Los trastornos relacionados con el EPR siguen siendo una parte importante de la mezcla de enfermedades, pero sin restos efectivos en el cultivo virtual de células primarias del EPR que sirvan como un buen modelo para los estudios fisiológicos y patológicos de los trastornos relacionados con el EPR. En este protocolo, proporcionamos un protocolo fácil de seguir para cultivar IPC primarias, que podría restaurar y mantener rápidamente las características posteriores de RP, creemos que mediante el uso de este método las personas podrían generar rápidamente células RP a partir de estudios de macistán y las pruebas de detección de medicamentos protectores que podrían facilitar el desarrollo de nuevos tratamientos para los trastornos de EPR. Una demostración paso a paso del valor hará que este método sea mucho más fácil de replicar en diferentes laboratorios que desean estudiar células RP.
Para comenzar a descongelar la enzima de digestión tisular malaquad y esterilizar 1X PBS. Se complementa con 2% de penicilina y 2% de estreptomicina filtrando la solución a través de una unidad de filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Lave los pocillos de la placa de cultivo y los insertos de transwell con 1X PBS.
Retire el PBS de los pocillos y transwell con una pipeta y agregue un mililitro de PBS fresco 1X a la cámara inferior y 600 microlitros de 10 microgramos por mililitro de solución de laminina a la cámara superior. Incubar las placas y los insertos de transpozo en esta incubadora de helicicultura durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de eso, retire la solución laminada de la cámara superior y lave con un mililitro de PBS frío 1X dos veces antes de colocar la celda Limpie la campana de flujo laminado con 75% de etanol y luz UV.
Prepare tres tubos de centrífuga estériles de 50 mililitros que contengan alrededor de 25 mililitros de etanol al 75%, tres tubos centrífugos estériles de 50 mililitros que contengan alrededor de 25 mililitros de PBS 1X y tres placas de cultivo celular estéril de 10 centímetros que contengan alrededor de 15 mililitros de PBS 1X. Remoje cuatro globos oculares porcinos en aproximadamente 15 mililitros de etanol al 75% en una placa de Petri de 10 centímetros y use un par de tijeras y fórceps para cortar todos los tejidos conectivos y músculos residuales. Para descontaminar los globos oculares, remoje y lave cuatro globos oculares en tres tubos centrífugos estériles de 50 mililitros llenos secuencialmente con etanol al 75%.
Luego lave los globos oculares en tres tubos centrífugos estériles de 50 mililitros llenos con 1X PBS secuencialmente. Invierta los tubos cada minuto para lavar bien los globos oculares. Mueva los cuatro globos oculares a una placa de cultivo celular estéril de 10 centímetros que contenga 1X PBS.
Recorte la superficie externa de cada globo ocular nuevamente, para eliminar el nervio óptico y los pequeños residuos. Use tijeras para hacer un pequeño corte en la intersección del limbo y la esclerótica. Y luego extirpar la córnea, el iris, el cristalino, el cuerpo vítreo y la retina neural.
Transfiera el complejo de esclerótica coroidea del EPR a un nuevo plato de cultivo celular de 10 centímetros y haga cuatro cortes para aplanar la copa ocular en forma de trébol de cuatro hojas. Realice viajes en la digestión de la solución de EDTA colocando los cuatro complejos de esclerótica coroidea RPE en un nuevo plato de 10 centímetros y vertiendo 20 mililitros de solución fresca de tripsina EDTA para fusionar los complejos de esclerótica coroidea RPE. Coloque el plato en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante casi 30 minutos.
Después de 30 minutos, saque el plato de la incubadora y agregue 20 mililitros de medios de cultivo celular precalentados con 10% FBS al plato. Para neutralizar los disparos en la solución de EDTA, utilice una pipeta de transferencia de cinco mililitros para disociar las células del EPR pipeteando suavemente varias veces. Recoja las suspensiones celulares en tubos de centrífuga de 15 mililitros y luego pipete suavemente otros 10 mililitros de medios de cultivo frescos con FBS para lavar los complejos de esclerótica de la coroides RPE en el plato.
Recoger las células RPE centrifugando los tubos a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el SuperAgent con una pipeta y añadir otros cinco mililitros de medios de cultivo con FBS para volver a suspender las células. Centrifugar a 300 G durante otros cinco minutos.
Decantar el SuperAgent y volver a suspender las células con 12 mililitros de medios de cultivo. Siguiente semilla 100, 000 a 200, 000 células por pocillo en 12 placas de cultivo de pozos o insertos de pozo. Cambie los medios de cultivo cada dos días y reduzca la concentración sérica al 1% cuando las células cubran completamente la superficie de los pocillos por inserto.
Cambie los medios de cultivo cada dos días hasta que se recolecten las células. Aquí se muestran las imágenes representativas de las células primarias del EPR porcino en el día dos, el día seis y el día 10. El análisis QRTPCR de los niveles de ARNm de genes de firma en células primarias de EPR porcino, células de EPR humanas primarias, células ARPE 19 y tejido coroideo de EPR porcino se detecta mediante esta imagen gráfica.
Aquí se utilizó GAP DH como el gen de limpieza para RTPCR. Se utilizaron cuatro réplicas biológicas para las células primarias del EPR porcino y un EPR 19, donde se utilizaron tres réplicas biológicas para las células del EPR humano primario y el tejido coroideo del EPR porcino. Los niveles de expresión génica en las células ARPE 19 se establecieron como controles.
El análisis de sangre occidental de las proteínas RPE 65 en ARPE 19 y células RPE porcinas y en células RPE humanas primarias y tejidos coroides de RPE porcino se muestran en esta figura. Vinculin se utilizó aquí como un control de carga. Esta figura muestra un cultivo de dos semanas de células RPE porcinas en medios DMEM Basic con 1% FBS.
Las células cultivadas con o sin Lamin se tiñeron con RPE 65, APTA de sodio y potasio, Z01 y Hex. Las mediciones de TR en láminas celulares, cultivadas con o sin laminina se representan en esta figura. El análisis de sangre occidental del factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF y el factor derivado del epitelio pigmentario o PEDF en células primarias de EPR porcino y ARPE 19 se muestran en esta figura.
En estas imágenes se presentan las funciones sectoriales del EPR porcino primario cultivado y las células ARPE 19. La gran parte de este protocolo es disolver las células RP de los complejos gliales de renudo del EPR. Recomendamos usar viajes frescos y solución cada vez y controlar adecuadamente el tiempo de digestión, para disolver ocho células RP.
