Name: the swimmeret system of crayfish: a practical guide for the dissection of the nerve cord and extracellular recordings of the motor pattern
Uploaded: 2014-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern at JoVE.com

私たちは、図のいくつかと助けるためヨスBurgertに感謝。私たちは、インゴSelbach（とグループ「Edelkrebsprojekt NRW」）は、実験動物と実験室を供給するために彼の努力のために感謝しています。私たちは、原稿の最初のバージョンの校正のためのアンナC.シュナイダーに感謝。この研究は、エミー·ネーターDFGグラントSM 206 / 3-1と女性教員のためのケルン大学のスタートアップ助成金によってサポートされていました。

この解剖手順は、欧州共同体理事会22の指令ND 2010年9月（63分の2010 / EU）に従っている。 1.準備<ol><li>サイズは≥8センチ両性のザリガニ、Pacifastacusのleniusculus（ダナ）を得る。動物が不可欠であり、腹部、腹部、四肢に異常がないことを確認してください。 </li><li>甲羅を検査し、このキューティクルが硬いと剛性であることに注意してください。前およびpostmolt動物は柔らかい甲羅を持っており、なぜなら、多くのパラメータが変更さ脱皮処理中に実験用に適していない（ 例えば、自発運動の減少）。 </li><li> 図2に示されているし、提供サプリメントに記載されている、解剖時に使用されるすべてのツールと資料を揃えピン止めし、神経索のdesheathing。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" /> 図2： <s·チョン&gt;材料と解剖のために使用されるツール、ピン止めと神経索のdesheathing。 （1）氷で満たされた大きなバケツを。 （2）ザリガニの生理食塩水; （3）生理食塩水ディスペンサー。 （4）解剖顕微鏡。 （5）解剖ディッシュ。 （6）強いはさみ。 （7）鉗子（8）春のはさみ。 （9）ペトリ皿をクリアシルガードと並ぶ。 （10）固定ピン。 （11）冷ランプ光源。 2.グロス解剖<ol><li> 20分 - 15氷上で動物を麻酔。それは放血工程を含む、試料が処置中にザリガニの生理食塩水を定期的にすすがれる必要があるので、シンクの近くラボベンチ総解剖の最初の部分を実行する。 </li><li>動物腹側を上に持ち、胸部（ 図3-1）の近くに彼らの拠点で両方の爪をカットする強力なハサミを使用しています。左右の腹肢（ 図3-2）を外します。 </li><li>黒シルガードが並んで解剖皿に動物腹側を上に置きます。 Eleva下に氷を挿入し、尾節（ 図4A）で腹部をピンによってTE頭胸部。 </li><li> 〜60ミリリットルチルドザリガニ生理食塩水生理食塩水ディスペンサーを埋める。爪開口部（ 図4B）を介して冷生理食塩水でザリガニを灌流。過剰食塩水はuropodsでカットを通じてオフ排出されます。失血中に氷でザリガニをカバー</li><li>ただ強いはさみ（ 図5（a））を用いて動物の目に後方単一横カットで動物を首を切る。 図5Bに示されるように、ベースジョイントの近くにある全てのウォーキング脚を外します。 </li><li>頭胸部の残りの部分から最後の胸部セグメントと腹部を分離します。第二歩行脚の開口部にハサミの先端を挿入し、反対側に切断することにより、第二歩行の脚のレベル（胸部セグメント3）での最初のカットを行います。 （ 図6A-1）。 </li><li> Tを通じて両側に、この最初のカットを拡張彼は（ 図6A-2）を頭胸部。 </li><li>内臓の一部が見えるようにするために開いている動物を裏返し。試料の前の部分に目立つ消化腺（ 図6B-3）を押して、腹腔から生殖器官を削除する鉗子を使用しています。 </li><li>頭胸部（ 図6C）の前方部分を削除します。残りの胸部（ 図6D-4）の両側に、鰓をカバー甲の横の部分を除去するために横方向のカットを使用してください。鰓を削除し、冷生理食塩水で試料をすすぐ。 </li><li> 図6E-5に示すように胸骨プレートの全長を通じてカットと解剖を続行します。側板とswimmerets間の最大横方向の位置（ 図6E赤のマーク）でこのカットを行います。同じカットと反対側に進みます。冷生理食塩水で試料をすすぐ。 </li><li> dissectioの下で残りの解剖を行ってくださいn個の顕微鏡。黒シルガードが並んで、それは、検体を覆うようにザリガニの生理食塩水で満たされた解剖皿にザリガニの腹部腹側を上に置きます。 注：以下のステップ（2.12から4.8）は、右利きの実験者には適用され、方向指示が含まれています。次の手順（2.12から6.8）、それは健全な神経系を維持するために、冷生理食塩水で、定期的にすべての20〜30分のザリガニの生理食塩水を交換することが重要である。 </li><li>尾節で後方に虫ピンで試料を修正し、前方に甲の遺跡で。左にテルソンポイントと、テーブルの縁に平行になるように試料を置きます。 </li><li>歩行脚開口部（ 図7A）を介して取得し、（ 図7B白矢印）オープン標本を引っ張って左手に粗い鉗子を使用してください。大型2背屈筋ストランド（ 図7B-1、C-1）を特定し、彼らの腹側をカット図7Bに示すように、基礎。 </li><li> 4 番目の胸部セグメントで、腹側に背側（心臓）から下降胸骨動脈（ 図7C-2）を 、特定します。それは腹動脈形成、神経索の下に突出する前に、この動脈は、右の神経索（ 図7C-3）の上にある。 </li><li>胸骨動脈を横断する。 図7Cに示すように、はさみの1のブレードを使用して、最初の動脈を持ち上げ、腹側に位置する神経索が表示されている場合にのみカット。 </li><li> （右側に）前方に背屈筋を修正。彼らはビジョンをブロックしませんので、これがピンと最大伸ばした位置で行う必要があり、試料を延伸されたままになります。背部の筋肉ストランドは固定されている場合（ 図8-1）、最初の腹部神経節、関連する神経N1、N2、及びN3でA1、A2は、（ 図8）表示されます。 </li><li>スペックをつかむために左手に鉗子を使用してください歩行脚の一方の開口部に試料ク。以下の解剖を通しての手順はオープン標本を維持するために慎重に引き抜いてください。 </li><li>神経索から最も離れた位置に神経N3を横断する。 （ 図8-3）。 </li><li> 図8-4に示すように、腹内突起に近い屈筋をカット。神経索または神経N2を損傷しないように注意してください。 </li><li> A5にステップ2.18と神経N3のための2.19、残りの腹部神経節A2の屈筋を繰り返します。 </li><li>最後の腹部神経節では、A6は、腹内突起から背屈筋をカットし、 図9に示すように、試料が見えるはずです。 </li><li> A6（ 図9-1）の神経に胸骨のプレート後部をカットし、腹側部分（ 図9-2）を保つ。屈筋（ 図9-3）と背の部分を破棄します。歩行脚の開口部を介してピンと前方に胸骨のプレートを修正し、と後方A6へ。 </li></ol> 3.ファイン解剖<ol><li>離れる方向前方部分とテーブル「縁部に向かって後部に顕微鏡下で試料を置きます。 </li><li> cephalothoracic胸骨の最も前方部分を削除するには、図10（a）に示すように鉗子を使用してください。 注：胸部神経節と関連する神経は、部分的に脚の筋肉組織とcephalothoracic胸骨で覆われている。 cephalothoracic胸骨は、互いに腹側神経索が常駐している内側の空洞から歩いて足の横方向に位置して空洞を分離骨格を形成。 </li><li> 図10B -1とB2に示すように、残りの外骨格構造の間の筋肉をカットします。腹側神経索（ 図10C）の前端をつかみ、持ち上げるために鉗子を使用してください。 注：神経索は、プロセス中に破損されますので、NERVを拾っ避ける電子コードが複数回。 </li><li>神経索（図10C-3）を持ち上げながら横方向に胸部神経をカット。ピン止めのために適当な長さでこれらの神経してください。 T4（ 図10C-4）の全ての組織前部を離れて切断することにより、ピンセットで取り上げられた神経節のチェーン、の絞った部分を削除します。 </li><li>左の前方部分に試料を置き、A1に焦点を当てる。それらをピン止めするための適切な長さ（最大1センチ）で、A1のN1、N2の神経をカット。 </li><li> A2に焦点を当て、神経N1、N2、このセグメントのN3（ 図11）を特定。腹部神経節A2-A5の神経N1は、各セグメント（ 図11A-1）に2胸骨クチクラinfoldingsの間に存在し、筋肉組織で覆われている。後部胸骨クチクラ陥入に沿って1カットを行います。腹部の横方向の縁に起動し、 図11（a）に示すように正中線に向かって進んでください。 </li><li>ターゲットN1はまだ入り江である場合図11B（赤い矢印）に示すように、組織と赤、筋肉の束を横断するが、両方の胸骨クチクラinfoldingsと神経N1（ 図11B-2）にこの時間前部。 </li><li>遠位に可能な限り（ 図11C-3）などの神経N1をカット。 （ 図11C）神経N1が完全に表示され、前方および後方の枝を特定することができる。 </li><li>神経節（ 図11D）の近くに、内側から始めて、反対側の神経N1に進み、最初の後部胸骨クチクラ陥入に沿って筋肉をカット。神経がまだ組織で覆われている場合は、筋肉の束を横断しますが、今回の前方胸骨クチクラinfoldingsと神経N1の両方には、同じような11B-2図 。として遠位に可能な限りの神経N1をカット。 </li><li>適当な長さ（約0.5 cm）のピン止めのために、この神経節の神経N2をカット。 </li><li>繰り返しますA3-A5の神経のための3.7から3.11繰り返します。 </li><li> NERをカット遠位側（ 図12A）はできるだけ神経節A6のVES。この神経節を持ち上げ、胸骨のプレートから神経節の連鎖を隔離開始するA6の複数の神経をつかむために鉗子を使用してください。 </li><li>神経索を持ち上げながら、図12B（白矢印）で示したように、前方方向にそっと引き出します。個々の神経節が解除されると、神経索（ 図12C）の腹側に取り付けることができる腹動脈を削除します。神経索が完全に分離されるまで、この（優しく）、プルカットシーケンスを続行します。 </li><li>明確なシルガードが並ぶとザリガニの生理食塩水（ 図12D）で満たされたペトリ皿に神経節の孤立チェーンを転送します。 </li></ol> 4.ペトリ皿に神経索をピン留め注：神経索ピンに（サプリメントを参照）ステンレス鋼線からカット小さなピンを使用してください。鉗子で終わるだけ神経をタッチしないSQUEEZ接続詞や神経節をメール。 <ol><li>穏やかなストレッチをかけながら、直線での神経節のチェーンをピン。 </li><li>上向きに背側とのペトリ皿に神経索（ 図13、黒線）を配置します。神経節の腹側が凸によって同定することができる。背側は平坦である。両側に胸部神経をピン。その縦軸に沿って神経索を伸ばし、A6の神経を続行します。 </li><li>神経索に対して90°の角度でA1の神経をピン。 </li><li> A2に進み、神経索（ 図1A）に35〜45°の角度で神経N2をピン。 </li><li> 図14に示されているようにピン止めする前に彼らの前方および後方の枝の神経N1を分離する。鉗子の1組の前方で、神経N1の他の後枝を拾うために細かい鉗子の二組を使用してください。唯一の最も遠位端部を選ぶように注意してください神経枝のS。今、慎重にそれらを離れて引っ張る。 </li><li>神経索（ 図1A）に対して90°の角度で神経N1の前方の分岐をピン。前方N1枝と神経N2との間に神経N1の後枝をピン。 </li><li>神経節A3〜A5の神経のためのステップ4.4から4.6を繰​​り返します。縦方向における神経索ストレッチそれだけでなく、横断方向を固定している。 </li></ol> 5.神経節Desheathing <ol><li>実験者の手が常に揺れを避けるために、安定した平面上に休んでいるように準備を置きます。神経節をdesheathするために、以下の神経索を照らす。 </li><li> A5への腹部神経節A1に焦点を当てる。神経節シースを通して、後部神経節に、N2の神経とN3（ 図15A赤い矢印）との間に小さな横カットを作るために細かい春のはさみを使用してください。 </li><li>非常にFを用いて神経鞘をピックアップナイン鉗子および図15A-1に示されるように、接続詞上記シースを横切って横方向に切断。はさみで神経索を絞るか、カットしないように注意してください。 </li><li>それでもピンセットで神経鞘を保持して持ち上げると、神経節の横方向の境界線（ 図15B-2および-3）に沿ってそれをカットし続ける。シースを除去します。代替的に、固定されているが、神経索が圧迫されないように、接続詞の両側にピン。 </li><li>繰り返しますA5にすべての腹部神経節A1のための5.2から5.4を繰り返します。 </li><li>胸部神経節と同様に神経節A6をDesheathe。神経節にA6開始前方にdesheatheと後部の方向に進行するために。神経節のチェーンの後端にA6の神経節シースをピン。 </li></ol>運動ニューロンから6細胞外記録<ol><li>私を示す細胞外記録のために使用されるすべてのツールや材料を組み立てN 図16Bやサプリメントに記載されている。録画設定の概要を図16Aに示されている。アンプは記録前に、少なくとも30分間のウォームアップができるように、この実験（ 図16C）で使用されるすべての電子機器を起動します。コンピュータの電源を入れ、録音ソフトウェアを起動。 </li><li>顕微鏡テーブルの上に神経節のチェーンを配置し、下側から照らす。神経節（ 図17AおよびB）への標的神経と近くの位置での参照電極に近いが、横方向のシルガードに記録電極を挿入します。ベンド記録電極（ 図17C）の周りの標的神経。 </li><li>電極と神経の間の接触を確実にし、サイド（のF igure 17D）にそれをピンに、少し神経をストレッチ。粘土を用いて顕微鏡テーブルに電極ケーブルを固定し、そのようにそれらが所望の位置に留まる。 </li><li>使用してください注射器は、入浴液から標的神経を分離するためにワセリン（丸い先端を持つ）20ゲージの針（ 図17E-3）を充填した。最初の記録電極の周りのシルガードにいくつかのワセリンを軽くたたく。その結果、記録電極（ 図17E-4）の近傍にシルガードをカバーワセリンの層である。直接この層に気泡を神経に軽くして回避しないように注意してください。 </li><li>生理食塩水（ 図17F）の表面レベルまでのすべての側面からワセリンと記録電極を封止する。 </li><li>その活性が監視する必要があるすべてのターゲットの神経のために、この手順を繰り返します。 </li><li>記録を開始。連続またはギャップ無料の取得モードと5 kHzのサンプリングレートを使用してください。次のパラメータに細胞外アンプを設定します。 1000ゲイン（取得ソフトウェアの設定で、この増幅パラメータを含めるように注意して、信号を千回を増幅）AN2000ヘルツ（ハイカット）に300ヘルツ（ローカット）のダ·バンドパスフィルタの範囲。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

<html>ザリガニの解剖学とその腹部神経節を前に5、18、19、20に記載されている、それは重要な神経の切断を回避するために、解剖前にそれらに慣れることをお勧めします。 それは、単離された神経索の劣化を防止するために、23℃未満の温度で調製しておくことが重要である。これは、すべての20-30分を冷ザリガニ生理食塩水を浴溶液で置換することによって容易?...

ザリガニのswimmerets姿勢制御に機能を果たすと動物が前方に泳ぐときリズミカルに打つ、彼らの巣穴やメスが卵5、6の通気換気。シグナルザリガニのswimmerets、Pacifastacusのleniusculusは 、1/5に第二のペアで起こる腹部7の両側に1つずつ手足と腹部のセグメント、。中枢神経系は、無傷動物ならびに単離された神経索の調製においてswimmeret運動を駆動する独自のリズミカルな運動パターに生成する。全く感覚フィードバックまたは降順入力が存在しない場合に生成リズミカルな運動パターンは、仮想移動1、2と呼ばれている。swimmeretシステムでは、この運動パターンが無傷動物で測定されたswimmeretsの活動からの任意のパラメータが異なっていません。 各swimmeretの移動はに位置し、1℃に制限されているマイクロ回路によって駆動され、hemiganglion 1 orresponding - 。3に各マイクロ回路では5同定された非スパイクニューロンを含み、カーネルを生成するパターンがあります。機能的にはパワーストローク（IPS）の阻害剤又は戻りストロークのインヒビター（IRS）8のいずれかとして特徴付けることができる。これらのIPSとIRSの介在ニューロンは、交互の活動が相互抑制9によって駆動され、むしろ、内因性の発振器ではありません。これらのニューロンは、直接swimmeret運動ニューロンを阻害するので、交 ​​互のPS-RSの動きは10が生成される。ロコモーションしかし、活動の生成を必要とするだけでなく、別の独立したマイクロ回路の協調んばかり。 swimmeretシステムでは、このような調整は手足が正しい時間にアクティブであることを確実に配位マイクロ回路によって確立される。このマイクロ回路は、各セグメント11-15で3識別さニューロンによって構築されています。 このプロトコルは、目を提供eは、初めてステップバイステップ解剖ガイドは神経節（A6にT4、 図1）の鎖を分離する。私たちは、孤立した腹部神経索とdesheathe各神経節をピンする方法を示しています。この単離された神経系の調製においては、swimmeret運動に関与する神経細胞は、電気生理学的および形態学的実験に使用するための準備ができている。このプロトコルの第2の部分は、swimmeret運動パターンの主な特徴を示しています。これはswimmeret運動ニューロンの活動を記録するために細胞外にステップバイステップガイドが含まれています。 RSの運動ニューロンの軸索は、PS運動ニューロンの軸索は、同じ神経の後枝を通して（ 図1）プロジェクトながら、神経N1の前方支店を通じてプロジェクト4。したがって、それらの活性は、差動ピン電極と、これらの枝から記録することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" /><br/&gt; 図1：腹部神経節6（A6）とそれ T4 の模式図に胸部神経節4（T4）から単離し神経系：胸部神経節4。 T5：胸部神経節5。 A1、A2、... A6腹部神経節1、腹部神経節2 ...腹部神経節6。 N1：神経N1。 N2：神経N2。 N3：神経N3。 PS：パワーストローク。 RS：リターンストローク。方向性略語： =前部。 P =後部。 この解剖手順および実証電気生理学的手法は、学部学生のための便利であり、生理中の学生実用的コースを補完することがあります。神経節の孤立したチェーンは、神経系の機能、調整、またはswimmeretマイクロ回路6の変調など運動16、17で適応行動の神経細胞の制御を研究するために多数の実験で使用されてきた。ザリガニswimmeretシステムは、このように膨大な量を提供しています面白い授業またはTのすべてのザリガニと仮想運動パターンの細胞外記録の腹側神経索の解剖で始まる機会を雨。

<table><tbody><tr><td>4-channel extracellular amplifier: MA 102&amp;nbsp;</td><td>Amplifier</td><td>Elektroniklabor, Zoologie, Universit&amp;auml;t zu K&amp;ouml;ln, Germany</td><td></td></tr><tr><td>air-table</td><td></td><td>Technical Manufacturing Corporation&lt;br/&gt; (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA</td><td>63-534</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>DD1440A</td></tr><tr><td>big bucket&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex &amp;amp; Clampfit</td><td>pClamp 10, recording and analysis software</td><td>Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>pClamps 10 Standard</td></tr><tr><td>cold lamp source</td><td>with flexible light guide (fiber optic bundle)&amp;nbsp;</td><td>Euromex microscopes holland, Arnhem, BD</td><td>LE.5211 &amp;amp; LE.5235</td></tr><tr><td>computer and monitor</td><td>equipped with recording software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>container and pipette for liquid waste&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>crayfish saline&amp;nbsp;</td><td>contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable)</td><td>fluorescent dye, lysine fixable</td><td>Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td><td>D3328</td></tr><tr><td>dissection dish&amp;nbsp;</td><td>(l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>faraday cage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fixing pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forceps (biology, Dumont #5)</td><td>Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11252-20</td></tr><tr><td>forceps (biology, Dumont #55)</td><td>Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11255-20</td></tr><tr><td>forceps (electronic, Dumont #5)</td><td>Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11251-20</td></tr><tr><td>intracellular electrode</td><td>Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>BF100-50-10</td></tr><tr><td>Leica S8 Apo StereoZoom</td><td>Dissection Microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Zoom 1x - 8x</td><td>Leica, Germany</td><td>10446298</td></tr><tr><td>microscope table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirror</td><td>to illuminate preparation from below</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modeling clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZ61</td><td>Dissection Microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Zoom 0.67x - 4.5x</td><td>Olympus, Germany</td><td></td></tr><tr><td>petri dish&amp;nbsp;</td><td>94 x 16 mm; lined with clear silicone</td><td>Greiner bio-one, Germany</td><td>633180</td></tr><tr><td>ring scissors</td><td>ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>14054-13</td></tr><tr><td>spring scissors or alternative: Vannas spring scissors</td><td>cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>15024-10 or&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 15000-08</td></tr><tr><td>student Vannas&amp;nbsp; spring scissors or alternative:&amp;nbsp; Moria Spring Scissors</td><td>cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>91500-09 or&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 15396-00</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon</td><td>Dow Corning, Midland, MI, USA</td><td></td></tr><tr><td>syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the swimmeret system of crayfish: a practical guide for the dissection of the nerve cord and extracellular recordings of the motor pattern

ここでは、ザリガニ腹部神経索の解剖を実証する。準備は最後の2胸部神経節（T4、T5）と腹部神経節（A6にA1）の鎖を含む。 swimmeretシステム：神経節のこのチェーンは、腹肢（swimmerets）の協調運動を駆動し、中枢神経系（CNS）の一部を含む。これは、ザリガニの各swimmeretがリズミカルな交互作用1-3を生成し、独自の独立したパターン生成カーネルによって駆動され、5 20年以上前から知られている。運動ニューロンは、2つの解剖学的および機能的に異なる集団4を含み、各swimmeretの筋肉組織を支配する。一つはswimmeretの後退（パワーストローク、PS）を担当しています。他のswimmeretの延長（戻り行程、RS）を駆動する。 swimmeretシステムの運動ニューロンは、生体内で記録されたパターンと同一である、自然に仮想運動パターンを生成することができる</全角&gt; 1。 このレポートの目的は、学生の実践的な実験室のコースに独立した微細回路のネットワークとの連携を生成するリズムを研究するための興味深いと便利なモデルシステムを導入することである。提供されたプロトコルは、神経節をdesheathingと孤立神経系から細胞外にswimmerets架空の運動パターンを記録し、神経節の孤立したチェーンのピン止め、ザリガニの腹部神経索の解剖のためのステップバイステップの手順が含まれています。 さらに、当社は、樹状突起から細胞内に記録されたswimmeretニューロンの活動を監視することができます。ここでは、また簡単にこれらの技術を説明し、いくつかの例を提供する。さらに、swimmeretニューロンの形態は、様々な染色技術を用いて評価することができる。ここでは、染料いっぱいニューロンとswimmeret運動ニューロンのプールのバックフィル（イオントフォレーシスによる）細胞内の例を提供する。私たちの研究室では、我々は、この準備仮想運動の基本的な機能を研究するために、CNSの活性に対する感覚フィードバックの効果、および細胞レベルで微細回路間の調整を使用しています。

RS及びPSつ神経の運動ニューロンからの同時細胞外記録して、これらの運動ニューロンプールの交流活動は、仮想歩行パターンを表す（ 図18）を監視することができる。 <img alt="図18" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" /> 図18：差動ピン電極の一方の神経節および配置の概略外RS運動ニューロンの記録（上のトレース）およびPS運動ニュー?...

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The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

ザリガニのSwimmeretシステム：神経索と運動パターンの細胞外記録の解剖のための実践ガイド

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K ビュー.  University of Cologne. Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons. 

ビデオ: The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

ザリガニの脚の伸筋に高と低出力NMJsの生理的録音

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

神経科学

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

膜電位、シナプス応答、神経回路、ニューロモデュレーションとザリガニを使用して筋肉の組織学：学生研究室の演習

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception 

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

ザリガニ腹部の筋肉の受容体の臓器：固有感覚の学生の研究室の演習

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

生物学

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. Traditional non-invasive methods require at least partially restrained research subjects, and they only allow identification of large numbers of simultaneously activated neurons. On the other hand, small ensembles of neurons or individual neurons can only be measured using single-cell recordings obtained from largely reduced preparations. Since the expression of natural behavior is limited in restrained and dissected animals, the underlying neural mechanisms that control such behavior are difficult to identify. 
Here, I present a non-invasive physiological technique that allows measuring neural circuit activation in freely behaving animals. Using a pair of wire electrodes inside a water-filled chamber, the bath electrodes record neural and muscular field potentials generated by juvenile crayfish during natural or experimentally evoked escape responses. The primary escape responses of crayfish are mediated by three different types of tail-flips which move the animals away from the point of stimulation. Each type of tail-flip is controlled by its own neural circuit; the two fastest and most powerful escape responses require activation of different sets of large &#8220;command&#8221; neurons. In combination with behavioral observations, the bath electrode recordings allow unambiguous identification of these neurons and the associated neural circuits. Thus activity of neural circuitry underlying naturally occurring behavior can be measured in unrestrained animals and in different behavioral contexts.

Non-invasive measurements of neural activity patterns in freely behaving animals are obtained by combining neurophysiological recordings with high speed videography.

自由に動物を振る舞うの神経回路のアクティベーションの記録

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

無傷のゴキブリ神経系の神経回路の録音

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

自由にザリガニを移動でハートと換気率の措置

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

ザリガニ開閉筋肉のNMJにおいて歴史的なビューと生理学のデモンストレーション

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

カニ手足の固有感覚と緊張受容体：学生実験室の練習

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...