Esta labor fue apoyada por las subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 y RU-1652 / 1-1. Agradecemos Doreen mayo de asistencia técnica excelente y la compañía Dyomics GmbH, Jena por su amable apoyo.

NOTA: Todos los procedimientos son aprobados por el comité regional de los animales y de acuerdo con las directrices internacionales sobre el uso ético de los animales. 1. Preparación de los materiales e instrumentos <ol><li> Preparación de la dispersión de vesículas formada espontáneamente (SFV) <ol><li> Disolver y preparar soluciones madre de las siguientes fosfolípidos: 214 mg / ml de fosfatidilcolina de huevo (EPC), 134 mg / ml de colesterol, 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - [metoxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amonio) (mPEG 2000 DSPE) y 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 il) (sal de amonio) (NBD-DOPE) en cloroformo y guardar en frascos de vidrio. </li><li> Proporcionar aproximadamente 3 ml de cloroformo en un matraz de fondo redondo y transferir el volumen apropiado de solución madre de fosfolípidos en el matraz de fondo redondo para preparar liposomas compuestos de EPC: Chol: mPEG 2000 DSPE en una relación molar de 6,5: 3: 0,5. Para el marcaje doble fluorescencia de los liposomas añadir 0,3% en moles NBD-DOPE a la solución de los lípidos. </li><li> Evaporar el cloroformo de la solución de fosfolípido orgánico bajo presión reducida (300 mbar) a 55 ° C usando un evaporador rotatorio. </li><li> Después se forma una película homogénea de fosfolípidos, reducir la presión a 10 mbar durante 1-2 horas para eliminar el depósito de cloroformo residual. </li><li> Mientras que el cloroformo se evapora, se disuelve DY-676-COOH (6,181 M) en 10 mM de tampón Tris pH 7,4 y llenar un recipiente Dewar con nitrógeno líquido. Encienda un baño de ultrasonidos y se fijará en 50 ° C. </li><li> Transferir un volumen apropiado (0,5-1 ml) de solución al matraz de fondo redondo para hidratar la película de fosfolípidos seco y agitar vigorosamente hasta que una vesícula formada espontáneamente (SFV) formas de dispersión DY-676-COOH (6,181 M). Asegúrese de que todos los fosfolípidos se dispersan para evitar la pérdida de lípidos. </li><li> Cuidadosamente transfer el matraz de fondo redondo que contiene la dispersión SFV en nitrógeno líquido y congelar la dispersión durante 3-5 min. Colocar el matraz de fondo redondo en un baño de ultrasonidos a 50 ° C para descongelar la dispersión luego agite la dispersión vigorosamente durante 1-2 minutos. Repita este procedimiento seis veces, haciendo un total de siete ciclos de congelación y descongelación. </li></ol></li><li> Extrusión de SFV para formar vesículas de liposomas homogéneos <ol><li> Transferir la dispersión de SFV en un 1 ml jeringa (jeringa a) y extruir la dispersión a través de una membrana de policarbonato de 100 nm utilizando un extrusor de LiposoFast básica en la jeringa-b. </li><li> Extruir la dispersión de la jeringa-b, de nuevo en una jeringa, y luego repetir el ciclo de diez veces. Debido a la extrusión, la solución en los cambios de jeringa de un aspecto turbio a una dispersión clara con el tiempo. Después de diez ciclos (veinte pasos de extrusión individuales) retire la jeringa-b del dispositivo y extruir la dispersión por última vez desde una jeringa directamente en una estéril1,5 ml tubo de reacción. </li></ol></li><li> Purificación de encapsulado liposomal DY-676-COOH de colorante libre <ol><li> Preparar una columna de cromatografía de gel utilizando cuentas G25 empapados en 10 mM Tris pH 7,4 (columna de longitud 28 cm, diámetro 0,8 cm). </li><li> Transferir 0,5 ml de dispersión vesicular extruido sobre la cama de gel y dejar que el drenaje de la muestra en la matriz de gel. </li><li> La elución de los liposomas con 10 mM tampón Tris pH 7,4 (Figura 1A) y se lava la columna hasta los drenajes colorante libre completamente fuera de la columna. Si es necesario, recoger y reciclar el tinte libre por la desalación y la deshidratación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Concentrar los liposomas eluidas por ultracentrifugación (200.000 xg, 2 horas a 8 ° C) a continuación, dispersarlos en el volumen adecuado de pH estéril 10 mM de tampón Tris, 7,4. </li></ol></li><li> La cuantificación de la concentración de encapsulado DY-676-COOH <ol><li> Preparar una curva de calibración mediante la disolución de DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) en 10 mM de tampón Tris, pH 7,4 que contiene 0,1% de Triton X100. </li><li> Disolver 2 l (100 nmol final de lípidos de un / L de stock 50 mmol) de los liposomas durante 5 min a temperatura ambiente en 100 l de tampón Tris que contiene 1% de Triton X100 para destruir las vesículas y suelte el colorante encapsulado. Luego diluir las muestras con 10 mM de tampón Tris, pH 7,4 a una concentración final de Triton-X100 de 0,1% (v / v) hacer un volumen total de 1 ml. Preparar todas las muestras por duplicado. </li><li> Medir la absorción y emisión de todas las muestras (gratis DY-676-COOH y Triton-X100 tratada liposomas) a una excitación λ = 645 nm y una emisión λ = 700 nm. Establecer y utilizar una curva de calibración del tinte libre de determinar la concentración de colorante encapsulado. </li></ol></li><li> Caracterización de liposomas <ol><li> Determinar el tamaño y el potencial zeta de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica. Diluir las muestras de liposomas con filtro esterilizado (0,2 micras) tampón 10 mM Tris pH 7,4 a aconcentración de 100-300 micras (lípidos). Transferir las muestras diluidas en una cubeta desechable de bajo volumen y medir la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Caracterizar los liposomas por microscopía electrónica para sustanciar el tamaño, la integridad y la homogeneidad de las vesículas liposomales de acuerdo con protocolos estándar. </li></ol></li></ol> 2. Validación de fluorescencia de enfriamiento rápido y activación de los liposomas preparados <ol><li> Análisis físico-químico de extinción de la fluorescencia y la activación <ol><li> Prepare dos tubos de 1,5 ml para el Lip-Q y 2 tubos para la libre DY-676-COOH. Transferencia de 100 nmol de lípidos totales (2,38 l de una solución / L Lip-Q Stock 42 mmol, que contienen 138 mg / ml del encapsulado DY-676-COOH) en los tubos correspondientes. Traslado gratuito DY-676-COOH equivalente al contenido de colorante de Lip-Q (0,38 g que se traduce, por ejemplo, de 138 g / l 1,000 x 2,38 l Lip-Q se utiliza). Incubar una bañerae de cada sonda a 4 ° C y congelar el segundo tubo a -80 ° C durante la noche (16 hr). </li><li> Calentar un bloque de calentamiento a 30 ° C. Llenar una caja de enfriamiento con hielo triturado y equilibrar una alícuota de tampón Tris 10 mM pH 7,4 a temperatura ambiente. </li><li> Retire las sondas de 4 ° C y se equilibren a temperatura ambiente (envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz) y rápidamente descongelar sondas de -80 ° C a 30 ° C durante 5 min. Enfríe las sondas descongelados en hielo durante 1 minuto antes de transferirlos a la temperatura ambiente (también envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz). </li><li> Añadir 10 mM de tampón Tris (pH 7,4) a cada una de las sondas a 100 l de volumen final y equilibrar todas las sondas a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Pipetear 80 l de cada sonda en una cubeta de vidrio de bajo volumen y medir la absorción de cada sonda 400 a 900 nm en un espectrómetro. Devuelva la sonda a sus correspondientes tubos. </li><li> Transferir 80 l de cada sonda en una cubeta de vidrio adecuadoy medir la emisión de fluorescencia en un espectrofluorómetro por emocionantes las sondas a 674 nm y midiendo la fluorescencia de 694 a 800 nm. </li></ol></li><li> La captación celular y la activación de fluorescencia <ol><li> Obtener y la cultura las siguientes líneas de células en su medio de cultivo correspondiente de acuerdo con condiciones estándar (37 ° C, 5% de CO 2 y el 95% atmósfera húmeda). Aquí, utilice el J774A.1 murino línea celular de macrófagos (modificado de Dulbecco medio de Eagle suplementado con 10% (v / v) de suero de ternera fetal), la línea celular de glioblastoma humano, U-118 mg (MEM que contiene vitaminas esenciales y 10% (v / v) de suero de ternera fetal) y la línea celular de fibrosarcoma humano, HT-1080 (RPMI con 5% de FCS). </li><li> Escudo de 8 pocillos cámara de diapositivas con poli-L-lisina (añada 100 l 0,001% de poli-L-lisina a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 10 minutos. Aspirar solución y deje que los portaobjetos de cámara se sequen durante al menos 4 hr a RT sobre un banco de trabajo estéril. Enjuague los portaobjetos de cámara 3veces con solución salina tamponada con 200 l de Hank luego sellar con parafina y papel de aluminio y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario. </li><li> Mientras que los portaobjetos de cámara están secando, filtro-esterilizar los liposomas y solución de colorante y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario. </li><li> Para el análisis de la absorción de la sonda con todo el cuerpo vivo sistema de imágenes de fluorescencia en NIR, preparar 5 matraces de cultivo pequeños para cada una de las 3 líneas celulares de ensayo (15 frascos en total). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg y células HT-1080 por matraz de cultivo con 5 ml de medio de cultivo respectivo (en quintuplica) y crecen durante 16-24 h. Paralelo a los frascos de cultivo, sembrar 30.000 células de cada línea celular (J774A.1 y HT-1080) o 20.000 células (T-118 mg) a 2 pocillos de la diapositiva cámara respectivamente y crecer en un medio de cultivo de 500 l de 16 a 24 h . </li><li> Al día siguiente, añadir 100 nmol (importe final de lípidos) de Lip-Q para 2 frascos por línea celular y a un pocillo de cada línea celular en la diapositiva cámara.Inmediatamente transferir matraz de 1 por cada línea celular a 4 ° C y el segundo matraz de nuevo a la incubadora. NOTA: El volumen de las sondas añadió a los matraces y los portaobjetos de cámara son los mismos, haciendo que la concentración en la cámara de diapositivas 10 veces mayor (5 ml es 500 l de medio de cultivo). Esto es necesario porque la detección microscópica es menos sensible que el sistema de imágenes de fluorescencia NIR donde se crean imágenes de sedimentos celulares de los matraces. </li><li> Añadir la libre DY-676-COOH en una concentración equivalente al contenido de colorante de Lip-Q a las células en 2 matraces por línea celular y a un pocillo de cada línea celular en el portaobjetos de cámara, a continuación, transferir inmediatamente matraz de 1 por línea celular a 4 ° C (agotamiento de la energía) y el otro matraz junto con la corredera cámara posterior a la incubadora. Incubar todas las células durante 24 horas a las condiciones correspondientes. Las células en el matraz sin sonda servir como control sin tratar. </li></ol></li><li> NIRF imágenes y análisis semi-cuantitativo <ol><li> Después de 24 horas de duración de la incubación, recoger las células en frascos lavando las células 2 veces con solución salina tamponada Hanks (HBSS) luego raspar las células en 500 l HBSS y precipitado mediante centrifugación (5 min a 200 x g) en 500 tubos mL. </li><li> Colocar los tubos con los gránulos de las células (y HBSS) en una cámara NIRF y de imágenes utilizando filtros de excitación (615-665 nm) y emisión (corte de&gt; 700 nm). </li><li> Deducir la autofluorescencia y evaluar la intensidad de la diana frente autofluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto dará a los niveles semi-cuantitativos de la intensidad de fluorescencia como media de la señal (recuentos de escalado / seg), que representa los niveles de recuento después de la escala de tiempo de exposición, ganancia de la cámara, binning y la profundidad de bits, de modo que las mediciones son comparables entre sí. </li></ol></li><li> Análisis microscópico confocal <ol><li> Después de 24 horas de incubación, recoger las células en la cámara de diapositivas mediante lavado 2 veces con 500 l HBSS. </li><li> Fijar la ceLLS con 200 l de HBSS que contiene 3,7% (v / v) de formaldehído durante 30 min a TA. </li><li> Mientras que la fijación está pasando, diluir la mancha de ADN, Hoechst-33258 1:50 con solución de montaje. </li><li> Después de la fijación, se lavan las células 2 veces con HBSS luego se separan las cámaras de los portaobjetos de vidrio. Añadir solución de montaje 50 l que contiene el ADN de mancha en cada lugar correspondiente a los pocillos de los portaobjetos de cámara. Cubra las células con cubreobjetos de vidrio, sellar los bordes con esmalte de uñas transparente y durante 10 minutos de secado al aire a temperatura ambiente (oscuro). </li><li> Células de imagen en un microscopio de fluorescencia adecuado o un microscopio confocal. Utilice los siguientes parámetros de excitación y emisión para la visualización de los componentes correspondientes: núcleos (Hoechst-33258: excitación 405 nm, emisión 420-480 nm). NBD-DOPE (liposomal de lípido: excitación 488 nm, emisión 530 nm). DY-676-COOH (NIR tinte fluorescente: excitación 633-645 nm, emisión 650-700 nm). NOTA: Asegúrese de que el microscopio de fluorescencia unvailable está equipado con filtros adecuados que permiten la excitación y emisión de longitudes de onda superiores a 630 nm. </li></ol></li></ol> 3. liposomas basados ​​en fluorescencia in vivo Imaging de Inflamación <ol><li> Preparación de los animales y materiales <ol><li> Casa 8-12 semanas de edad, los ratones NMRI macho que pesaban aproximadamente 36 g en condiciones estándar con comida y agua ad libitum. </li><li> Siete días antes del inicio de los experimentos, dar a todos los ratones una dieta baja feofórbido a fin de reducir la autofluorescencia del tejido. </li><li> Veinticuatro horas antes del comienzo de cada experimento, los ratones afeitarse en el área deseada (por ejemplo, zona de la espalda todo si se desea obtención de imágenes de edema pata trasera). </li><li> Pesar los animales y calcular la cantidad de sonda para ser inyectada por ratón (Lip-Q y Lip-dQ a 10 mol (concentración de lípidos) por kg de peso y libre DY-676-COOH (equivalente a teñir contenido de Lip-Q utiliza) . </li><li> Imagen de los animalesun cuerpo entero NIR de fluorescencia de imágenes con los mismos ajustes utilizados para los sedimentos celulares. Esta medida ofrece la autofluorescencia de los animales. </li><li> Disolver 10 mg zymosan A en 1 ml de solución salina isotónica y almacenar durante la noche a 4 ° C. </li></ol></li><li> La inducción de la inflamación y la formación de imágenes in vivo NIRF <ol><li> Preparar 3 jeringas por ratón que contienen las siguientes soluciones. Llene una jeringa con 50 l zymosan Una solución (10 mg / ml) y la segunda jeringa con 50 l de solución salina isotónica. Llene la tercera jeringa con las sondas, por el que Lip-Lip-Q y dQ (10 mmol / kg de peso (lípido)) están designados para animales de prueba y gratis DY-676-COOH (concentración que en Lip-Q) para los animales de control. Asegúrese de que las sondas se diluyeron con HBSS estéril a 150 l de volumen final. </li><li> Aplicar crema para los ojos en los ojos de los animales para evitar la sequedad y anestesiar a los animales con un 2% de isoflurano hasta que están profundamente dormidos y no reaccionan cuando se toca en las patas (esto toma alrededor de 2 minutos). </li><li> Coloque el ratón sobre una estera caliente (todavía bajo anestesia) e inyectar el zymosan-A por vía subcutánea solución en la pata trasera derecha y la solución salina en la pata trasera izquierda. Inyectar inmediatamente la sonda intravenosa y la imagen del animal a partir de entonces a continuación, un tiempo récord de inyección / medición (como t = 0 h). Guarde las imágenes resultantes como cubos de imagen y repita los pasos anteriores para el resto de los animales y de las respectivas sondas. </li><li> Imagen de los animales cada 2 h después de la inyección de 10 horas ya las 24 horas después de la inyección, asegurándose de que la etapa de la cámara de medición está caliente (por ejemplo, mediante la colocación de una alfombra cálida debajo), con el fin de evitar la hipotermia. Después de cada medición, colocar los animales en una jaula con comida y agua ad libitum y colocar la jaula en una cámara de animales templado. La eutanasia a los animales por primera anestesiante con isoflurano al 2% hasta los animales ya no reaccionan al tacto, a continuación, la eutanasia con dióxido de carbono durante 5-10 minutos, lo que haceasegurarse de que los animales dejan de respirar por completo y el rigor mortis se produce. </li><li> Diseccionar los ratones de acuerdo con protocolos estándar, que pueden ser evaluados en línea (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) y la imagen de los órganos. </li><li> Evaluar los resultados de medición de acuerdo con las instrucciones del fabricante por primera deducción de la fluorescencia general de los animales (desmezcla), entonces las regiones asignación de interés para la autofluorescencia (de izquierda pata trasera con solución salina) y el objetivo de fluorescencia del área inflamada (pata trasera derecha con zymosan-A). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Desde liposomas también pueden servir como sistemas de liberación para los tintes fluorescentes, que permiten imágenes de las enfermedades diana. La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF, DY676-COOH se utiliza aquí, conduce a un alto nivel de extinción de fluorescencia del colorante atrapado. Extinción de fluorescencia, un fenómeno visto con muchos fluoróforos en alta concentración puede ser explotado en varias aplicaciones de imagen en vivo, d...

Los liposomas se han investigado intensamente y servir como uno de los sistemas de administración de fármacos biomédicos más biocompatibles para aplicaciones clínicas 1,2. Ellos se componen principalmente de fosfolípidos y colesterol, ambos de los cuales son compuestos biocompatibles que imitan partes de las membranas celulares naturales. Considerando que las sustancias hidrófilas pueden ser atrapados en el interior acuoso, agentes lipófilos pueden incorporarse dentro de la bicapa fosfolipídica liposomal 3. La encapsulación de sustancias dentro del interior acuoso de los liposomas otorga protección contra la degradación in vivo y también evita que el sistema anfitrión de los efectos tóxicos de los fármacos citotóxicos utilizados para la terapia de enfermedades, por ejemplo agentes quimioterapéuticos destinados a destruir las células tumorales. La modificación de la superficie liposomal con polímeros como el polietilenglicol (PEGilación) se extiende aún más el tiempo de circulación de la sangre liposomal in vivo debido a la estabilización estérica 4. Moreover, los liposomas pueden secuestrar altas concentraciones de varias sustancias como proteínas 5,6, sustancias hidrófilas 7,8 y enzimas 9. Por lo tanto, sirven como herramientas terapéuticas y de diagnóstico clínico como fiables que merecen su aprobación para la entrega de fármacos citotóxicos tales como doxorrubicina para la terapia del cáncer 4. Debido a su flexibilidad, los liposomas también se pueden cargar con fluorocromos para fines de diagnóstico y quirúrgicos guiados por imagen. Imágenes de fluorescencia proporciona una solución rentable y no invasiva herramienta de diagnóstico in vivo que, sin embargo, exige algunos requisitos básicos en. Se pudo demostrar que fluorocromos que se adaptan mejor para formación de imágenes in vivo tienen una absorción característica y máximos de emisión en el rango donde dispersión de la luz y la dispersión, así como la autofluorescencia de tejidos de origen del agua y de la hemoglobina es baja. Por lo tanto, dichas sondas tienen sus máximos de abs / em entre 650 y 900 nm 10.<html> Además de esto, la estabilidad de los fluorocromos tanto in vitro como in vivo es crítica, como la opsonización y eliminación rápida pueden limitar en gran medida su aplicación para las imágenes in vivo 11. Otros efectos como la mala estabilidad y baja sensibilidad o efectos citotóxicos en órganos diana como se ha visto con el verde de indocianina (ICG) 12-16, son no deseados y deben tenerse en cuenta al diseñar sondas para imágenes in vivo. Estas observaciones han conducido al desarrollo activo de varios fluorocromos NIR preclínicos, nanopartículas, así como nuevas técnicas para la formación de imágenes in vivo de procesos inflamatorios, cáncer y para la cirugía guiada por imagen 17-20. A pesar de la estabilidad de la mayoría (fluorescencia del infrarrojo cercano) NIRF preclínica colorantes in vitro, su rápida perfusión y el aclaramiento a través del hígado y el riñón impiden su uso en la formación de imágenes ópticas in vivo de enfermedades y procesos inflamatorios. ntent &quot;&gt; Por lo tanto, presenta un protocolo para la encapsulación de fluorocromos como el bien caracterizado en el infrarrojo cercano tinte fluorescente DY-676-COOH, conocido por su tendencia a la auto-interferencia a concentraciones relativamente altas 21 en liposomas. En altas concentraciones H- la formación de dímero y / o pi-interacciones de apilamiento entre las moléculas fluoróforo situadas dentro de resultado de cada uno radio de Förster en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre las moléculas de fluorocromo. A baja concentración el espacio entre las moléculas de fluoróforo se incrementa, impidiendo de este modo la interacción pi-apilado y -H formación de dímero y resultando en una alta emisión de fluorescencia. El interruptor entre alta y baja concentración y la extinción de la fluorescencia que acompaña y la activación es una estrategia prometedora que puede ser explotado para la formación de imágenes ópticas 22. A este respecto, la encapsulación de altas concentraciones del colorante NIRF DY-676-COOH en el interior acuoso de los liposomas es más favorable para formación de imágenes in vivo que el colorante libre. El desafío del método radica en primer lugar en la encapsulación correcta y en segundo lugar, en la validación de los beneficios resultantes de la encapsulación de altas concentraciones de colorante. La comparación de las propiedades de formación de imágenes de liposomas se inactivó con la del colorante libre y también con una formulación no liposómica se inactivó con bajas concentraciones del colorante es indispensable. Mostramos por un protocolo de hidratación de película y extrusión simple, pero muy eficaz combinado con congelación y descongelación ciclos alternos que la encapsulación de las concentraciones de extinción de DY-676-COOH en liposomas es factible. Otros métodos utilizados para preparar liposomas, tales como el método de evaporación de fase inversa 23, así como el método de inyección de etanol 24 permiten preparación de liposomas con altas eficiencias de encapsulación para muchas sustancias hidrófilas. Sin embargo, la naturaleza de la sustancia a encapsular puede influir en la eficiencia de encapsulación. En efecto,el protocolo de hidratación de película y extrusión que aquí se presenta reveló la más alta eficiencia de encapsulación de DY-676-COOH. Para ilustrar los beneficios de la encapsulación liposomal de DY-676-COOH, un modelo de edema inducido por zymosan, que permite el estudio de los procesos inflamatorios dentro de unas pocas horas, fue utilizado. Aquí, se demuestra que los liposomas con altas concentraciones del encapsulado DY-676-COOH son más adecuados para todo el cuerpo en imágenes ópticas vivo de los procesos inflamatorios que el colorante libre o la formulación liposomal no se inactivó con bajas concentraciones de colorante. Así, el protocolo subyacente proporciona un método sencillo y rápido para producir liposomas fluorescentes Templado y la validación de su potencial de activación y de formación de imágenes tanto in vitro como in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Materials and equipments for preparation of liposomes</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">egg phospahtidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880120P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810145P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)</td>
			<td>Sartorius AG</td>
			<td>Research RC 210 P</td>
			<td>used for weighing the phospholipids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Rotavapor</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-114</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Waterbath</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-481</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacuum Controller</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-720</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacobox</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-177</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Circulation Chiller</td>
			<td style="width:179px;">LAUDA DR. R. WOBSER 
			GMBH &#38; CO. KG</td>
			<td>WKL 230</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DY-676-COOH</td>
			<td>Dyomics GmbH</td>
			<td>676-00</td>
			<td>Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1086</td>
			<td>buffer 10 mM, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichlormethan</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>Y015.2</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>Merck Eurolab GmbH</td>
			<td>USR 170 H</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td>
			<td>Scientific Industries Inc.</td>
			<td>SI-0256</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex G25 medium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Europe GmbH</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td>used for liposome purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X100</td>
			<td>Ferak Berlin GmbH</td>
			<td>505002</td>
			<td>used to destruct liposomes&#160; for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiposoFast-Basic</td>
			<td>Avestin Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluostar Optima</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the determination of liposome size and zetapotential</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">XL 80</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Rotor</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">SW 55 TI</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:309px;">Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z4250-250MG</td>
			<td>used for induction of inflammation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isotonic Saline (0.9)</td>
			<td style="width:179px;">Fresenius GmbH</td>
			<td style="width:119px;">PZN-2159621</td>
			<td>used for the dilution of Zymosan-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Ohmeda Isotec 4</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for anesthesizing animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis GmbH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PZN-7253744</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Mat Pro 20 W</td>
			<td style="width:179px;">Lucky Reptile</td>
			<td style="width:119px;">61202-HTP-20</td>
			<td>used to keep animals warm during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Omnican-F (1 ml injection)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3115465</td>
			<td>used for subcutaneous and intravenous application of probes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Panthenol eye cream</td>
			<td style="width:179px;">Jenapharm</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3524531</td>
			<td>used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Hanks buffered saline solution</td>
			<td style="width:179px;">PAA Laboratories /Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">L2045</td>
			<td>w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">8-Well chamber slides</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354108</td>
			<td>used for cell culture followed by microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Cell culture flasks</td>
			<td style="width:179px;">Greiner BioOne</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture media</td>
			<td colspan="2">Gibco (life technologies GmbH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-Lysine solution (0,01% - 50&#160;ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4832</td>
			<td>used to coat cell culture chamber slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mountant Permafluor</td>
			<td>ThermoScientific&#160;</td>
			<td>S21022-3</td>
			<td>Mounting solution for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hoechst-33258</td>
			<td style="width:179px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA stain for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hera-Safe</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile work bench used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HERA cell</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Incubator used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">LSM510-Meta</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system</td>
			<td style="width:179px;">CRi, Woburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for whole body fluorescence imaging of small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of absorption</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)</td>
			<td style="width:179px;">Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of fluorescence emission</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Animals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMRI mice (8-12 weeks old, male)</td>
			<td style="width:179px;">Elevage Janvier, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for inflammation trials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-quenching of a liposomal-encapsulated near-infrared fluorophore as a tool for in vivo optical imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF DY676-COOH utilizado aquí en el interior acuoso de los liposomas conduce a un alto nivel de extinción de la fluorescencia. Extinción de la fluorescencia, un fenómeno observado con muchos fluoróforos a alta concentración, puede ser explotado en varias en aplicaciones de formación de imágenes in vivo, donde se exigen una alta sensibilidad y detección fiable de la zona objetivo. El uso de liposomas...

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Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

16.1K vistas.  Jena University Hospital. The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity. 

Video: Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Investigación

Bioingeniería

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

A Cre-Lox P Enfoque de recombinación para la detección de la fusión celular En Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Imaging desnaturalizadas colágeno Strands<em&gt; En vivo</em&gt; Y<em&gt; Ex vivo</em&gt; A través de Photo-desencadenada Hibridación de Caged colágeno Mimetic Péptidos

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

La síntesis de hidrogeles funcionalizado-RGD como una herramienta para aplicaciones terapéuticas

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Nanotubos de ADN como una herramienta versátil para el estudio de polímeros Semiflexible

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.