Ringraziamo Jos Burgert per aiutare con alcune delle figure. Siamo grati a Ingo Selbach (e il gruppo &quot;Edelkrebsprojekt NRW&quot;) per i suoi sforzi per fornire il laboratorio con animali da esperimento. Ringraziamo Anna C. Schneider per la correzione prime versioni del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta da un Emmy Noether DFG concessione SM 206 / 3-1 e una sovvenzione di avvio dell&#39;Università di Colonia per docenti di sesso femminile.

Questa procedura dissezione è in conformità con la Comunità europee Direttiva del Consiglio del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE). 1. Preparazione <ol><li> Ottenere gamberi, Pacifastacus leniusculus (Dana), di entrambi i sessi ≥8 cm di dimensione. Assicurarsi che gli animali sono di vitale importanza e gli arti addome e addominali sono intatte. </li><li> Fare attenzione a ispezionare il carapace e che questa cuticola è dura e rigida. Pre e animali postmolt hanno un carapace morbido e non sono adatti per gli esperimenti perché durante il processo di muta cambiare molti parametri (ad esempio, diminuzione dell&#39;attività locomotoria). </li><li> Montare tutti gli strumenti ei materiali utilizzati durante la dissezione, pinning e desheathing del cordone nervoso illustrato nella figura 2 ed elencati nei supplementi previsti. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" /> Figura 2: <sTrong&gt; Materiali e strumenti utilizzati per la dissezione, pinning e desheathing del cordone nervoso. (1) grande secchio pieno di ghiaccio; (2) salina gamberi; (3) dispenser salina; (4) microscopio dissezione; (5) piatto dissezione; (6) forbici forti; (7) forcipe (8) forbici primavera; (9) piastra Petri rivestito con chiaro Sylgard; (10) perni di fissaggio; (11) con lampade a freddo. 2. Gross Dissection <ol><li> Anestetizzare animali sul ghiaccio per il 15 - 20 min. Effettuare la prima parte della dissezione lordo a un banco di laboratorio vicino al lavandino quanto comprende una fase dissanguamento e il campione deve essere risciacquato regolarmente con gamberi salina durante la procedura. </li><li> Tenere animali lato ventrale e usare le forbici per tagliare entrambi forti artigli alle loro basi vicino al torace (Figura 3-1). Rimuovere uropod sinistra e destra (Figura 3-2). </li><li> Posizionare il lato ventrale degli animali nel piatto dissezione allineato con Sylgard nero. Elevate cefalotorace inserendo ghiaccio sotto e appuntare l&#39;addome al telson (Figura 4A). </li><li> Riempire il dispenser salina con ~ 60 ml di soluzione salina fredda gamberi. Profumato gamberi con soluzione salina fredda attraverso l&#39;apertura artiglio (Figura 4B). Salina eccesso sgocciolare attraverso i tagli alle uropods. Coprire gamberi con ghiaccio durante dissanguamento </li><li> Decapitarlo l&#39;animale con un unico taglio trasversale appena posteriormente agli occhi dell&#39;animale con le forbici forti (Figura 5A). Rimuovere tutte le gambe che camminano vicino alle articolazioni di base come indicato nella figura 5B. </li><li> Isolare l&#39;addome con gli ultimi segmenti toracici dal resto del cefalotorace. Fare un primo taglio a livello della seconda gambe piedi (segmento toracico 3) inserendo la punta delle forbici nell&#39;apertura della seconda gamba piedi e taglio al lato opposto. (Figura 6A-1). </li><li> Estendere questo primo taglio per entrambe le parti attraverso tegli cefalotorace (Figura 6A-2). </li><li> Capovolgere l&#39;animale aperto per fare alcuni degli organi interni visibili. Premere il prominente ghiandola digestiva (Figura 6B-3) per la parte anteriore del campione e utilizzare pinze per rimuovere gli organi riproduttivi dalla cavità addominale. </li><li> Togliere la parte anteriore del cefalotorace (Figura 6C). Utilizzare tagli laterali per rimuovere le parti laterali del carapace, che coprono le branchie, su entrambi i lati del torace rimanente (Figura 6D-4). Rimuovere le branchie e risciacquare il campione con soluzione fisiologica fredda. </li><li> Continuare la dissezione con un taglio attraverso l&#39;intera lunghezza della piastra sternale come indicato nella figura 6E-5. Rendere questo taglio in posizioni laterali massime tra Pleuron e swimmerets (segni rossi Figura 6 sexies). Procedere sull&#39;altro lato con un stesso taglio. Sciacquare il campione con soluzione fisiologica fredda. </li><li> Effettuare la dissezione rimanendo sotto un dissection microscopio. Posizionare addome lato ventrale del gambero di fiume nel piatto dissezione allineato con Sylgard nero e pieno di gamberi salina in modo da coprire il campione. NOTA: Le seguenti operazioni (2,12-4,8) contengono istruzioni direzionali che si applicano a sperimentatori mano destra. Nei passi seguenti (2,12-6,8), è importante sostituire gamberi salina in intervalli regolari, ogni 20-30 minuti con soluzione salina fredda, per mantenere il sistema nervoso sano. </li><li> Fissare il campione con perni di insetti posteriormente al telson e anteriormente ai resti del carapace. Posizionare il campione in modo che i punti Telson a sinistra ed è parallela al bordo del tavolo. </li><li> Utilizzare pinze grossolani nella mano sinistra per afferrare attraverso un&#39;apertura gamba piedi (Figura 7A) ed estrarre il campione aperto (Figura 7B freccia bianca). Identificare i grandi due dorsali filoni flessore muscolari (Figura 7B-1 e C-1) e tagliare loro ventralebase come illustrato nella Figura 7B. </li><li> Identificare l&#39;arteria sternale (Figura 7C-2), che scende dalla dorsale (cuore) per ventrale, al segmento toracico 4 °. Questa arteria si trova proprio sopra il cordone nervoso (Figura 7C-3), prima che si proietta sotto il cordone nervoso, formando l&#39;arteria ventrale. </li><li> Transetto l&#39;arteria sternale. Come mostrato in Figura 7C, sollevare l&#39;arteria prima, usando una lama di forbici, e solo tagliare quando il cordone nervoso ventrale trova è visibile. </li><li> Fissare i muscoli flessori dorsali anteriormente (a destra). Questo dovrebbe essere fatto in posizione di massima allungato con perni in modo da non bloccare la visione e il campione rimane tesa. Quando i filamenti muscolari dorsali sono fissi (Figura 8-1), il primo gangli addominali, A1 e A2, con i nervi associati N1, N2, N3 e sono visibili (Figura 8). </li><li> Utilizzare pinze nella mano sinistra per afferrare le specificheImen in una sola apertura delle gambe a piedi. Durante il seguente dissezione passaggi tirare delicatamente per mantenere il campione aperto. </li><li> Transect i nervi N3 nella posizione più distante dal cordone nervoso. (Figura 8-3). </li><li> Tagliare i muscoli flessori vicino al apodeme ventrale come mostrato nella Figura 8-4. Fare attenzione a non danneggiare il cordone nervoso o nervi N2. </li><li> Ripetere i passaggi 2.18 e 2.19 per i nervi N3 e dei muscoli flessori della restante gangli A2 addominale A5. </li><li> Nell&#39;ultima ganglio addominale, A6, tagliare i muscoli flessori dorsali dal apodeme ventrale e il campione dovrebbe apparire come mostrato nella Figura 9. </li><li> Tagliare la piastra posteriore sternale ai nervi della A6 (Figura 9-1) e tenere la parte ventrale (Figura 9-2). Eliminare la parte dorsale con i muscoli flessori (Figura 9-3). Fissare la piastra sternale anteriormente con perni attraverso le aperture delle gambe piedi,e posteriormente a A6. </li></ol> 3. Belle Dissection <ol><li> Porre il preparato al microscopio con la parte anteriore rivolta di distanza e la parte posteriore verso il bordo dei tavoli. </li><li> Utilizzare pinze come mostrato in Figura 10A per rimuovere le parti più anteriori della sterna cephalothoracic. NOTA: I gangli del torace e nervi associati sono in parte coperti dalla muscolatura delle gambe e sterna cephalothoracic. La sterna cephalothoracic formare uno scheletro che separa le cavità situate lateralmente delle gambe piedi una dall&#39;altra e dalla cavità mediale in cui il cordone nervoso ventrale risiede. </li><li> Tagliare i muscoli tra le rimanenti strutture Esoscheletriche come indicato in Figura 10B -1 e B2. Utilizzare pinze per afferrare e sollevare l&#39;estremità anteriore del cordone nervoso ventrale (Figura 10C). NOTA: Il cordone nervoso sarà danneggiato nel processo in modo da evitare raccogliendo Nerve il cavo più volte. </li><li> Tagliare i nervi toracici laterale mentre si solleva il cordone nervoso (Figura 10C-3). Mantenere questi nervi a lunghezza adeguata per appuntare. Rimuovere la parte spremuto della catena di gangli, che è stato raccolto con una pinza, tagliando via tutto il anterior tessuto T4 (Figura 10C-4). </li><li> Posizionare il campione con la parte anteriore verso sinistra e concentrarsi su A1. Tagliare il N1 e N2 di nervi A1 ad una lunghezza adeguata (max. 1 cm) di spinatura fuori. </li><li> Focus su A2 e identificare i nervi N1, N2, N3 e di questo segmento (Figura 11). I nervi N1 di gangli addominali A2-A5 risiedono tra due ripiegamenti cuticolari sternale in ogni segmento (Figura 11A-1) e sono coperti da muscolatura. Fare un taglio lungo la parte posteriore dello sterno ripiegamento cuticolare. Inizia il bordo laterale dell&#39;addome e procedere verso la linea mediana, come mostrato in Figura 11A. </li><li> Se la destinazione è ancora N1 coverosso con il tessuto come mostrato in Figura 11B (freccia rossa), tutto il taglio del fascio muscolare, ma questa volta anterior per entrambi ripiegamenti cuticolari sternali e il nervo N1 (Figura 11B-2). </li><li> Tagliare nervo N1 distale possibile (Figura 11 C-3). Nerve N1 è completamente visibile e il ramo anteriore e posteriore può essere identificato (Figura 11C). </li><li> Procedere alla N1 nervo controlaterale e la prima tagliare i muscoli lungo la parte posteriore dello sterno ripiegamento cuticolare, partendo medialmente, vicino il ganglio (Figura 11D). Se il nervo è ancora coperto da tessuto, tagliare il fascio muscolare, ma questa volta anterior per entrambi ripiegamenti cuticolari sternali e il nervo N1, simile alla figura 11B-2. Tagliare il N1 nervo distale possibile. </li><li> Tagliare il nervi N2 del ganglio ad una lunghezza adatta (circa. 0,5 centimetri) di spinatura. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,11 per i nervi di A3-A5. </li><li> Tagliare il nerves di ganglio A6 distalmente possibile (Figura 12A). Utilizzare pinze per afferrare più nervi di A6 per sollevare questo ganglio e avviare isolare la catena dei gangli dalla piastra sternale. </li><li> Mentre si solleva il cordone nervoso, tirare delicatamente nella parte anteriore, come mostrato nella Figura 12B (freccia bianca). Poiché i singoli gangli sono sollevati, rimuovere l&#39;arteria ventrale che può essere attaccato al lato ventrale del cordone nervoso (Figura 12C). Continua questa sequenza (delicatamente) tirare taglio fino a quando il cordone nervoso è completamente isolato. </li><li> Trasferire la catena isolata dei gangli di una capsula di Petri rivestito con chiaro Sylgard e riempito con soluzione salina gamberi (Figura 12D). </li></ol> 4. Pinning cordone nervoso nella piastra di Petri NOTA: Usare piccoli perni tagliati da filo di acciaio inossidabile (vedi supplementi) per bloccare il cordone nervoso. Toccare solo il nervo che termina con le pinze e non fare squeezvia e connettivi o gangli. <ol><li> Pin la catena di gangli in linea retta, mentre si applica tratto delicato. </li><li> Disporre il cordone nervoso nella capsula di Petri con il lato dorsale verso l&#39;alto (Figura 13, linea nera). Il lato ventrale dei gangli può essere identificato dal suo convessità; lato dorsale è piatto. Pin i nervi toracici ai lati. Continuare con i nervi di A6, si estende il cordone nervoso lungo il suo asse longitudinale. </li><li> Pin i nervi di A1 ad un angolo di 90 ° rispetto al cordone nervoso. </li><li> Procedere alla A2 e pin nervi N2 ad un angolo di 35-45 ° rispetto al cordone nervoso (Figura 1A). </li><li> Separare i nervi N1 nelle loro anteriori e posteriori rami prima pinning come mostrato nella Figura 14. Utilizzare due coppie di pinze sottili a prendere con un paio di pinze anteriore e con l&#39;altra il ramo posteriore del nervo N1. Fare attenzione a scegliere solo alla fine più distales dei rami nervosi. Ora tirare con cautela. </li><li> Pin il ramo anteriore del nervo N1 ad un angolo di 90 ° rispetto al cordone nervoso (Figura 1A). Pin il ramo posteriore del nervo N1 tra il ramo N1 anteriore e il nervo N2. </li><li> Ripetere la procedura 4,4-4,6 per i nervi dei gangli A3-A5. Mentre fissarsi il tratto cordone nervoso in longitudinale e senso trasversale. </li></ol> 5. Desheathing gangli <ol><li> Posizionare il preparato in modo tale che le mani del sperimentatore sono sempre appoggiati su un piano stabile per evitare scuotimento. Per desheath i gangli illuminano il cordone nervoso dal basso. </li><li> Focus su qualsiasi gangli A1 addominale A5. Usare le forbici primavera pregiati per fare un piccolo taglio laterale attraverso la guaina gangli, posteriore al ganglio e tra i nervi N2 e N3 (Figura 15A freccia rossa). </li><li> Sollevare la guaina ganglio utilizzando molto fpinze ine e tagliati trasversalmente attraverso la guaina sopra connettivi, come indicato in Figura 15A-1. Fare attenzione a non comprimere o tagliare il cordone nervoso con le forbici. </li><li> Sempre tenendo e sollevando la guaina gangli con una pinza continuano a tagliare lungo i bordi laterali del ganglio (Figura 15B-2 e -3). Rimuovere la guaina. Alternativamente pin per entrambi i lati dei connettivi in ​​modo tale che è fisso, ma il cordone nervoso non venga schiacciato. </li><li> Ripetere i passaggi 5,2-5,4 per tutti addominale gangli A1 a A5. </li><li> Desheathe i gangli del torace e il ganglio A6 in modo simile. Per desheathe A6 anteriori inizio al ganglio e procedere in direzione posteriori. Pin guaina gangli della A6 alla estremità posteriore della catena di gangli. </li></ol> 6. extracellulare registrazioni da Motor neuroni <ol><li> Montare tutti gli strumenti ei materiali utilizzati per le registrazioni extracellulari indicati in Figura 16B ed elencati nei supplementi. Una panoramica del sistema di registrazione è mostrato in Figura 16A. Avviare tutte le apparecchiature elettroniche utilizzate in questo esperimento (Figura 16C), in modo che gli amplificatori possono riscaldarsi per almeno 30 minuti prima della registrazione. Accendere il computer e avviare il software di registrazione. </li><li> Posizionare la catena di gangli sul tavolo microscopio e illuminare dal basso. Inserire l&#39;elettrodo di registrazione nel sylgard vicino al nervo bersaglio e l&#39;elettrodo di riferimento in una posizione vicina, ma lateralmente alla gangli (Figura 17A e B). Piegare il nervo target intorno l&#39;elettrodo di registrazione (Figura 17C). </li><li> Stretch il nervo leggermente, per assicurare il contatto tra l&#39;elettrodo e il nervo e il pin di lato (F IGURA 17D). Fissare i cavi degli elettrodi al tavolo del microscopio con plastilina, in modo da rimanere nella posizione desiderata. </li><li> Utilizzare unsiringa piena di vaselina e un ago calibro 20 (con punta arrotondata) (Figura 17E-3) per isolare il nervo bersaglio dalla soluzione di balneazione. Prima tamponare alcuni vaselina sulla sylgard intorno l&#39;elettrodo di registrazione. Il risultato è uno strato di vaselina copre il Sylgard in prossimità dell&#39;elettrodo di registrazione (Figura 17E-4). Fare attenzione a non tamponare direttamente sul nervo e di evitare bolle d&#39;aria in questo strato. </li><li> Sigillare l&#39;elettrodo di registrazione con vaselina da tutti i lati fino al livello della superficie della soluzione salina (Figura 17F). </li><li> Ripetere questa procedura per tutti i nervi di destinazione cui attività devono essere monitorati. </li><li> Avviare la registrazione. Utilizzare una modalità di acquisizione gratuita continuo o gap e una frequenza di campionamento di 5 kHz. Impostare l&#39;amplificatore extracellulare ai seguenti parametri; guadagnare a 1.000 (amplifica il segnale 1.000 volte, aver cura di includere questo parametro di amplificazione nelle impostazioni del software di acquisizione) unada gamma filtro passa-banda di 300 Hz (taglio basso) a 2.000 Hz (high cut). </li></ol>

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	<li>Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Co-Ordination+of+Swimmeret+Movements+in+the+Crayfish,+Procambarus-Clarkii+(Girard).">The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard).</a> J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).</li><li>Mulloney, B., Smarandache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+Years+of+CPGs:+Two+Neuroethological+Papers+that+Shaped+the+Course+of+Neuroscience.">Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience.</a> Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).</li><li>Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Separate+Local+Pattern-Generating+Circuit+Controls+the+Movements+of+Each+Swimmeret+in+Crayfish.">A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish.</a> J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).</li><li>Mulloney, B., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+crayfish+abdominal+ganglia.+III.+Swimmeret+motor+neurons.">Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons.</a> J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).</li><li>Davis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lobster+Righting+Responses+and+Their+Neural+Control.">Lobster Righting Responses and Their Neural Control.</a> Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).</li><li>Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+the+crustacean+swimmeret+system.">Neurobiology of the crustacean swimmeret system.</a> Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).</li><li>Huxley, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The crayfish: An introduction to the study of zoology. , (1980).</li><li>Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+types+of+nonspiking+interneurons+in+local+pattern-generating+circuits+of+the+crayfish+swimmeret+system.">Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system.</a> J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).</li><li>Skinner, F. K., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersegmental+coordination+of+limb+movements+during+locomotion:+mathematical+models+predict+circuits+that+drive+swimmeret+beating.">Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating.</a> J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).</li><li>Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+fictive+locomotion,+graded+synaptic+currents+drive+bursts+of+impulses+in+swimmeret+motor+neurons.">During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons.</a> J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).</li><li>Smarandache-Wellmann, C., Gr&#228;tsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+coordination+in+distributed+neural+circuits:+Encoding+coordinating+information.">Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information.</a> J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).</li><li>Mulloney, B., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+commissural+interneurons+integrate+information+from+intersegmental+coordinating+interneurons.">Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons.</a> J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).</li><li>Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursts+of+information:+Coordinating+interneurons+encode+multiple+parameters+of+a+periodic+motor+pattern.">Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern.</a> J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).</li><li>Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Rhythmic+Motor+Activity+by+Gradients+of+Synaptic+Strength+in+a+Neural+Circuit+That+Couples+Modular+Neural+Oscillators.">Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators.</a> J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).</li><li>Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Coordination+in+Distributed+Neural+Circuits:+Decoding+and+Integration+of+Coordinating+Information.">Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information.</a> J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).</li><li>Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-Dependent+Responses+of+2+Motor+Systems+in+the+Crayfish,+Pacifastacus+leniusculus.">State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus.</a> J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).</li><li>Chrachri, A., Neil, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+and+Synchronization+between+2+Abdominal+Motor+Systems+in+Crayfish.">Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish.</a> J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).</li><li>Skinner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+the+4th+Abdominal-Ganglion+of+the+Crayfish,+Procambarus-Clarki+(Girard)+II.+Synaptic+Neuropils.">The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils.</a> J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).</li><li>Skinner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+the+4th+Abdominal-Ganglion+of+the+Crayfish,+Procambarus-Clarki+(Girard)+I.+Tracts+in+the+Ganglionic+Core.">The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core.</a> J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).</li><li>Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectonics+of+crayfish+ganglia.">Architectonics of crayfish ganglia.</a> Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).</li><li>Braun, G., Mulloney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+modulation+of+the+swimmeret+motor+system+in+crayfish.">Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish.</a> J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).</li><li>Davis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motoneuron+Morphology+and+Synaptic+Contacts+-+Determination+by+Intracellular+Dye+Injection.">Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection.</a> Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).</li><li>Altman, J. S., Tyrer, N. M., Strausfeld, N. J., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+Selected+Neurons+with+Cobalt+through+Cut+Axons.">Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons.</a> Neuroanatomical Techniques. , 373-402 (1980).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> L&#39;anatomia di gamberi e la loro gangli addominali è stata descritta in precedenza 5, 18, ​​19, 20 e si consiglia di acquisire familiarità con essi prima della dissezione, per evitare il taglio dei nervi importanti. È fondamentale per mantenere il preparato a temperature inferiori a 23 ° C per evitare la degradazione del cordone nervoso isolato. Ciò può essere ottenuto facilmente mediante sostituzione della soluzione di balneazione ogni 20-30 min con soluzione salina gamberi freddo. In queste circostanze, la catena di gangli può essere utilizzato per esperimenti elettrofisiologici fino a 12 ore. A volte motoneuroni swimmeret sono inattivi e non mostrano alcuna attività di scoppio spontanea. L&#39;agonista colinergico carbachol viene usato per indurre attività scoppio in queste preparazioni. Disciolto in soluzione salina gamberi freddo, le applicazioni per il bagno di 1-3 micron carbacolo sono sufficienti per attivare il ritmo swimmeret 21. ove_content &quot;&gt; La locomozione fittizia e soprattutto il coordinamento degli arti registrati in questo sistema forniscono un sacco di informazioni sulle proprietà cellulari di attività ritmica e coordinamento. In questo sistema le componenti neuronali 8-10 dei microcircuiti locali sono identificati e inoltre la rete di coordinamento è conosciuto in dettaglio cellulare 11,14,15. I risultati tratti dagli esperimenti eseguiti con registrazioni extracellulari, permettono già le previsioni per i modelli matematici e di robotica. Tutti i neuroni swimmeret mostrano dendritica branching all&#39;interno del laterale neuropilo e può essere intracellulare registrati da tali dendriti. Nella Figura 20, è mostrata una registrazione intracellulare di un motoneurone PS. Per questo un microelettrodo tagliente (vedi supplementi) riempita con 1 M Kac + 0,1 M KCl (resistenza dell&#39;elettrodo tra 35 - 45 MW) è posto al di sopra del laterale neuropilo. I potenziali di membrana oscillanti come wELL picchi dei dendriti di PS e RS motoneuroni possono essere registrati quando l&#39;elettrodo è inserito vicino alla base del nervo N1. Per colorare singoli neuroni (ad esempio, motoneuroni) intracellulare come mostrato nella Figura 21, il microelettrodo tagliente deve essere ulteriormente riempito con colorante fluorescente (ad esempio 1% destrano Texas Red, vedi supplementi) sciolto in 1 M KAC + 0,1 M KCl. Per riempire motoneuroni intracellulare dalla ionoforesi, polarizzando impulsi di 1 nA con una durata di 250 ms a 2 Hz si applicano per almeno 10 min. Per coloranti carica positiva usano depolarizzante impulsi e coloranti caricati negativamente utilizzare impulsi iperpolarizzanti. Riempimenti più lunghi comportano un forte neurone etichettati. Per la visualizzazione del cordone nervoso deve essere fissato, disidratati, e montato 22. Un metodo per macchiare un pool di motoneuroni è usare riporti dalla N1 nervi (Figura 22) 4, 23. Mettere un pozzo di vaselina attorno al ramo posteriore del nervo N1 per riempire la piscina dei motoneuroni PS. Per macchiare il pool di motore RS neuroni un pozzo è posto sul ramo anteriore del nervo N1. La salina gamberi nel pozzo è sostituito da DDH 2 O. Poi tagliare questo nervo all&#39;interno del pozzo e lasciare per 15 minuti in DDH 2 O a temperatura ambiente (RT). Successivamente, sostituire il DDH 2 O nei pozzetti o con 5% CoCl 2 - o 5% NiCl 2 - soluzione (sciolto in DDH 2 O) e chiudere i pozzi con vaselina. Il campione deve essere incubate per almeno 15 ore a 4 ° C. Aprire i pozzetti, rimuovere il colorante e lavare il campione tre volte con soluzione fisiologica. Precipitare le ioni Co 2+ Ni 2+ o con 10 gocce di Dithiooxamid (soluzione satura sciolti in 100% EtOH) per ogni 10 ml di soluzione salina gamberi nella piastra di Petri, sotto il cofano per 20 minuti a RT. Ni 2+ - ioni precipiterà al blu Ni (SCH) e Co 2+ </sup&gt; ioni a CoS arancioni. Il cordone nervoso deve essere fissato, disidratato, e montato per acquisire immagini delle cellule marcate con un microscopio ottico dotato di una fotocamera.

I swimmerets di gamberi hanno una funzione di controllo della postura e battere ritmicamente quando gli animali nuotano in avanti, ventilare le loro tane o femmine aerare le loro uova 5, 6. I swimmerets del gambero del segnale, Pacifastacus leniusculus, si verificano in coppie dalla seconda alla quinta segmento addominale, con un arto su ciascun lato dell&#39;addome 7. Il sistema nervoso centrale produce propria ticchettio motore ritmica che aziona il movimento swimmeret nell&#39;animale intatto nonché nella preparazione isolato cordone nervoso. Quando non c&#39;è feedback sensoriale o discendente ingresso presente modello motore ritmica prodotta viene chiamato locomozione fittizia 1, 2. Nel sistema swimmeret questo schema motorio non differisce in qualsiasi parametro dall&#39;attività delle swimmerets misurati nell&#39;animale intatto. Il movimento di ciascun swimmeret è guidato da un microcircuito che si trova dentro e limitato a una corresponding hemiganglion 1 -. 3 In ogni microcircuito c&#39;è un kernel generano tracciati che comprende cinque interneuroni identificati non spike. Essi possono essere funzionalmente caratterizzati come sia Inhibitor of Power Stroke (IPS) o inibitore della corsa di ritorno (IRS) 8. Questi IPS e interneuroni IRS non sono oscillatori endogeni, piuttosto la loro attività di alternanza è guidato da inibizione reciproca 9. Poiché questi interneuroni inibiscono direttamente i motoneuroni swimmeret, il movimento alternato PS-RS è generato 10. Locomotion tuttavia, non solo richiede la generazione di attività, ma anche il coordinamento dei vari microcircuiti indipendenti. Nel sistema swimmeret tale coordinamento è stabilito dal microcircuito coordinamento che assicura che gli arti sono attivi a volte corretti. Questo microcircuito è costruito da tre neuroni identificati in ogni segmento 11-15. Questo protocollo prevede the prima volta una guida passo-passo dissezione per isolare la catena di gangli (T4 al A6, Figura 1). Mostriamo come al pin isolato cordone nervoso addominale e desheathe ogni ganglio. In questo isolato preparazione del sistema nervoso, i neuroni responsabili del movimento swimmeret sono pronti per l&#39;uso negli esperimenti elettrofisiologici e morfologici. La seconda parte di questo protocollo illustra le caratteristiche principali del modello del motore swimmeret. Ciò include una guida step-by-step per registrare extracellulare l&#39;attività dei motoneuroni swimmeret. Gli assoni dei neuroni motori RS proiettano attraverso il ramo anteriore del nervo N1, mentre assoni dei motoneuroni PS proiettano attraverso il ramo posteriore dello stesso nervo (Figura 1) 4. Quindi la loro attività può essere registrato da questi rami con elettrodi pin differenziali. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" /><br/&gt; Figura 1: Isolati sistema nervoso dal ganglio toracico 4 (T4) per ganglio addominale 6 (A6) e un diagramma schematico di esso T4:. Ganglio toracico 4; T5: ganglio toracico 5; A1, A2 ... A6 ganglio addominale 1, ganglio addominale 2 ... ganglio addominale 6; N1: nervo N1; N2: nervo N2; N3: nervo N3; PS: power-stroke; RS: return-stroke. Abbreviazioni direzionali: A = anteriore; P = posteriori. Questa procedura dissezione e la tecnica dimostrata elettrofisiologico sono convenienti per gli studenti universitari e studenti possono integrare corsi pratici in fisiologia. La catena di gangli isolato è stato utilizzato in una serie di esperimenti per studiare la funzione del sistema nervoso, coordinamento, o la modulazione di microcircuiti swimmeret 6 così come il controllo neuronale del comportamento adattativo in locomozione 16, 17. Il sistema gamberi swimmeret fornisce pertanto una quantità enorme di insegnamento interessanti o tPiove opportunità che iniziano tutti con la dissezione del cordone nervoso ventrale di gamberi e la registrazione extracellulare del pattern motorio fittizia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Type</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:103px;">Comments/&#160;&#160; Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">4-channel extracellular amplifier: MA 102&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Amplifier</td>
			<td style="width:139px;">Elektroniklabor, Zoologie, Universit&#228;t zu K&#246;ln, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:131px;">air-table</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;">Technical Manufacturing Corporation 
			(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA</td>
			<td style="width:103px;">63-534</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">Axon Digidata 1440A</td>
			<td style="width:131px;">Digitizer</td>
			<td style="width:139px;">Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td>
			<td style="width:103px;">DD1440A</td>
			<td style="width:103px;">digitizes recorded signals&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">big bucket&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">filled with ice</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Clampex &#38; Clampfit</td>
			<td style="width:131px;">pClamp 10, recording and analysis software</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Devices Design, Union City, CA</td>
			<td style="width:103px;">pClamps 10 Standard</td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">cold lamp source</td>
			<td style="width:131px;">with flexible light guide (fiber optic bundle)&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Euromex microscopes holland, Arnhem, BD</td>
			<td style="width:103px;">LE.5211 &#38; LE.5235</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">computer and monitor</td>
			<td style="width:131px;">equipped with recording software</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">container and pipette for liquid waste&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:131px;">crayfish saline&#160;</td>
			<td style="width:131px;">contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">always keep at temperatures ~ 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable)</td>
			<td style="width:131px;">fluorescent dye, lysine fixable</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:103px;">D3328</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular dyefill of neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">differential pin electrodes</td>
			<td style="width:131px;">made from stainless steel &#632; 0.2 mm</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">dissection dish&#160;</td>
			<td style="width:131px;">(l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">used in the gross disection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">faraday cage</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">fixing pins</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for pinning the specimen</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">forceps (biology, Dumont #5)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11252-20</td>
			<td style="width:103px;">fine forceps: used to pick nerves</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">forceps (biology, Dumont #55)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11255-20</td>
			<td style="width:103px;">extra fine forceps: used for desheathing</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">forceps (electronic, Dumont #5)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11251-20</td>
			<td style="width:103px;">coarse forceps:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; used to grab specimen and pins</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:131px;">intracellular electrode</td>
			<td style="width:131px;">Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instruments, Novato, CA</td>
			<td style="width:103px;">BF100-50-10</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular recording and dyefill of neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Leica S8 Apo StereoZoom</td>
			<td style="width:131px;">Dissection Microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Zoom 1x - 8x</td>
			<td style="width:139px;">Leica, Germany</td>
			<td style="width:103px;">10446298</td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">microscope table</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">mirror</td>
			<td style="width:131px;">to illuminate preparation from below</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">modeling clay</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Olympus SZ61</td>
			<td style="width:131px;">Dissection Microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Zoom 0.67x - 4.5x</td>
			<td style="width:139px;">Olympus, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for the dissection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">petri dish&#160;</td>
			<td style="width:131px;">94 x 16 mm; lined with clear silicone</td>
			<td style="width:139px;">Greiner bio-one, Germany</td>
			<td style="width:103px;">633180</td>
			<td style="width:103px;">used to pin the isolated chain of ganglia</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">ring scissors</td>
			<td style="width:131px;">ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">14054-13</td>
			<td style="width:103px;">for gross dissection&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (steps 2.1 - 2.11)</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">saline dispenser&#160; with a 16 gauge needle (outer &#632; 1.6mm) attached via a flexible tube.</td>
			<td style="width:131px;">Volume ~ 60ml,</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">used for exsanguination</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:131px;">spring scissors or alternative: Vannas spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">15024-10 or&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15000-08</td>
			<td style="width:103px;">for desheathing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">stainless steel wire &#632; 0.125 mm&#160;</td>
			<td style="width:131px;">to cut pins of 4-7 mm length</td>
			<td style="width:139px;">Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for pinning of the nerve cord</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:131px;">student Vannas&#160; spring scissors or alternative:&#160; Moria Spring Scissors</td>
			<td style="width:131px;">cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">91500-09 or&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15396-00</td>
			<td style="width:103px;">for gross and fine disection&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (steps 2.11 - 3.14)</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">sylgard</td>
			<td style="width:131px;">184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon</td>
			<td style="width:139px;">Dow Corning, Midland, MI, USA</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the swimmeret system of crayfish: a practical guide for the dissection of the nerve cord and extracellular recordings of the motor pattern

Qui mostriamo la dissezione del cordone nervoso addominale gamberi. La preparazione comprende gli ultimi due gangli toracica (T4, T5) e la catena di gangli addominali (A1 al A6). Questa catena di gangli comprende la parte del sistema nervoso centrale (CNS) che guida locomozione coordinata dei pleopodi (swimmerets): il sistema swimmeret. E &#39;noto per oltre cinque decenni in gamberi ogni swimmeret è guidato da un proprio kernel generano tracciati indipendenti che genera attività alternanza ritmica 1-3. I motoneuroni che innervano la muscolatura di ogni swimmeret comprendono due anatomicamente e funzionalmente distinte popolazioni 4. Uno è responsabile per la retrazione (corsa di potenza, PS) del swimmeret. Altre unità la protrazione (corsa di ritorno, RS) del swimmeret. Neuroni motori del sistema swimmeret sono in grado di produrre spontaneamente uno schema motorio fittizia, che è identico al modello registrato in vivo </em&gt; 1. Lo scopo di questo rapporto è quello di introdurre un interessante e conveniente sistema modello per lo studio delle reti di generazione del ritmo e il coordinamento di microcircuiti indipendenti per i corsi di laboratorio pratico degli studenti. Il protocollo fornito include le istruzioni passo-passo per la dissezione del cordone nervoso addominale del gambero di fiume, pinning della catena isolato di gangli, desheathing gangli e registrando il swimmerets fittizia pattern motorio extracellulare dal sistema nervoso isolato. Inoltre, siamo in grado di monitorare l&#39;attività dei neuroni swimmeret registrati intracellulare di dendriti. Qui abbiamo anche una breve descrizione di queste tecniche e fornire alcuni esempi. Inoltre, la morfologia dei neuroni swimmeret può essere valutata utilizzando varie tecniche di colorazione. Qui forniamo esempi di intracellulare (dalla ionoforesi) tintura piena neuroni e riporti di pool di motoneuroni swimmeret. Nel nostro laboratoriousiamo questa preparazione per studiare le funzioni di base di locomozione fittizia, l&#39;effetto di feedback sensoriale sull&#39;attività del SNC, e il coordinamento tra microcircuiti a livello cellulare.

Con le registrazioni extracellulari simultanee da RS e PS, motoneuroni di uno ganglio, l&#39;attività alternata di queste piscine motoneuroni, può essere monitorato (Figura 18), che rappresenta lo schema locomozione fittizia. <img alt="Figura 18" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" /> Figura 18: Schema di un ganglio e il posizionamento di elettrodi pin differenziale registrazione extracellulare di RS motoneuroni (traccia superiore) e PS (neuroni motori inferiori traccia).. L&#39;attività PS extracellulare di PS ipsilaterale 2 per PS 5 motoneuroni evidenzia aspetti interessanti di coordinamento intersegmentale nel sistema swimmeret (Figura 19A). In primo luogo, l&#39;attività inizia sempre con un burst PS in A5 (Figura 19A, 4 ° traccia) e l&#39;onda di eccitazione si propaga nella direzione anteriore (&lt;strong&gt; Figura 19A, linea verde). In secondo luogo, il periodo (che è il tempo misurato dalla comparsa di uno scoppio all&#39;insorgenza del prossimo burst) in ciascun segmento rimane costante (Figura 19A, freccia ciano). Questo è vero, finché il flusso di informazioni da un ganglio al successivo è intatta e le condizioni sperimentali non cambiano. In diverse preparazioni o in diverse condizioni sperimentali i periodi e la durata di scoppio possono variare notevolmente: dai periodi di 0,25-1 sec. Al fine di confrontare questi parametri tra diverse preparazioni, hanno bisogno di essere normalizzata e graficamente in un istogramma fase (Figura 19B). Questo rivela il terzo aspetto interessante del modello del motore: la fase che intercorre tra i segmenti, il ritardo intersegmentale, rimane costante e indipendente dalla frequenza del ritmo. Per calcolare un istogramma fase, le seguenti misure e calcoli sono necessario: Innanzitutto, una traccia di riferimento deve essere scelto. Di solito si usa la traccia PS del ganglio più posteriore (ad esempio, PS 5) come riferimento (essendo tempo 0) per un istogramma fase del ritmo swimmeret registrata tra diverse segmenti (Figura 19A) .Poi, misurare il periodo (in ms ) del ritmo dall&#39;inizio di una PS 5 raffica (tempo 0, Figura 19A, arancione linea tratteggiata) per l&#39;inizio del successivo PS 5 raffica (Figura 19A, freccia ciano) .Within questo ciclo, misurare le latenze (in ms ) tra l&#39;inizio della PS 5 scoppio (tempo 0) e l&#39;inizio (insorgenza scoppio, Figura 19A e B, frecce arancione) e di fine (offset Figura 19A e B, frecce viola) del PS scoppio in ciascuno degli altri gangli . Quindi per calcolare l&#39;inizio fase e offset per ogni raffica le latenze sono divisi per il periodo concomitante. Queste misure comporteranno v numericoalori tra 0 e 1. Infine, terreno questi valori in un istogramma di fase, come mostrato nella Figura 19B. L&#39;istogramma fase risultante (Figura 19B) contiene informazioni sul ciclo di dovere del PS scoppiare in ogni segmento. E il intersegmentale fase-lag di circa 0,25 tra i segmenti vicini è chiaramente visibile. <img alt="Figura 19" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig19highres.jpg" /> Figura 19: (A) Schema di posizionamento degli elettrodi e registrazione extracellulare di PS omolaterale 5 a 2. PS (B) Misure e calcoli necessari per l&#39;istogramma di fase. L&#39;istogramma di fase calcolato dal dieci burst consecutivi (n = 10) mostra il ritardo di fase di intersegmentale ~ 0,25. Per maggiori sperimentatori avanzate, registrazioni intracellulari con taglienti microelettrodi dei dendriti dei neuroni motori possono essere utili. I potenziali di membranadell intracellulare registrati motoneuroni PS mostrano oscillazioni in fase con l&#39;attività extracellulare registrata di tutti motoneuroni PS della stessa hemiganglion (Figura 20, pannelli grigio). In alternativa, motoneuroni RS o interneuroni possono essere registrati intracellulare nello stesso modo (dati non mostrati). <img alt="Figura 20" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig20highres.jpg" /> Figura 20:. Schema di posizionamento degli elettrodi Il potenziale di membrana di una intracellulare registrato motoneurone PS (traccia superiore) oscilla in fase (pannelli grigi) con l&#39;attività PS extracellulare registrato (traccia inferiore). Per l&#39;identificazione dei neuroni intracellulare registrati (interneuroni o neuroni motori), le cellule possono essere tintura riempiti utilizzando microelettrodi taglienti e ionoforesi (vedi la discussione). Nella Figura 21, sono mostrati due neuroni motori PS intracellulare la tintura pieni. La loro somata ventralesi trova posteriormente alla base della N1 nervosa. I progetti dei neuriti primaria anteriormente (Figura 21B-2) e filiali all&#39;interno del laterale neuropilo (Figura 21A e B-3); progetti assone attraverso il ramo posteriore della N1 nervi alla muscolatura swimmeret (Figura 21B-4). <img alt="Figura 21" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig21highres.jpg" /> Figura 21: (A) Schema di un ganglio addominale (B) Due intracellulare macchiato motoneuroni PS.. (1) somata; (2) neuriti primarie; (3) dendritica ramificazione nel neuropil laterale; (4) assoni progetto attraverso il ramo posteriore del nervo N1; Bar = 100 micron. Per meno sperimentatori avanzati, o coloro che vogliono studiare la morfologia del ganglio addominale, riporti dalle PS e del motore RS piscine neurone attraverso il nervo N1, sono un esercizio interessante. In Figura 22, i RS e PS motoneuroni di uno hemiganglion sono state colorate con Co 2+ (RS) e Ni 2 + ioni (PS), rispettivamente. Somata dei motoneuroni PS sono situati posteriormente alla base della N1 nervi (Figura 22-1). Tutti somata di RS motoneuroni si trovano anterior alla base del nervo N1 (Figura 22-2). <img alt="Figura 22" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig22highres.jpg" /> Figura 22: riporti dal anteriore (arancione, Co 2+) e posteriore (blu, Ni 2+) ramo del nervo N1 (1) Somata di motoneuroni PS;. (2) somata dei motoneuroni RS. Bar = 100 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig3highres.jpg" /> Figura 3: Rimozione gli artigli (1) e uropods (2). Le linee rosse (1) e (2) indicano le posizioni dei tagli. Bar = 5 centimetri. Figura 4:. (A) L&#39;animale è appuntato lato ventrale e fissato al telson (B) Il gambero è dissanguato attraverso l&#39;apertura artiglio con soluzione fisiologica fredda. Bar = 5 cm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig5highres.jpg" /> Figura 5: (A) Decapitazione e (B) rimozione di gambe che camminano. Le linee rosse indicano le posizioni dei tagli. Bar = 1 cm. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig6highres.jpg" /> Figura 6: (A, B, C e D) rimozione del anteriore e le parti laterali del cefalotorace. E. Apertura dell&#39;addome lungo il lato laterale.Le linee rosse (1), (2), (4), e (5) indicano le posizioni dei tagli. (3) ghiandola digestiva. Frecce rosse indicano la cavità addominale già aperto. Bar = 1 cm. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig7highres.jpg" /> Figura 7: (A) Il provino viene afferrato in corrispondenza di un&#39;apertura delle gambe piedi (frecce rosse) trefoli (B) Il muscolari dorsali (1) vengono recisi, mentre il campione viene aperta.. Freccia bianca rappresenta la direzione in cui la piastra sternale è tirato. (C) Descrizione della cavità addominale con l&#39;arteria sternale (2) e cordone nervoso (3). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig8highres.jpg" /> Figura 8: vista trasversale dell&#39;addome gamberi con filamenti muscolari dorsali fisso (1) e arteria sternale (2); Le linee rosse (3) e (4) indicano posizioni di tagli. Bar= 5 mm. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig9highres.jpg" /> Figura 9: dorsale e parti ventrali dell&#39;addome sono separati l&#39;uno dall&#39;altro (1) la linea rossa indica la posizione di taglio.. Piastra sternale (2) con il cordone nervoso ventrale; dorsale parte dell&#39;addome (3). <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig10highres.jpg" /> Figura 10:.. (A) Posizione delle pinze per rimuovere la sterna cephalothoracic anteriore (B) Le linee rosse (1) e (2) indicare dove tagliare i muscoli tra il restante sterna cephalothoracic (C) I nervi toracici sono recisi a le linee rosse (3) per isolare i gangli toracici dal tessuto circostante. Linea rossa (4) indica il taglio tra T3 e T4. Bar = 5 mm. Figura 11: (A e B) Vista della piastra sternale a A2. Il nervo N1 è isolato dal tessuto con un taglio lungo il ripiegamento sternale posteriore cuticolare (1) e anteriore ad entrambi ripiegamenti cuticolari sternali (B 2). (C) maggiore ingrandimento della regione intorno A2, con il nervo isolata N1. ( D) Isolamento del nervo N1 sul lato controlaterale con tagli simili. Le linee rosse (2) e (3) indicano le posizioni dei tagli; (1) anteriore e posteriore ripiegamenti cuticolari sternale; Bar = 5 mm. <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig12highres.jpg" /> Figura 12: (A e B) A6 è isolato dal tessuto e il cavo nervo può essere sollevato nervi di A6 (C). </strong&gt; Tutti i collegamenti dei gangli addominali al arteria addominale ventrale sono recisi. (D) cordone nervoso isolato viene trasferito in una capsula di Petri rivestito con chiaro Sylgard e riempito con soluzione fisiologica. Le linee rosse indicano le posizioni dei tagli. Bar = 5 mm. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig13highres.jpg" /> Figura 13: Vista laterale di un ganglio Identificazione della dorsale e ventrale (linea nera) del cordone nervoso.. Bar = 5 mm <img alt="Figura 14" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig14highres.jpg" /> Figura 14: Il ramo anteriore del nervo N1 è separato dal ramo posteriore Bar = 5 mm.. <img alt="Figura 15" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig15highres.jpg" /> Figura 15: Istruzioni per desheathing di un ganglio addominale (A) Posizione del primo piccolo taglio attraverso la guaina dei connettivi (freccia rossa), posto laterale e posteriore al ganglio. Il successivo taglio attraverso la guaina sopra il connettivo è segnato dalla linea rossa (1). (B) Le linee rosse (1) e (2) segnano i tagli lungo i bordi laterali del ganglio. La guaina può poi essere tirato dal ganglio. Bar = 1 mm. <img alt="Figura 16" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig16highres.jpg" /> Figura 16:. (A) Panoramica della configurazione di registrazione (B) Materiali e strumenti necessari per le registrazioni extracellulari. C. Materiale necessario per la registrazione elettrofisiologica. (1) Fonte lampada fredda; (2) gabbia di Faraday; (3) stereomicroscopio; (4) aria-table; (5) Tavolo microscopio; (6) specchio; (7) elettrodi pin differenziale; (8) siringa riempita con etere di petroliogelatina; (9) plastilina; (10) pinze; (11) smaltimento dei rifiuti liquidi; (12) digitalizzatore; (13) amplificatore extracellulare; (14) del computer, dotato di software di registrazione e monitor. <img alt="Figura 17" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig17highres.jpg" /> Figura 17: (A e B) posizione di registrazione (1) e di riferimento (2) Elettrodo pin. (C e D) Il ramo posteriore del nervo N1 è piegato attorno all&#39;elettrodo di registrazione. E. La base (4) dell&#39;elettrodo di registrazione è isolato con vaselina. F. L&#39;elettrodo di registrazione completo è isolato con vaselina dalla soluzione bagno. (3) Siringa riempito di vaselina. Bar = 2 mm.

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The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Il Sistema swimmeret di gamberi: Una guida pratica per la dissezione del cavo di Nerve e extracellulari registrazioni del modello Motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Views.  University of Cologne. Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons. 

Video: The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Le registrazioni fisiologiche NMJs uscita alta e bassa del muscolo estensore gamberi Leg

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Ricerca

Neuroscienze

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

Una descrizione visiva della dissezione del sistema vascolare di superficie cerebrale e Meningi associate, e del plesso coroide da cervello di ratto

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a connection between amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and impairments in the nucleocytoplasmic pathway. ALS is a neurodegenerative disease affecting the motor neurons and resulting in paralysis and ultimately in death, within 2-5 years on average. Most cases of ALS are sporadic, lacking any apparent genetic linkage, but 10% are inherited in a dominant manner. Recently, hexanucleotide repeat expansions (HREs) in the chromosome 9 open reading frame 72 (C9orf72) gene were identified as a genetic cause of ALS and frontotemporal dementia (FTD). Importantly, different groups have recently proposed that these mutants affect nucleocytoplasmic transport. These studies have mostly shown the final outcome and manifestations caused by HREs on nucleocytoplasmic transport, but they do not demonstrate nuclear transport dysfunction in real time. As a result, only severe nucleocytoplasmic transport deficiency can be determined, mostly due to high overexpression or exogenous protein insertion. 
This protocol describes a new and very sensitive assay to evaluate and quantify nucleocytoplasmic transport dysfunction in real time. The rate of import of a NLS-NES-GFP protein (shuttle-GFP) can be quantified in real time using fluorescent microscopy. This is performed by using an exportin inhibitor, thus allowing the shuttle GFP only to enter the nucleus. To validate the assay, the C9orf72 HRE translated dipeptide repeats, poly(GR) and poly(PR), which have been previously shown to disrupt nucleocytoplasmic transport, were used. Using the described assay, a 50% decrease in the nuclear import rate was observed compared to the control. Using this system, minute changes in nucleocytoplasmic transport can be examined and the ability of different factors to rescue (even partially) a nucleocytoplasmic transport defect can be determined.

This protocol describes a method to sensitively measure the nucleocytoplasmic transport rate within motor neuron-like NSC-34 cells by quantifying the real-time change in the nuclear import of a NLS-NES-GFP protein.

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all&#39;interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.