minutos) Grado de dificultad: * <ol><li> Tire de las barras huecas de vidrio BF120-69-10 (Sutter Instruments) con un extractor de Flaming Brown Micropipeta Modelo P-97 (Sutter Instruments) de acuerdo con Yuan et al. 30. Elija el programa # 7 con el calor las condiciones siguientes = 470, Velocidad = 120, Tiempo = 200. La aguja resultante es de 8 mm de bisel a la punta y, una vez cortado a 3 mm por encima de la punta tiene un diámetro de aproximadamente 10 micras. </li><li> Cargar una micropipeta de vidrio en los soportes. Seleccione &quot;Pull&quot;. El filamento de calentamiento se calienta la aguja de acuerdo con los parámetros del programa y la varilla de vidrio se separan en dos micropipetas tirados. Micropipetas guardarla en una caja de almacenamiento de la pipeta (Sutter instrumentos). </li></ol> Recogida de embriones, inyección Morpholino y mantenimiento Experimental Duración: *** (1-2 horas) Grado de dificultad: *** <ol start="3"><li> Recoger embriones de acuerdo con los métodos de Rosen et al. 31. Use un colador de plástico (Mercancías de Knutsford) para recoger huevos de el tanque de desove (hábitats acuáticos). Sostenga el tamiz boca abajo sobre una placa de Petri de profundidad extra y enjuague con agua el tanque para recoger los huevos. </li><li> Para la preparación de morfolino, añadir 300 l de agua estéril a 300 nanomoles de morfolino (GeneTools, LLC). Esto da un stock de trabajo de 1,0 mM. </li><li> Comprobar la concentración de la morfolino mediante un Nanodrop (Thermo Scientific). Seleccione &quot;ácido nucleico y cambiar el tipo de muestra a&quot; otros &quot;y longitud de onda a 265. Introducir la constante multiplicando el peso molecular del morfolino por 1000 dividido por el absorptivitcoeficiente y que figuran en la hoja de propiedades morpholino oligo. </li><li> En blanco el NanoDrop con 2 l de HCl 0,1 N. Diluir 5 l de la solución morfolino en 95 l de HCl 0,1 N (20x dilución). Coloque 2 l de la dilución en el pedestal y la medida nanodrop clic. Multiplicar la concentración por el factor de dilución (20). Esto da una concentración de trabajo de morfolino. Para calcular la concentración milimolar dividir la concentración obtenida por el peso molecular del morfolino. </li><li> Preparar un stock de trabajo de morfolino en Danieau tampón (58 mM de NaCl, 0,7 mM de KCl, 0,4 mM de MgSO 4, 0,6 mM de Ca (NO 3) 2, 5,0 mM de HEPES, pH 7,6) y 0,01% de rojo fenol (VWR Scientific). </li><li> Para el trabajo de inyección morfolino seguir el protocolo de acuerdo con Rosen et al. 31 y Yuan y col. 30. Enjuague los platos con huevo morpholino de inyección de agua y caliente a 28 ° C durante 15 minutos. Elimine el agua de los platos de inyección y un line-up-cembriones ell etapa en las ranuras del plato de inyección (preparado a partir de la sección 1) con una pipeta de transferencia. Cada placa tiene capacidad para aproximadamente 250 huevos. Inyectar 1-2 embriones en estado de celulares con morfolino. Los huevos se mantendrán en la etapa uno de células durante 15 minutos 27. </li><li> Lavar los huevos inyectados con huevo de agua cuando haya terminado (de agua desionizada estéril con 60 mg / L de sales de Instant Ocean) y colocarlo en 60 ml de huevos de agua en los platos de Petri de profundidad. Platos Morpholino de inyección pueden ser reutilizados. Enjuague con agua de huevo cuando haya terminado y almacenar invertido a 4 ° C. </li><li> Para el almacenamiento de embriones Añadir 60 ml de agua de huevos al plato. Contar en 110 embriones con una pipeta de transferencia en una cápsula de Petri adicionales de profundidad con 60 ml de huevo y agua. Añadir 0,00003% de azul de metileno para prevenir el crecimiento microbiano y los embriones se incuban a 28 ° C. </li><li> Para acelerar el desarrollo de los embriones de mantener los platos de embriones a los 33 ° C durante 24 horas y la etapa de acuerdo a Kimmel et al. 27, que permite el desarrollo de los embriones a un punto críticotronco ángulo de 75 ° (25 Prim etapa 27). </li><li> Para el trabajo de la infección por larvas de mantener a los embriones a 28 ° C después de la inyección con C. albicans. </li><li> Cada día reemplazar a los platos de embriones con 60 ml de agua fresca de huevo. </li></ol> Imágenes Experimental Duración: ***** (1-5 horas) Grado de dificultad: *** <ol start="14"><li> Preparar los peces en agarosa de bajo derretimiento (de acuerdo con la sección 4.2) con tricaína en platos de cristal de imagen de fondo (MatTek Corporation) como se describió anteriormente. Coloque el plato en una Olympus IX-81 (Olympus) platina del microscopio invertido. Traiga a los peces en el foco bajo magnificación de 4x con contraste de interferencia diferencial (DIC) de luz. Las imágenes pueden capturarse a 20x 4x, y 40x en la DIC, TRITC (isotiocianato de tetrametil rodamina) y FITC (isotiocianato de fluoresceína) la configuración del filtro. </li><li> Utilice una Olympus IX-81 microscopio invertido con un FV-1000 barrido láser confocal de sistema de acuerdo con Ariga et al. 32. Llevar a cabo cursos de tiempo con un aumento de 40x mediante el establecimiento de Z-series con rodajas de 1-1,5 micras cada hora de la infección. </li><li> Para imágenes de larga evolución en el tiempo de 2 horas o más, coloque una capa de agarosa de baja fusión en la parte superior del pescado en el plato de imagen cada 2-3 horas. Esto evita que la agarosa de la desecación y trituración de los peces mientras se va a examinar. Para los cursos de tiempo prolongados con un pequeño número de peces, utilice una etapa calentada (Bioptechs Inc.) para mantener 28 ° C durante las infecciones. </li></ol> 6. Los resultados representativos Un ejemplo de un éxito rombencéfalo ventrículo C. albicans en una larva de pez cebra en 5 horas después de la infección-(HPI) y HPI 24 se muestra en (Figura 1). Como los macrófagos-células con envolvió C. albicans se ven en el ventrículo posterior del cerebro a las 5 hpi. Al 24 hpi, C. albicans se encuentra dentro de los macrófagos-célulass en el tejido dorsal de la cola indicativo de candidiasis diseminada. Este resultado infección es altamente dependiente de una inyección precisa de 10-15 levadura forma C. albicans en el ventrículo posterior del cerebro. Proyección de los peces infectados inmediatamente después de la inyección puede asegurar esto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4051/4051fig1.jpg" /> Figura 1 FLI1 transgénico:. EGFP 22, 33 larvas infectadas con CaF2-yCherry Candida albicans y la imagen intravitally por microscopía confocal. (CA) 5 horas después de la infección-(A) larva infectada con EGFP-expresión de los macrófagos-células en el sitio de la infección (rombencéfalo ventrículo) Barra de escala = 100 micras. (B y C) Las imágenes de mayor ampliación de los mismos peces, mostrando C. albicans, dentro de los fagocitos. Barra de escala = 100 m para B y 10 micras de C. (DF) 24 horas después de la infección (D) larva infectada con candidiasis diseminada con CaF2-yCherry C. albicans en el interior EGFP macrophage-como las células en el tejido dorsal de la cola. Barras de escala = 100 micras. (E y F) Las imágenes de mayor ampliación de los mismos peces, mostrando C. albicans en el tejido de la cola. Barras de escala = 100 micras.

No hay conflictos de interés declarado.

El método de la microinyección de pez cebra que aquí se presenta se diferencia de Gutzman et al. 34 en que aquí se demuestra la inyección a través de la vesícula ótica en el ventrículo posterior del cerebro de 36 a 48 larvas de HPF. El método que permite describir para inyección consistente de 10-15 levadura en el ventrículo rombencéfalo con daño tisular reducida. Este protocolo produce una infección local que inicialmente se extiende por todo el cuerpo en un 24 hpi (Figura 1)<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Los tanques de desove </td><td> Los hábitats acuáticos </td><td> 2L </td><td></td></tr><tr><td> 1,7 ml tubos </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-C </td><td></td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Fisher Scientific </td><td> S17957C </td><td></td></tr><tr><td> Adicionales de profundidad placas de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 a 757-11Z </td><td></td></tr><tr><td> Standard placas de Petri </td><td> VWR Scientific </td><td> 25384-302 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de transferencia </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Extracto de levadura </td><td> VWR ScientiFIC </td><td> 90000-726 </td><td></td></tr><tr><td> Peptona </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-264 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrosa </td><td> Fisher Scientific </td><td> D16-1 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-760 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro desechable </td><td> VWR Scientific </td><td> 82030-468 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-986 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Dumoxel Pinzas </td><td> VWR Scientific </td><td> 100501-806 </td><td></td></tr><tr><td> Clavijas de madera </td><td> VWR Scientific </td><td> 10805-018 </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR Scientific </td><td> 300053-964 </td><td></td></tr><tr><td> Bajo DerretirAgarosa </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-722 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa para los platos de inyección </td><td> VWR Scientific </td><td> 12002-102 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming Brown Micropipeta Extractor </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Varillas de vidrio huecas </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td> Para varillas de vidrio de cristal liso por calentamiento sobre mechero de Bunsen </td></tr><tr><td> Caja de almacenaje con una pipeta </td><td> Sutter Instruments </td><td> BX10 </td><td></td></tr><tr><td> MPPI-3 Sistema de inyección </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> MPPI-3 </td><td></td></tr><tr><td> Unidad de presión de retorno </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> BPU </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta kit de soporte para </td><td> Aplicacionesed Instrumentación Científica </td><td> MPIP </td><td></td></tr><tr><td> Interruptor de pie </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> FSW </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> MM33 </td><td></td></tr><tr><td> Base magnética </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> Base magnética </td><td></td></tr><tr><td> Tricaína metano sulfonato </td><td> Occidental Chemical Inc. </td><td> MS-222 </td><td></td></tr><tr><td> La disección de Alcance </td><td> Olimpo </td><td> SZ61 arriba SZX-ILLB2-100 de base </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Confocal </td><td> Olimpo </td><td> IX-81 con FV-1000 Sistema láser confocal de barrido </td><td></td></tr><tr><td> TC-7 Cultivo de Tejidos de rodillos de tambor de la rueda con 14 pulgadas de tubo de ensayo </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> TC-7 </td><td></td></tr><tr><td> Platos de imagen </td><td> MatTek Corporación </td><td> P24G-1.0-10-F </td><td></td></tr><tr><td> Puntas de pipeta para la carga de agujas </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de vertido redes </td><td> De adaptación de la ciencia Herramientas </td><td> TU-1 </td><td></td></tr><tr><td> Etapa climatizada </td><td> Bioptechs Inc. </td><td> Delta T-5 </td><td></td></tr><tr><td> Espátula plana </td><td> VWR Scientific </td><td> 82027-486 </td><td></td></tr><tr><td> Los tamices de plástico </td><td> Mercancías de Knutsford en línea </td><td> 12 cm </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR Scientific </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td> VWR Scientific </td><td> 14216-184 </td><td></td></tr><tr><td> 16 x 150 mm tubos de Cultura </td><td> VWR Scientific </td><td> 60825-435 </td><td></td></tr><tr><td> Nanodrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Rojo fenol </td><td> VWR Scientific </td><td> 97062-478 </td><td></td></tr><tr><td> De HCl </td><td> VWR Scientific </td><td> 87003-216 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4534-500GP </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4532-500GP </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0246-500GP </td><td></td></tr><tr><td> Ca (NO 3) 2 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0226-500GP </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4520-500GP </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Morpholinos </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive imaging of disseminated candidiasis in zebrafish larvae

La candidiasis diseminada causada por el patógeno Candida albicans es un problema clínicamente importante en individuos hospitalizados y se asocia con una mortalidad de 30 a 40% atribuible 6. La candidiasis sistémica es normalmente controlada por la inmunidad innata, y las personas con defectos genéticos en los componentes de células inmunes innatas como la NADPH oxidasa fagocítica son más susceptibles a la candidemia 7-9. Muy poco se sabe sobre la dinámica de la C. la interacción albicans con las células inmunes in vivo. extensa en estudios in vitro han demostrado que fuera del huésped C. albicans, germina en el interior de los macrófagos, y es rápidamente destruido por los neutrófilos 10-14. Los estudios in vitro, aunque útil, no se puede resumir el complejo en un entorno vivo, que incluye el tiempo que dependen de la dinámica de los niveles de citoquinas, archivos adjuntos de la matriz extracelular, y los contactos intercelulares 10, 15-18 </sup&gt;. Para investigar la contribución de estos factores en la interacción huésped-patógeno, es fundamental para encontrar un organismo modelo para visualizar estos aspectos de la infección de forma no invasiva en un huésped vivo intacta. La larva de pez cebra ofrece un hospedador vertebrado único y versátil para el estudio de la infección. Durante los primeros 30 días de desarrollo de larvas de pez cebra sólo tienen defensas inmunológicas innatas 2, 19-21, lo que simplifica el estudio de enfermedades como la candidiasis diseminada que son altamente dependientes de la inmunidad innata. El pequeño tamaño y la transparencia de las larvas de pez cebra permitirá imagen de la dinámica de la infección a nivel celular, tanto para hospedante y el patógeno. Larvas transgénico con fluorescencia células inmunes puede utilizarse para identificar los tipos de células específicos implicados en la infección 22-24. Modificados oligonucleótidos antisentido (Morpholinos) se puede utilizar para derribar varios componentes inmunes como la NADPH oxidasa fagocítica y estudiar los cambios en respuesta a fungal infección 5. Además de las ventajas prácticas y éticas de la utilización de un pequeño vertebrado inferior, las larvas de pez cebra ofrece la posibilidad única de la imagen de la batalla campal entre patógeno y huésped tanto intravitally y en color. El pez cebra se ha utilizado para la infección de modelo para una serie de bacterias patógenas humanas, y ha sido instrumental en importantes avances en nuestra comprensión de la infección por micobacterias 3, 25. Sin embargo, sólo recientemente han patógenos mucho más grandes tales como hongos han utilizado para infectar larva 5, 23, 26, y hasta la fecha no ha habido una descripción visual detallada de la metodología de la infección. Aquí les presentamos nuestras técnicas de microinyección cerebro posterior del ventrículo de Prim 25 el pez cebra, incluyendo nuestras modificaciones de los protocolos anteriores. Nuestros resultados con el modelo de larvas de pez cebra para la infección por hongos difieren de los estudios in vitro y refuerzan la necesidad de examinar la intera huésped-patógenocción en el complejo entorno de la máquina en lugar del sistema simplificado de la placa de Petri 5.

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Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la infección<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Aquí nos demuestran técnicas para infectar larvas de pez cebra con el hongo patógeno<em&gt; Candida albicans</em&gt; Por microinyección, la metodología usada recientemente para implicar a la actividad de los fagocitos de la NADPH oxidasa en el control del dimorfismo de hongos<sup&gt; 5</sup&gt;.

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

non-invasive-imaging-of-disseminated-candidiasis-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.6K vistas.  University of Maine. El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la infección 1-4. Aquí nos demuestran técnicas para infectar larvas de pez cebra con el hongo patógeno Candida albicans Por microinyección, la metodología usada recientemente para implicar a la actividad de los fagocitos de la NADPH oxidasa en el control del dimorfismo de hongos 5

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Investigación

Inmunología e Infección

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Modelo no invasiva de neuropatogénico<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La infección en Neonatología Rata

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

La timectomía completo en ratas adultas con no invasiva La intubación endotraqueal

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

No invasiva<em&gt; En Vivo</emHome Idiomas Ingresar a Epistemonikos Búsqueda avanzada Fluorescencia de imágenes ópticas de la actividad MMP inflamatoria utilizando un agente de imagen fluorescente activable

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Una forma no invasiva de aislar y células fenotípicas de la conjuntiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...