Las dos técnicas de peeling demostradas aquí aíslan compartimentos subcelulares de varillas individuales, y pueden ayudar a revelar los importantes procesos fisiológicos que ocurren en cada compartimento especializado en bastones sanos y enfermos. Aislar diferentes compartimentos de células de bastón de la retina del ratón puede ser un desafío. Estas técnicas simples utilizan materiales de laboratorio baratos y comunes para aislar de manera confiable los compartimentos subcelulares de varillas para el análisis de proteínas.
Para comenzar, coloque un trozo de papel de filtro en una placa de Petri llena de tampón Ames HEPES burbujeado con 100% de oxígeno. Luego, usando una pipeta de transferencia de diámetro ancho, transfiera un rectángulo retiniano diseccionado de un ratón C57 Black 6J de dos a tres meses de edad. Oriente la retina dividida cóncava hacia arriba y asegúrese de que los fotorreceptores estén mirando hacia abajo hacia el fondo del plato.
Luego, usando pinzas, agarre ligeramente los lados de la retina cortada a la mitad y muévala sobre el papel de filtro. Una vez que la retina esté centrada, mueva el papel de filtro hacia arriba para que la retina cortada a la mitad toque el papel de filtro para crear un segmento exterior de varilla, o ROS para filtrar la adhesión del papel. Levante con cuidado el papel de filtro con la retina adjunta fuera del tampón Ames HEPES.
Coloque la parte inferior del papel de filtro sobre una toalla de papel y aplique dos o tres veces para que se seque. Agregue una gota de Ames HEPES en el costado del papel de filtro con la retina y coloque el papel de filtro sobre la toalla de papel nuevamente para que se seque. A continuación, coloque el papel de filtro con la retina de nuevo en la placa de Petri, y con pinzas, empuje suavemente todos los bordes de la retina cortada a la mitad hacia arriba y lejos del papel de filtro en todos los lados.
Pelar delicadamente la retina lejos del papel de filtro, tocando solo el perímetro extremo de la retina para preservar su integridad estructural. Luego, levante el papel de filtro de la placa de Petri y retire el exceso de líquido en una toalla de papel, asegurándose de que el lado en contacto con la retina no entre en contacto con la toalla de papel. Coloque el papel de filtro con la capa parcial de ROS en un tubo etiquetado sobre hielo y mantenga la retina pelada sumergida en el tampón AMES HEPES.
Repita el proceso de peeling para esta retina cortada a la mitad aproximadamente de siete a ocho veces para eliminar toda la capa de ROS. Después de cada peeling, coloque el papel de filtro en el mismo tubo para combinar todas las ROS aisladas de una retina cortada a la mitad. Mantenga el tubo que contiene todas las cáscaras de papel de filtro de la ROS aislada en hielo para su uso inmediato.
Con pinzas, transfiera la retina pelada sobrante a un tubo debidamente marcado y mantenga el tubo en hielo para su uso inmediato. Para preparar la muestra de retina para la liofilización, coloque un trozo de papel de filtro y transfiera una retina cortada a la mitad a una placa de Petri llena de tampón frío de Ringer. A continuación, con pinzas, voltee con cuidado la retina para que esté orientada cóncava hacia arriba y muévala para que descanse sobre el papel de filtro.
Levante el papel de filtro por los bordes hacia arriba para que el trozo de retina cortado a la mitad toque el papel de filtro. Continúe levantando el papel de filtro de la solución de Ringer. Luego, coloque la parte inferior del papel de filtro sobre una toalla de papel y aplique cuidadosamente dos o tres veces para eliminar el exceso de líquido.
A continuación, tome el papel de filtro con pinzas y agregue una gota de Ringer frío en el costado del papel de filtro con la retina. Nuevamente, coloque el papel de filtro sobre la toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Guarde cada muestra de retina adherida y papel de filtro en una placa de Petri llena de Ringer frío hasta que esté lista para congelar todas las muestras.
Luego, usando pinzas, levante cada muestra del búfer frío de Ringer, asegurándose de que las pinzas entren en contacto solo con los bordes del papel de filtro, evitando la retina cortada a la mitad. Coloque la parte inferior de cada papel de filtro sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Luego, agregue una gota de PBS frío en el lado del papel de filtro donde se adhiere la retina y aplique el papel de filtro en la toalla de papel nuevamente.
Coloque todos los trozos de papel de filtro en la placa de Petri y, con papel de seda sin pelusa, elimine el exceso de líquido que rodea el papel de filtro. Luego, envuelva firmemente todo el plato con papel de aluminio y asegúrese de que los bordes del papel de aluminio estén asegurados y presionados suavemente en la parte inferior de la placa de Petri. Perfore un puñado de agujeros de 0.1 a 0.2 milímetros en la tapa de papel de aluminio.
A continuación, utilizando pinzas de metal, baje gradualmente la placa de Petri cubierta de papel de aluminio en nitrógeno líquido. Mantenga las muestras en nitrógeno líquido hasta que estén listas para liofilizar. Para la liofilización, coloque la placa de Petri cubierta de papel de aluminio en un matraz de liofilización y conéctela a la máquina liofilizadora siguiendo el protocolo del fabricante.
Liofilizar las retinas durante 30 minutos. Después de la liofilización, recoja el segmento externo e interno de la varilla colocando cuidadosamente un pequeño trozo de cinta adhesiva sobre la retina liofilizada y aplicando una ligera presión con las pinzas para asegurarse de que se adhiera a la capa fotorreceptora. Despegue lentamente la cinta y asegúrese de que tanto el ROS como el RIS se hayan adherido a la cinta.
Una película delgada y blanca estará presente en la superficie fracturada. Este es el RIS. Para separar este RIS, coloque otro trozo de cinta y empuje la cinta hacia abajo sobre la superficie fracturada.
Luego, coloque el trozo de cinta con solo la capa naranja-rosa en un tubo de microcentrífuga etiquetado como ROS, y trozos de cinta con la capa delgada y blanca en otro tubo etiquetado como RIS. A continuación, con cinta adhesiva, recoja el tejido retiniano restante ubicado en el papel de filtro despegando la gruesa capa blanca. Luego, coloque este aislado en un tubo etiquetado como OIS.
Si se usa el mismo día, guarde las capas aisladas de la retina liofilizada a temperatura ambiente. En animales adaptados a la oscuridad, la distribución de GNAT1 y ARR1 coincidió estrechamente con sus distribuciones conocidas de estado oscuro, donde la señal GNAT1 fue visiblemente más fuerte en el aislamiento ROS, y la señal ARR1 fue más robusta en el aislamiento ROS. La cuantificación de las señales GNAT1 y ARR1 mostró diferencias significativas entre las condiciones de luz oscura para GNAT1 y ARR1 en muestras ros y ROS.
Tanto en muestras oscuras como adaptadas a la luz, las señales de G beat 5S, citocromo C y actina se excluyen de las muestras ros, lo que demuestra una ausencia de contaminación de otras capas celulares. Además, la señal G beta 5L fue claramente visible en las muestras de ROS. La microscopía electrónica de barrido de las superficies de las retinas liofilizadas intactas y peladas mostró que, antes de pelarse con cinta adhesiva, la superficie de la retina liofilizada intacta coincidía estrechamente con la ROS cilíndrica característica.
Después de la exfoliación inicial de la cinta, el ROS y el RIS parecieron eliminarse por completo, como lo demuestra la capa nuclear uniforme presente en la superficie de la retina sobrante, pelada y liofilizada. Los peelings de cinta posteriores eliminaron el RIS de la superficie libre de la capa pelada. Esta técnica también demostró que la inmunorreactividad GRK1 fue más intensa en muestras de ROS en retinas expuestas a la luz, y ausente en muestras de OIS.
Por el contrario, las muestras de ROS y RIS mostraron una señal débil para PKC alfa, que comúnmente no se detecta en ROS o RIS por tinción de inmunofluorescencia. Finalmente, el peeling de cinta subóptimo podría producir muestras ligeramente contaminadas. La muestra de RIS estaba contaminada con alguna muestra de OIS, produciendo bandas G beta 5L y G beta 5S, y una señal alfa PKC más alta.
Se debe tener cuidado al liofilizar la retina. Si se utiliza una técnica de liofilización inadecuada, la retina puede derretirse, lo que hace imposible aislar diferentes capas subcelulares de bastones con cinta. El uso de este método de peeling en cinta junto con qRT-PCR ha permitido la separación de las transcripciones de los fotorreceptores del resto de la retina.
