Wir bedanken uns bei Jos Burgert für die Hilfe bei einigen der Figuren. Wir danken Ingo Selbach (und der Gruppe &quot;Edelkrebsprojekt NRW&quot;) für seine Bemühungen um das Labor mit Versuchstieren zu versorgen. Wir danken Anna C. Schneider für das Korrekturlesen ersten Versionen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Emmy Noether-Stipendium der DFG SM 206 / 3-1 und dem Start Gewährung der Universität zu Köln für weibliche Dozenten unterstützt.

Diese Dissektion Verfahren ist gemäß der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 22. nd September 2010 (2010/63 / EU). 1. Vorbereitung <ol><li> Erhalten Krebse, Pacifastacus leniusculus (Dana), beider Geschlechter ≥8 cm groß. Stellen Sie sicher, dass die Tiere sind von entscheidender Bedeutung und den Bauch und Bauch Gliedmaßen intakt sind. </li><li> Achten Sie darauf, um den Panzer zu untersuchen und dass diese Schuppenschicht ist hart und steif. Vor- und postmolt Tiere haben einen weichen Panzer und werden, weil während der Häutungsprozess viele Parameter verändern nicht für Experimente geeignet (zB Verringerung der Bewegungsaktivität). </li><li> Montieren Sie alle Werkzeuge und Materialien während der Präparation verwendet, Pinning und desheathing der Nervenstrang in Abbildung 2 dargestellt und in den Ergänzungen geliefert wurde. </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: <strong&gt; Materialien und Werkzeuge für die Zerlegung verwendet, Pinning und desheathing der Nervenstrang. (1) großen Eimer mit Eis gefüllt; (2) Krebse Kochsalzlösung; (3) Kochsalzspender; (4) Dissektionsmikroskop; (5) Dissektion Gericht; (6) starke Schere; (7) Pinzetten (8) Frühling Schere; (9) Petrischale mit klaren Sylgard gesäumten; (10) Befestigungsstifte; (11) kalt Lampenquelle. 2. Brutto-Dissektion <ol><li> Anesthetize Tier auf Eis für 15 - 20 min. Führen Sie den ersten Teil des Brutto-Dissektion bei einem Labortisch in der Nähe der Spüle, da sie einen Schritt Ausbluten und die Probe muss während des Verfahrens regelmäßig mit Flusskrebsen Kochsalzlösung gespült werden. </li><li> Halten Tierbauchseite nach oben und nutzen starke Schere beide Klauen an ihren Basen in der Nähe des Brustkorbs (Abbildung 3-1) zu schneiden. Entfernen Sie links und rechts Uropod (Abbildung 3-2). </li><li> Legen Sie das Tier Bauchseite nach oben in der Dissektion Gericht mit schwarzen Sylgard ausgekleidet. Elevate Cephalothorax indem Eis unter und stecken Sie den Bauch an Telsons (4A). </li><li> Füllen Sie den Salzspender mit ~ 60 ml gekühltes Krebse Kochsalzlösung. Perfuse Krebse mit kalter Kochsalzlösung durch die Krallenöffnung (4B). Überschüssiges Salz wird durch die Einschnitte bei den Uropoden abtropfen. Bedecken Sie Krebse mit Eis während Ausbluten </li><li> Enthaupten das Tier mit einem einzigen Quer schneiden nur die Augen der Tiere mit starken Schere (5A) posterior. Entfernen Sie alle Laufbeinen in der Nähe der Grundgelenke, wie in 5B dargestellt. </li><li> Isolieren Sie den Bauch mit den letzten Thoraxsegmente vom Rest Cephalothorax. Einen ersten Schnitt in der Ebene der zweiten Schreitbeine (Brustsegment 3) durch Einführen der Spitze der Schere in die Öffnung des zweiten Schreitbein und Schneiden auf der gegenüberliegenden Seite. (6A-1). </li><li> Verlängern Sie diesen ersten Schnitt zu beiden Seiten durch ter Cephalothorax (6A-2). </li><li> Klappen Sie den Tier offen machen einige der inneren Organe sichtbar. Drücken Sie die prominente Verdauungsdrüse (6B-3) auf den vorderen Teil der Probe und verwenden Pinzette, um die Fortpflanzungsorgane aus der Bauchhöhle zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie den vorderen Teil des Cephalothorax (6C). Verwenden seitliche Schnitte, die seitlichen Teile des Panzers, die die Kiemen decken auf beiden Seiten des verbleibenden Brustkorb (6D-4) zu entfernen. Entfernen Sie die Kiemen und spülen Sie die Probe mit kaltem Salzlösung. </li><li> Weiterhin die Präparation mit einem Schnitt durch die gesamte Länge des Brustbeinplatte, wie in 6E-5 angegeben. Machen Sie diesen Schnitt bei maximaler seitlichen Positionen zwischen pleuron und swimmerets (6E rote Markierung). Gehen Sie auf der anderen Seite mit einem gleichen Schnitt. Spülen Sie die Probe mit kaltem Salzlösung. </li><li> Führen Sie die verbleibenden Dissektion unter DISSECTIOn Mikroskop. Zeigen Bauch Bauchseite der Flusskrebs ist in der Dissektion Gericht mit schwarzen Sylgard gesäumten und mit Flusskrebsen Kochsalzlösung gefüllt, so dass es die Probe umfasst. HINWEIS: In den folgenden Schritten (2,12 bis 4,8) enthalten Richtungsanweisungen, die Rechtshänder Experimentatoren anzuwenden. In den folgenden Schritten (2,12 bis 6,8) ist es wichtig, Krebse Kochsalzlösung in regelmäßigen Abständen mit kalter Kochsalzlösung zu ersetzen, alle 20-30 Minuten, um das Nervensystem gesund zu halten. </li><li> Befestigen Sie die Probe mit Insektenstifte hinten an der Telson und nach vorn auf die Überreste des Panzers. Legen Sie die Probe, so dass die telson Punkte links und parallel zu der Tischkante. </li><li> Verwenden Grobzange in der linken Hand, um durch eine Laufbeinöffnung (7A) zu packen und ziehen Sie die Probe geöffnet (7B weißer Pfeil). Identifizieren Sie die großen zwei Rückenbeugemuskelstränge (7B-1 und C-1) und schneiden ihre ventraleBasis, wie in 7B gezeigt. </li><li> Identifizieren Sie die Brustbeinschlagader (7C-2), die von Rücken (das Herz), senkt sich auf ventralen, auf der 4. Brustsegment. Diese Arterie liegt direkt über dem Nervenstrang (7C-3), bevor sie Projekte unter dem Nervenstrang und bilden die Bauchschlagader. </li><li> Durchschneiden die Brustbeinarterie. Wie in 7C gezeigt, heben Sie die Arterie ersten, mit einer Klinge der Schere, und nur unterbrochen, wenn das ventral Nervenstrang sichtbar ist. </li><li> Befestigen Sie die Rückenbeugemuskeln nach vorn (nach rechts). Dies sollte in maximal gestreckte Lage mit Stiften getan, damit sie nicht Vision zu sperren und die Probe bleibt gespannt. Wenn die Rückenmuskelstränge fixiert (Figur 8-1), die erste Abdominalganglien, A1 und A2, mit zugeordneten Nerven N1, N2 und N3 sind sichtbar (Figur 8). </li><li> Verwenden einer Pinzette in der linken Hand, um die Spezifikation zu packenimen an einer Öffnung der Laufbeine. In der folgenden Sektion Schritte ziehen Sie vorsichtig, um die Probe offen zu halten. </li><li> Durchschneiden die Nerven N3 an der entferntesten Position von der Nervenstrang. (Bild 8-3). </li><li> Schneiden Sie die Beugemuskeln in der Nähe des ventralen apodeme wie in Abbildung 8-4 gezeigt. Achten Sie darauf, den Nervenstrang oder die Nerven N2 beschädigen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.18 und 2.19 für die Nerven N3 und die Beugemuskeln des verbleibenden Bauchganglien A2 bis A5. </li><li> Bei der letzten Abdominalganglion, A6, schneiden Sie die Rückenbeugemuskeln von der ventralen apodeme und sollte die Probe, wie in Abbildung 9 gezeigt aussehen. </li><li> Schneiden Sie die Sternalplatte posterior an den Nerven der A6 (Bild 9-1) und halten Sie die Bauchteil (Bild 9-2). Entsorgen Sie das Rückenteil mit Beugemuskeln (Bild 9-3). Befestigen Sie die Sternalplatte vorne mit Nadeln durch die Öffnungen der Laufbeinen,und nach hinten bis A6. </li></ol> 3. Fein Dissection <ol><li> Legen Sie die Probe unter dem Mikroskop mit dem vorderen Teil weg gerichtet und den hinteren Teil in Richtung der Tabellen Rand. </li><li> Pinzette benutzen, wie in Figur 10A gezeigt ist, um die vorderen Teile der kephalothorakalen sterna entfernen. HINWEIS: Die Brustganglien und Nerven verbunden sind teilweise durch die Beinmuskulatur und kephalothorakalen sterna bedeckt. Kephalothorakalen sterna bilden ein Gerüst, das die seitlich angeordneten Hohlräume der Laufbeine voneinander und von der medialen Hohlraum, in dem die Bauchmark befindet trennt. </li><li> Schneiden die Muskeln zwischen den verbleibenden exoskeletal Strukturen, wie in 10B angegeben -1 und B2. Verwenden einer Pinzette zu greifen und heben Sie das vordere Ende des Bauchmark (Abbildung 10C). HINWEIS: Der Nervenstrang wird dabei beschädigt werden, vermeiden Abheben des nerve Kabel mehrmals. </li><li> Schneiden Sie die Thorakalnerven seitlich beim Anheben der Nervenstrang (10C-3). Bewahren Sie diese Nerven bei geeigneter Länge für das Feststecken. Entfernen Sie den gepressten Teil der Kette der Ganglien, die sich mit einer Pinzette aufgenommen wurde, durch Wegschneiden alle Gewebe anterior T4 (10C-4). </li><li> Legen Sie die Probe mit dem vorderen Teil auf der linken Seite und konzentrieren sich auf A1. Schneiden die Nerven N1 und N2 von A1 an einer geeigneten Länge (max. 1 cm) dem Pinnen sie aus. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf A2 und identifizieren die Nerven N1, N2 und N3 in diesem Segment (Abbildung 11). Die Nerven N1 Abdominalganglien A2-A5 liegen zwischen zwei Sternalpe kutikulären Einfaltungen in jedes Segment (11A-1) und von Muskeln bedeckt. Machen Sie einen Schnitt entlang der hinteren Brustbein Kutikula Einfaltung. Beginnen am seitlichen Rand der Bauch und dann in Richtung der Mittellinie, wie in 11A gezeigt. </li><li> Wenn die Ziel N1 noch Buchtrot mit Gewebe, wie in Figur 11B (roter Pfeil) gezeigt, entlang der Muskelbündel geschnitten, aber diesmal vorderen sowohl sternal kutikulären Einstülpungen und die Nerven N1 (11B-2). </li><li> Schneiden Nerven N1 als distal wie möglich (11C-3). Nerve N1 vollständig sichtbar ist und die vorderen und hinteren Niederlassung identifiziert werden können (Abbildung 11C). </li><li> Fahren Sie mit der kontralateralen Nerven N1 und ersten Schnitt die Muskeln entlang der hinteren Brustbein Kutikula Einfaltung, beginnend medial, in der Nähe des Ganglion (11D). Wenn der Nerv noch von Gewebe bedeckt ist, auf der Muskelbündel geschnitten, aber diesmal vorderen sowohl sternal kutikulären Einstülpungen und die Nerven N1, ähnlich zu 11B-2 Abbildung. Schneiden Sie den Nerven N1 als distal wie möglich. </li><li> Schneiden Sie die Nerven N2 dieses Ganglion auf eine geeignete Länge (ca. 0,5 cm) für das Feststecken. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,7 bis 3,11 für die Nerven der A3-A5. </li><li> Schneiden Sie den Download vonves von Ganglien A6 als distal wie möglich (Abbildung 12A). Verwenden einer Pinzette, um mehrere Nerven des A6 zu greifen, diese Ganglien heben und starten Isolierung der Kette von Ganglien von der Brustbeinplatte. </li><li> Heben Sie den Nervenstrang, ziehen Sie es vorsichtig in die vordere Richtung wie in 12B (weißer Pfeil) demonstriert. Da die einzelnen Ganglien aufgehoben werden, entfernen Sie die Bauchschlagader, die auf der Bauchseite der Nervenstrang (12C) befestigt werden kann. Setzen Sie diese (leicht) Pull-Schnitt-Sequenz, bis der Nervenstrang ist komplett isoliert. </li><li> Übertragen Sie die isoliert Kette von Ganglien in eine Petrischale mit klaren Sylgard gesäumten und mit Flusskrebsen Salzlösung (12D) gefüllt. </li></ol> 4. abstecken Nervenstrang in die Petrischale HINWEIS: Verwenden Sie kleine Stifte aus Edelstahldraht geschnitten (siehe Ergänzungsmittel), um den Nervenstrang zu befestigen. Berühren Sie nur die Nervenende mit der Zange und nicht squeezE die Verknüpfungen oder Ganglien. <ol><li> Pin der Kette von Ganglien in einer geraden Linie, während leichtem Stretch. </li><li> Ordnen Sie den Nervenstrang in der Petrischale mit der Rückenseite nach oben (Abbildung 13, schwarze Linie). Die ventrale Seite des Ganglien kann durch seine Konvexität identifiziert werden; die Rückenseite ist flach. Stecken Sie die Brustnerven an den Seiten. Weiterhin mit den Nerven A6, Strecken des Nervenstrang entlang seiner Längsachse. </li><li> Pinanordnung die Nerven der A1 in einem 90 ° Winkel relativ zu dem Nervenstrang. </li><li> Fahren Sie mit A2 und Pin die Nerven N2 in einem Winkel von 35 bis 45 ° gegenüber der Nervenstrang (1A). </li><li> Trennen Sie die Nerven N1 in ihrem vorderen und hinteren Äste vor Pinning wie in Abbildung 14 gezeigt. Mit zwei Paar feinen Pinzette zu holen mit einer Pinzette die vordere und mit der anderen den hinteren Ast des Nervus N1. Achten Sie darauf, nur den distalen Ende abholens der Nervenäste. Nun ziehen Sie sie sorgfältig auseinander. </li><li> Pin der vordere Ast des Nervus N1 in einem 90 ° Winkel relativ zu dem Nervenstrang (1A). Pin den hinteren Ast des Nervus N1 zwischen der vorderen N1 Zweig und dem Nerven N2. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,4-4,6 für die Nerven der Ganglien A3-A5. Während Fixierung der Nervenstrang Strecke in Längs- als auch in Querrichtung. </li></ol> 5. Desheathing die Ganglien <ol><li> Stellen Sie das Präparat in der Weise, dass die Hände des Experimentators werden immer auf eine stabile Ebene ruhen, um zu vermeiden Schütteln. Um desheath beleuchten die Ganglien des Nervenstrang von unten. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf jeden Abdominalganglion A1 bis A5. Verwenden Sie feinen Federschere, einen kleinen seitlichen Schnitt durch das Ganglion Mantel machen, posterior zum Ganglion und zwischen die Nerven N2 und N3 (15A roter Pfeil). </li><li> Nehmen Sie den Ganglien Mantel mit sehr fine Pinzette und quer über die Hülle über die Verknüpfungen zu schneiden, wie in 15A-1 angegeben. Achten Sie darauf, nicht zu drücken oder schneiden Sie den Nervenstrang mit der Schere. </li><li> Noch halten und Anheben des Ganglion Mantel mit einer Pinzette es weiterhin entlang der seitlichen Ränder des Ganglion (15B-2 und -3) geschnitten. Entfernen Sie den Mantel. Alternativ Pin es zu beiden Seiten der Verknüpfungen in einer Weise, dass sie befestigt ist aber der Nervenstrang nicht gequetscht. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,2-5,4 für alle Bauchganglien A1 bis A5. </li><li> Desheathe den Brustganglien und die Ganglien A6 in ähnlicher Weise. Um A6 Start vorderen zum Ganglion desheathe und fahren nach posterior. Pin das Ganglion Hülle des A6 bis zum hinteren Ende der Kette von Ganglien. </li></ol> 6. extrazellulären Recordings von Motoneuronen <ol><li> Montieren Sie alle Werkzeuge und Materialien für angezeigt i extrazelluläre Ableitungen verwendetn 16B und in den Ergänzungen aufgeführt. Ein Überblick über die Aufnahme-Setup ist in 16A gezeigt. Starten Sie alle Geräte in diesem Experiment (Abbildung 16C) verwendet, so dass die Verstärker können sich für mindestens 30 Minuten vor der Aufnahme zu wärmen. Schalten Sie den Computer und starten Sie die Aufnahme-Software. </li><li> Die Kette der Ganglien auf dem Mikroskoptisch und beleuchten von unten. Legen Sie die Aufnahme-Elektrode in die Sylgard in der Nähe des Zielnerven und der Referenzelektrode in einer Position in der Nähe, aber lateral der Ganglien (17A und B). Biegen Sie die Zielnerven um die Aufzeichnungselektrode (17C). </li><li> Dehnen Sie den Nerven leicht, um den Kontakt zwischen der Elektrode und dem Nerven gewährleisten und stecken Sie es auf der Seite (B ild 17D). Befestigen Sie die Elektrodenkabel mit dem Mikroskoptisch mit Modelliermasse, so dass sie in der gewünschten Position zu bleiben. </li><li> Verwenden Sie einSpritze mit Vaseline und einer 20-Gauge-Nadel (mit abgerundeten Spitze) gefüllt (17E-3), um das Zielnerven aus der Badlösung zu isolieren. Erste dab etwas Vaseline auf die Sylgard um die Aufzeichnungselektrode. Das Ergebnis ist eine Schicht Vaseline Abdecken der Sylgard in der Nähe der Aufzeichnungselektroden (17E-4). Achten Sie darauf, direkt auf die Nerven in dieser Schicht tupfen und vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Verschließen Sie die Aufzeichnungselektrode mit Vaseline von allen Seiten bis an die Oberfläche Ebene der Kochsalzlösung (17F). </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zielnerven, deren Aktivität überwacht werden soll. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. Verwenden Sie eine kontinuierliche oder eine Lücke frei Erfassungsmodus und eine Abtastrate von 5 kHz. Set für die extrazelluläre Verstärkers mit den folgenden Parametern; gewinnen, um 1000 (verstärkt das Signal 1000 mal darauf achten, dass diese Verstärkungsparameter in den Erfassungssoftware Einstellungen umfassen) einda Bandpassfilter Bereich von 300 Hz (Low Cut) auf 2000 Hz (high cut). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> Die Anatomie der Krebse und ihre Bauchganglien zuvor 5, 18, ​​19, 20 beschrieben, und es wird empfohlen, vor der Dissektion, um Schneiden von wichtigen Nerven zu vermeiden mit ihnen vertraut machen. Es ist entscheidend, um die Vorbereitung bei Temperaturen unter 23 ° C zu halten, um den Abbau des isolierten Nervenstrang zu vermeiden. Dies kann einfach durch Austausch der Badlösung alle 20-30 min mit kaltem Krebse Salz erreicht werden. Unter diesen Umständen ist die Ke...

Die swimmerets von Krebsen dienen eine Funktion in Lageregelung und schlugen rhythmisch, wenn die Tiere schwimmen freuen, lüften ihre Höhlen oder Weibchen ihre Eier belüften 5, 6. Die swimmerets der Signalkrebs, Pacifastacus leniusculus treten paarweise vom zweiten bis zum fünften Abdominalsegment, mit einem Schenkel auf jeder Seite des Bauches 7. Das Zentralnervensystem produziert eigener rhythmischen Motor Rüttler, der die swimmeret Bewegung in intakten Tier als auch in der isolierten Nervenstrang Herstellung antreibt. Wenn es keine sensorische Rückmeldung oder absteige gegenwärtigen Eingangs die erzeugte rhythmische Motormuster heißt fiktive Lokomotion 1, 2. Im swimmeret System dieser Motor Muster nicht in jedem Parameter aus der Aktivität der swimmerets im intakten Tier gemessen abweichen. Die Bewegung jedes swimmeret wird durch eine Mikroschaltung, die in sich und mit einem c beschränkt angetriebenhenden hemiganglion. 1 - 3 In jedem Mikro es eine Mustererzeugungs Kernel, der fünf identifizierten nicht Spiking Inter umfasst. Sie können funktionell als charakterisiert werden entweder Inhibitor of Power Stroke (IPS) oder Inhibitor of Return Stroke (IRS) 8. Diese IPS und IRS Inter nicht endogene Oszillatoren, sondern ihre Wechselaktivität wird durch reziproke Hemmung 9 angetrieben. Da diese Inter direkt hemmen die swimmeret Motoneurone wird die Wechsel PS-RS Bewegung erzeugt 10. Locomotion jedoch erfordert nicht nur die Erzeugung der Aktivität, sondern auch die Koordination der verschiedenen unabhängigen Mikroschaltungen. Im swimmeret System wird von der koordinierenden Mikroschaltung, die gewährleistet, dass Gliedmaßen richtigen Zeiten aktiv sind, eine solche Koordinierung etabliert. Diese Mikroschaltung wird von drei identifizierten Neuronen in jedem Segment 11 bis 15 aufgebaut. Dieses Protokoll sieht the erstmals ein Schritt-für-Schritt-Dissektion Führung, um die Kette der Ganglien (T4 bis A6, 1) zu isolieren. Wir zeigen, wie man den Stift isoliert Bauchnervenstrang und desheathe jedes Ganglion. In diesem isoliert Nervensystem Vorbereitung sind die Neuronen für swimmeret Bewegung verantwortlich bereit für den Einsatz in elektrophysiologischen und morphologischen Experimente. Der zweite Teil dieses Protokolls zeigt die Hauptmerkmale des Motor swimmeret Muster. Dies beinhaltet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum extrazellulär Rekord die Aktivität swimmeret Motoneuronen. Axone RS Motorneuronen projizieren durch den vorderen Ast von Nerven N1, während Axone PS Motorneuronen projizieren durch den hinteren Ast desselben Nerven (Abbildung 1) 4. Daher kann ihre Tätigkeit den folgenden Buchhandlungen mit Differenzstiftelektroden aufgezeichnet werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" /><br/&gt; 1: Getrenntes Nervensystems aus Brustganglion 4 (T4) zu Abdominalganglion 6 (A6) und ein schematisches Diagramm davon T4. Brustganglion 4; T5: thorakalen Ganglion 5; A1, A2 ... A6 Abdominalganglion 1, Abdominalganglion 2 ... Abdominalganglion 6; N1: Nerven N1; N2: Nerven N2; N3: Nerven N3; PS: Macht-Takt; RS: Rücktakt. Directional Abkürzungen: A = Front; P = posterior. Diese Dissektion Verfahren und die elektrophysiologische Technik gezeigt, sind geeignet für Studenten und Schüler können Praktika in der Physiologie zu ergänzen. Die isolierte Kettenganglien wurde in einer Reihe von Versuchen verwendet worden, um Funktion des Nervensystems, Koordination oder Modulation swimmeret Mikro 6 sowie neuronalen Steuerung der adaptiven Verhaltens der Lokomotion 16, 17 untersucht werden. Das Krebs swimmeret System stellt somit einen enormen von interessanten Unterricht oder tregnet Möglichkeiten, die alle beginnen mit der Präparation der Bauchmark von Flusskrebsen und extrazelluläre Aufnahme der fiktiven Motor Muster.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Type</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:103px;">Comments/&#160;&#160; Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">4-channel extracellular amplifier: MA 102&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Amplifier</td>
			<td style="width:139px;">Elektroniklabor, Zoologie, Universit&#228;t zu K&#246;ln, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:131px;">air-table</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;">Technical Manufacturing Corporation 
			(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA</td>
			<td style="width:103px;">63-534</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">Axon Digidata 1440A</td>
			<td style="width:131px;">Digitizer</td>
			<td style="width:139px;">Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td>
			<td style="width:103px;">DD1440A</td>
			<td style="width:103px;">digitizes recorded signals&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">big bucket&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">filled with ice</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Clampex &#38; Clampfit</td>
			<td style="width:131px;">pClamp 10, recording and analysis software</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Devices Design, Union City, CA</td>
			<td style="width:103px;">pClamps 10 Standard</td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">cold lamp source</td>
			<td style="width:131px;">with flexible light guide (fiber optic bundle)&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Euromex microscopes holland, Arnhem, BD</td>
			<td style="width:103px;">LE.5211 &#38; LE.5235</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">computer and monitor</td>
			<td style="width:131px;">equipped with recording software</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">container and pipette for liquid waste&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:131px;">crayfish saline&#160;</td>
			<td style="width:131px;">contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">always keep at temperatures ~ 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable)</td>
			<td style="width:131px;">fluorescent dye, lysine fixable</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:103px;">D3328</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular dyefill of neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">differential pin electrodes</td>
			<td style="width:131px;">made from stainless steel &#632; 0.2 mm</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">dissection dish&#160;</td>
			<td style="width:131px;">(l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">used in the gross disection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">faraday cage</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">fixing pins</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for pinning the specimen</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">forceps (biology, Dumont #5)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11252-20</td>
			<td style="width:103px;">fine forceps: used to pick nerves</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">forceps (biology, Dumont #55)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11255-20</td>
			<td style="width:103px;">extra fine forceps: used for desheathing</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">forceps (electronic, Dumont #5)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11251-20</td>
			<td style="width:103px;">coarse forceps:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; used to grab specimen and pins</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:131px;">intracellular electrode</td>
			<td style="width:131px;">Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instruments, Novato, CA</td>
			<td style="width:103px;">BF100-50-10</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular recording and dyefill of neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Leica S8 Apo StereoZoom</td>
			<td style="width:131px;">Dissection Microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Zoom 1x - 8x</td>
			<td style="width:139px;">Leica, Germany</td>
			<td style="width:103px;">10446298</td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">microscope table</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">mirror</td>
			<td style="width:131px;">to illuminate preparation from below</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">modeling clay</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Olympus SZ61</td>
			<td style="width:131px;">Dissection Microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Zoom 0.67x - 4.5x</td>
			<td style="width:139px;">Olympus, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for the dissection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">petri dish&#160;</td>
			<td style="width:131px;">94 x 16 mm; lined with clear silicone</td>
			<td style="width:139px;">Greiner bio-one, Germany</td>
			<td style="width:103px;">633180</td>
			<td style="width:103px;">used to pin the isolated chain of ganglia</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">ring scissors</td>
			<td style="width:131px;">ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">14054-13</td>
			<td style="width:103px;">for gross dissection&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (steps 2.1 - 2.11)</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">saline dispenser&#160; with a 16 gauge needle (outer &#632; 1.6mm) attached via a flexible tube.</td>
			<td style="width:131px;">Volume ~ 60ml,</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">used for exsanguination</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:131px;">spring scissors or alternative: Vannas spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">15024-10 or&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15000-08</td>
			<td style="width:103px;">for desheathing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">stainless steel wire &#632; 0.125 mm&#160;</td>
			<td style="width:131px;">to cut pins of 4-7 mm length</td>
			<td style="width:139px;">Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for pinning of the nerve cord</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:131px;">student Vannas&#160; spring scissors or alternative:&#160; Moria Spring Scissors</td>
			<td style="width:131px;">cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">91500-09 or&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15396-00</td>
			<td style="width:103px;">for gross and fine disection&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (steps 2.11 - 3.14)</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">sylgard</td>
			<td style="width:131px;">184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon</td>
			<td style="width:139px;">Dow Corning, Midland, MI, USA</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the swimmeret system of crayfish: a practical guide for the dissection of the nerve cord and extracellular recordings of the motor pattern

Hier zeigen wir die Dissektion der Krebse Bauchnervenstrang. Die Herstellung umfasst den letzten zwei Thoracalganglien (T4, T5) und die Kette der Abdominalganglien (A1 bis A6). Diese Kette von Ganglien umfasst den Teil des zentralen Nervensystems (ZNS), die koordinierte Bewegungs der Pleopoden (swimmerets) treibt: der swimmeret System. Es ist für mehr als fünf Jahrzehnten, die in Flusskrebse jeweils swimmeret wird durch eine eigene, unabhängige Mustererzeugungs Kernel, der rhythmischen Wechselaktivität 1-3 erzeugt angetrieben bekannt. Die Motoneuronen innervieren die Muskulatur jeder swimmeret anatomisch und funktionell unterschiedliche Populationen 4 umfassen zwei. Einer ist für den Rückzug (Arbeitstakt, PS) des swimmeret verantwortlich. Die andere treibt die Verschleppung (Rücklauf, RS) des swimmeret. Motoneuronen des swimmeret Systems sind in der Lage, spontan eine fiktive Motor Muster, welches identisch mit dem in vivo aufgezeichnete Muster ist </em&gt; 1. Das Ziel dieses Berichts ist es, eine interessante und bequeme Modellsystem zur Untersuchung Rhythmus erzeugenden Netzwerke und Koordination von unabhängigen Mikroschaltungen aus praktischen Laborkurse Schüler einzuführen. Die zur Verfügung gestellten Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Präparation der Bauchnervenstrang der Krebse ist, Pinning der isoliert Kette von Ganglien, desheathing die Ganglien und die Aufzeichnung der swimmerets fiktiven Motor Muster extrazellulär aus dem isolierten Nervensystem. Darüber hinaus können wir die Aktivität von Neuronen swimmeret intrazellulär von Dendriten, aufgezeichnet. Hier beschreiben wir kurz auch diese Techniken und stellen einige Beispiele. Weiterhin kann die Morphologie swimmeret Neuronen mit Färbetechniken beurteilen. Hier stellen wir Beispiele für intrazelluläre (durch Iontophorese) Farbstoff gefüllt Neuronen und Hinterfüllungen von Pools von swimmeret Motoneuronen. In unserem Laborwir diese Vorbereitung auf die Grundfunktionen des fiktiven Fortbewegung, die Wirkung der sensorischen Rückmeldung über die Aktivität des ZNS, und die Koordinierung zwischen Mikroschaltungen auf zellulärer Ebene zu untersuchen.

Mit der gleichzeitigen extrazelluläre Ableitungen von RS und PS, Motorneuronen von einem Ganglion, das Wechselaktivität dieser Motorneuronenpools, kann überwacht werden (Abbildung 18), die die fiktive Fortbewegungsmuster. <img alt="18" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" /> Abbildung 18: Schematische Darstellung einer Ganglien und Platzierung der Differenzstiftelektrode extrazellulären Aufzeichnung von RS Motorneuronen (obere Kurve) ...

Watch this Scientific Journal Video about The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern at JoVE.com

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Die swimmeret System der Crayfish: Ein praktischer Leitfaden für die Dissektion der Nervenstrang und extrazellulären Recordings der Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

the-swimmeret-system-crayfish-practical-guide-for-dissection-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Aufrufe.  University of Cologne. Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons. 

Serie: The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Physiologische Aufnahmen von High-und Low Output NMJs auf der Crayfish Leg Streckmuskel

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a connection between amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and impairments in the nucleocytoplasmic pathway. ALS is a neurodegenerative disease affecting the motor neurons and resulting in paralysis and ultimately in death, within 2-5 years on average. Most cases of ALS are sporadic, lacking any apparent genetic linkage, but 10% are inherited in a dominant manner. Recently, hexanucleotide repeat expansions (HREs) in the chromosome 9 open reading frame 72 (C9orf72) gene were identified as a genetic cause of ALS and frontotemporal dementia (FTD). Importantly, different groups have recently proposed that these mutants affect nucleocytoplasmic transport. These studies have mostly shown the final outcome and manifestations caused by HREs on nucleocytoplasmic transport, but they do not demonstrate nuclear transport dysfunction in real time. As a result, only severe nucleocytoplasmic transport deficiency can be determined, mostly due to high overexpression or exogenous protein insertion. 
This protocol describes a new and very sensitive assay to evaluate and quantify nucleocytoplasmic transport dysfunction in real time. The rate of import of a NLS-NES-GFP protein (shuttle-GFP) can be quantified in real time using fluorescent microscopy. This is performed by using an exportin inhibitor, thus allowing the shuttle GFP only to enter the nucleus. To validate the assay, the C9orf72 HRE translated dipeptide repeats, poly(GR) and poly(PR), which have been previously shown to disrupt nucleocytoplasmic transport, were used. Using the described assay, a 50% decrease in the nuclear import rate was observed compared to the control. Using this system, minute changes in nucleocytoplasmic transport can be examined and the ability of different factors to rescue (even partially) a nucleocytoplasmic transport defect can be determined.

This protocol describes a method to sensitively measure the nucleocytoplasmic transport rate within motor neuron-like NSC-34 cells by quantifying the real-time change in the nuclear import of a NLS-NES-GFP protein.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.