Estamos agradecidos a S. Thomas que ha iniciado este proyecto, J. Hermann y U. Burgbacher ayuda en la construcción de la instalación de la FIM. Este trabajo fue financiado por la DFG (SFB 629 B6).

NOTA: Aquí, el uso de FIM se presenta para análisis de alto rendimiento práctico de la locomoción de larvas para el cribado en condiciones de libre movimiento y bajo la influencia de un estímulo de calor. Otras aplicaciones, como el análisis de los estímulos olfativos locomoción dependiente o de alta resolución de imagen de comportamientos rodantes u otros podrían necesitar cambios sutiles en el protocolo, que se proporcionan bajo petición. 1. Configuración de Experimentos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Use aproximadamente 100 larvas por genotipo en total (tiempo de 1 hora requerido) para obtener valores estadísticamente significativos. NOTA: En el caso de varios genotipos necesitan ser comparados y registrados en diferentes días, grabar el mismo número de larvas por genotipo por día. </li><li> Para la mayoría de las aplicaciones, ficha a 10 Hz para el análisis de parámetros. Para aplicaciones de alta resolución de imagen, variar la velocidad de imagen si es necesario. </li><li> Para el seguimiento de las larvas de tercer estadio, realizar experimentos alrededor de 120 horas después de la puesta de huevos. Haga sure que las culturas producen suficiente larvas en el período experimental (véase 4.3). </li><li> Para aplicaciones no-estímulo, preparar una superficie de rastreo que contiene agar translúcido (ver sección 2). Para contener larvas en el rango de estímulo para la aplicación del gradiente térmico, rodear el campo de visión con una barrera agar sal aversivo (ver sección 3). NOTA: Otras aplicaciones pueden requerir diferentes superficies. </li><li> Asegúrese de utilizar una habitación con condiciones constantes ambientales (temperatura, luz, flujo de aire, la humedad del aire, etc.). </li></ol> 2. Arrastre a la preparación de superficies (translúcido Agar) NOTA: En la configuración de la FIM se añade una superficie de agar para proporcionar una superficie de rastreo húmedo. Además, también mejora las propiedades de iluminación. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Hervir agar de calidad alimentaria 0,8% en agua ultra pura desionizada. Para la aplicación de cribado preparar 400 ml. </li><li> Vierta el agar a 50 ° C (frío-mano) en una separada de 33 cm x 33 cm acplaca rylic-vidrio. La tensión de la superficie del agar y por lo tanto la temperatura definir el espesor de la losa de agar. A 50 ° C, se obtienen 2 mm de espesor losas de agar. No agite después de hervir y verter constantemente para evitar burbujas. Preparar placas de agar frescas para cada período de formación de imágenes de alrededor de 4 horas. </li><li> Llenar platos estándar 6 cm de Petri con la solución restante agar 0,8% para ordenar, limpiar y habituarse larvas antes del experimento (1 plato por genotipo). </li><li> En caso de que se necesita una barrera agar aversivo para la aplicación, pase a la sección 3. </li><li> Se quita aproximadamente 2 cm del perímetro de la losa de agar para obtener una superficie cuadrada plana para la grabación. Retire el exceso de agar. NOTA: El tamaño depende de la aplicación. </li><li> Transferir la losa de agar a la configuración de la FIM directamente después del enfriamiento empujando suavemente el agar de deslizamiento sobre el borde de la placa de vidrio acrílico. </li></ol> 3. Opcional: Agregar un aversivo Agar Barrera al Crawling Superficie (Sal Agar) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Hervir agar de calidad alimentaria 2,5% con 3 M de NaCl en agua ultra pura desionizada. Para la detección de un gradiente de calor preparar 200 ml. NOTA: El volumen depende de la aplicación. </li><li> Cortar un 2 cm de ancho muesca en la superficie previamente vierte rastreo que rodea el campo de visión (22 x 22 cm). NOTA: Las diferentes formas de barrera y los campos de visión pueden ser necesarios dependiendo de la aplicación. </li><li> Llene la muesca con agar sal 0.1-0.3 cm más alto que la superficie de seguimiento. </li></ol> 4. Fly Manejo <ol style="margin-left: 40px;"><li> Posterior vuela en 25 ° C incubadora con 12 h de luz / oscuridad ciclo ajustado a la hora del experimento en comida mosca estándar a 65% de humedad del aire. </li><li> Para cruces, anestesiar a 30 moscas hembras vírgenes y 8 hombres con CO 2 y cruzarlos en 130 viales de cultivo ml con 35 ml de alimentos. NOTA: Uno de 130 ml frasco de cultivo con 35 ml de alimentos producirá alrededor de 20-30 lcomieron las larvas en el lapso de imagen de 4 horas. Imaging y seguimiento de obras para todas las etapas estadio larval. </li><li> Caída de un poco de agua en los frascos de cultivo para conducir finales del tercer estadio larval movimiento y recoger el mayor larvas de las paredes del vial utilizando un pincel pequeño. </li><li> 2-5 min antes de la grabación, larvas de transferencia de un vídeo a una placa de Petri que contiene agar de calidad alimentaria 0,8% en agua ultrapura desionizada para habituar y limpiarlos. </li></ol> 5. Ajuste de la configuración del FIM Imaging para Grabaciones (no Estímulo Condiciones) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ajuste el enfoque de la lente de la cámara y la abertura si es necesario. Ajuste el tiempo de exposición para la cámara respectiva. NOTA: Estos valores no necesitan ser cambiados durante un experimento. </li><li> Ajuste la intensidad de iluminación para obtener un buen contraste de imagen una larva. </li><li> Mantenga las condiciones ambientales en la constante de habitación durante las grabaciones. Oscurecer la habitación para no molestar a las larvas con luz direccional. </li></ol> 6. Opcional: Ajuste de la configuración del FIM Imaging para Grabaciones (Temperatura gradual del estímulo Condiciones) NOTA: El dispositivo de gradiente de calor es una cm3 placa 42 x 42 x 0,2 de aluminio con una pintura negro mate y material aislante en el sitio superior. La placa se perfunde con agua a partir de dos circuitos diferentes conectados a acumuladores / refrigeradores y bombas en ambos extremos (véase la Figura 1B). Las temperaturas pueden ser reguladas -5-50 ° C. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Encienda el gradiente de calor dispositivo de 1 hora antes de los experimentos y colocarlo encima de la configuración para permitir establecer el perfil de temperatura deseado y los componentes que se equilibre. </li><li> Transferir el agar superficie arrastrándose con una barrera de sal a la configuración. </li><li> Coloque la placa de radiador sobre el agar y ajustar el espacio entre la placa y la superficie de rastreo a 2 mm (~ 1 mm por encima de las larvas). </li><li> Establecer un gradiente lineal deal menos 0,8 ° C / cm a partir de 34 ° C (aprox. 2 cm de la barrera en el campo de visión) a 18 ° C (aprox. 2 cm de la barrera en el lado opuesto en el campo de visión) mediante el ajuste de la temperatura de los circuitos de agua a 1 ° C y 45 ° C. NOTA: Diferentes propiedades del gradiente de la placa de metal requieren diferentes temperaturas que necesitan ser comprobada empíricamente. Estos ajustes no necesitan ser cambiados durante los experimentos. </li><li> Ajustar la configuración como se describe en la sección 5. </li><li> Permitir que la superficie de rastreo se equilibre en el gradiente antes de los experimentos de 20 min. Pruebe el gradiente de temperatura con un pirómetro. </li><li> Continúe con la sección 8. </li></ol> 7. Imaging FIM (no Estímulo Condiciones) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Use una pequeña brocha húmeda para recoger suavemente 15 larvas de las placas de Petri de habituación y transferirlas al centro de la superficie de seguimiento. No transferir alimentos sigue siendo o demasiadaagua (véase 7.8). </li><li> Record 1-50 larvas en un 22 cm x 22 cm de superficie de control. Utilice 15 animales por vídeo para la mayoría de aplicaciones de detección (por razones estadísticas utilizan al menos 100 individuos por genotipo). </li><li> Separar suavemente las larvas y esperar unos 10-20 segundos hasta que todas las larvas comenzó a moverse en línea recta antes de la grabación. </li><li> Anote la locomoción de larvas durante 2 minutos a 10 fotogramas por segundo para condiciones no de estímulo. Utilice imágenes tif sin comprimir como formato de salida. </li><li> Durante la grabación, recolectar larvas para el próximo video de viales habituar ellos crítico:. No molestar larvas grabado con luz. </li><li> Después de la grabación, eliminar las larvas con una brocha grande y desecharlos de acuerdo con las normas de la legislación de seguridad y locales. </li><li> Después de la eliminación de las larvas, utilice el pincel para limpiar y humectar la superficie de rastreo con agua ultra pura desionizada. </li><li> Crítica: Mantenga la superficie húmeda en todo momento, pero evitar mo excesivoisture, que puede ser visto como halos o gotas que rodean larvas en grabaciones y perturbar de seguimiento. </li></ol> 8. Opcional: Imaging FIM (Temperatura gradual del estímulo Condiciones) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Después de establecer el gradiente de temperatura (ver sección 6), preparar el software de grabación para grabar dentro de 20 seg instante después de la colocación de las larvas en la superficie de rastreo (véase 8.2), por ejemplo, ajustar el número de fotogramas por vídeo y definir la ruta de almacenamiento. </li><li> Levante la placa del radiador ligeramente y colocar las larvas a los 33 ° C a 2 cm de la barrera de sal. Consulte 6. y 7. Para obtener más instrucciones generales. Baje la placa del radiador de nuevo y comenzar a grabar durante 3-4 min directamente después de larvas comenzó a moverse en línea recta. </li><li> Después de la grabación, eliminar las larvas directamente, limpia y humecta la superficie. No toque el agar sal para evitar la propagación de NaCl. </li><li> Crítica: Mantenga la superficie húmeda en todo momento, pero evitarhumedad excesiva, que puede ser visto como halos o gotas que rodean larvas en grabaciones y perturbar de seguimiento. </li><li> Deje que la superficie del agar se equilibre de nuevo después de la hidratación durante 1-2 minutos, mientras que guardar las imágenes y la recolección de nuevos animales antes de preparar para el próximo video. Controlar el gradiente de temperatura utilizando un pirómetro cada 5 vídeos y ajustar si es necesario dispositivo de temperatura (temperatura del agua, la altura y la orientación xy con respecto a la superficie de seguimiento). </li></ol> 9. Seguimiento de las larvas Locomoción NOTA: Para obtener más detalles, consulte el manual adjunto para FIMTrack (suplemento). Para un diagrama de flujo del programa véase la Figura 2. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ajustar parámetros de seguimiento para los respectivos experimentos utilizando la opción de vista previa. <ol><li> Ajuste de píxeles por cm de acuerdo a la cámara y campo de visión. </li><li> Ajuste fotogramas por segundo en función de los ajustes de la cámara. </li><li> Ajustar umbrales de luminosidad así ªa todos los animales se detectan correctamente (retroalimentación se da en la vista previa). </li><li> Ajuste larvas umbrales de tamaño de área. Tenga en cuenta la opción de comentarios en la vista previa: animales individuales se resaltan en amarillo, chocando larvas se resalta en rojo y el área de cada animal se le da en azul. </li></ol></li><li> Iniciar el seguimiento utilizando el botón en la parte inferior derecha. NOTA: Después de una exitosa localización, una imagen que ofrece pistas de larvas y un archivo CSV que contiene las características de locomoción y postura calculados se almacena en el directorio de imágenes. </li><li> Utilice el módulo espectador Resultados de la FIM (Editar&gt; Resultados Visor ...) para revisar y ajustar manualmente los resultados de rastreo. Si es necesario, definir las regiones de estímulo para evaluar los datos en relación con el régimen de estímulo por ejemplo, arrastrándose orientación con respecto al gradiente de calor o la distancia a una fuente odorante. Para una descripción más detallada, por favor utilice el manual (suplemento). </li></ol> 10. Evaluación de los Datos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importe el archivo CSV en Excel, Matlab o cualquier otro programa para su posterior análisis estadístico. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar

En neurociencia conductual es obligatorio para descifrar cuantitativamente rasgos de comportamiento complejos. Se necesitan procedimientos de este modo, un gran número de individuos deben ser observados en alta resolución y automatizados para el análisis estadístico. Aquí, las imágenes de la FIM se describe, una novela, una configuración sencilla y robusta de imágenes, que proporciona los medios para controlar la locomoción de una amplia gama de animales. La eficacia de la configuración de imagen FIM fue probada usando larvas de Drosophila, platelmintos planarias y C. gusanos elegans. La tecnología FIM ofrece intrínsecamente alto contraste para detectar incluso las estructuras internas de los animales, tales como el cerebro, la tráquea, el intestino o el proventrículo. Es importante destacar que estas estructuras internas están identificados con firmeza para que puedan servir para identificar automáticamente la orientación del animal 19. La calidad de las películas puede ser influenciada por una cantidad excesiva de agua en la superficie de rastreo. Por lo tanto, es críticocontrolar la humedad de la agar. Demasiado viejo agar agua o demasiado en la superficie puede causar artefactos. Del mismo modo, asegúrese de que no hay burbujas de aire se incluyen en la superficie de rastreo. En general, una superficie de agar bien preparado permite grabar películas durante 4 horas. Debido a los principios físicos subyacentes de imágenes FIM genera casi el ruido de las grabaciones de imágenes libres, lo que resulta en una excelente calidad de imagen. Esto a su vez facilita el análisis de imágenes por computadora posterior y permite un alto rendimiento. Sin embargo, la metodología se limita al análisis de animales que entran en contacto directamente la superficie del agar. El software de seguimiento es desafiado por los animales que forman una forma de rosquilla. Aunque un indicador binario reconoce la forma de rosquilla, podría calcularse una columna equivocada. Debido a la construcción modular de la formación de imágenes en color de doble o triple tabla de seguimiento está a su alcance. Por otra parte, los estímulos adicionales (luz, odorantes, estímulos eléctricos o mecánicos) pueden ser fácilmente delivered desde arriba. El programa FIMTrack diseñado para que coincida con el poder de formación de imágenes FIM puede ser fácilmente adoptado para rastrear las larvas de Drosophila, C. elegans o planarias. Por lo tanto y debido a su construcción simple y barato (ver http://FIM.uni-muenster.de), imágenes FIM es factible para una amplia gama de aplicaciones biomédicas y, en particular, permite que necesita urgentemente estudios de alto rendimiento.

La mayoría de los animales tienen la capacidad de moverse de una manera altamente sofisticada y controlada. Para descifrar la base genética de control de la locomoción subyacente es obligatorio para evaluar cuantitativamente diferentes patrones de comportamiento. A este respecto, Drosophila puede servir como un modelo ideal. Seguimiento de volar libremente Drosophila es tentador 1-4 pero el rastreo de las larvas de Drosophila se produce en dos dimensiones a una velocidad relativamente baja y por lo tanto se puede controlar fácilmente. Montajes basados ​​en cámaras combinadas con adecuada iluminación se utilizan para adquirir imágenes 5. Tanto incidente o luz transmitida se emplea en experimentos de comportamiento 6,7. Sin embargo, debido a que el cuerpo semi-transparente de las larvas y los posibles reflejos de luz de la superficie que se arrastra fiel registro de los movimientos de las larvas puede ser un reto. Para superar estos problemas, algunos métodos complejos se han ideado. Recientemente, iluminación de campo oscuro se introdujo para mejorar el primer plano / fondo contRAST 8. Como alternativa a la grabación basada en la cámara, la imagen óptica de lentes menos y del sensor de imagen-en-chip menos se han introducido técnicas de adquisición de 9-11. Varios programas de seguimiento se han introducido recientemente, incluyendo el software de 12 y personalizadas soluciones disponibles en el mercado. Ejemplos de programas de rastreo de alto rendimiento son el Rastreador Gusano Multi (MWT) 13 y Multianimal marcha y Track (MAGAT) 8. Ambos tienen en común, que muchos animales pueden ser rastreados en un solo escenario de campo abierto para que los animales que chocan conducen a múltiples nuevas identidades animales. Para superar esta limitación, una configuración de múltiples pocillos se introdujo la separación de 12 animales en pocillos individuales 14. La cuantificación precisa de la locomoción de las personas individuales se puede lograr mediante el uso de una etapa de seguimiento móvil en combinación con un microscopio 15. Sin embargo, todos estos enfoques son o poco rentables, la falta suficiente resolución o demasiado tiempo para alta fenotipificación rendimiento. FIM Para superar las limitaciones mencionadas anteriormente, hemos desarrollado (método de imagen basada en FTIR), basado en Frustrado Reflexión Interna Total (FTIR) 16 (Figura 1). Este nuevo enfoque de imagen proporciona un alto contraste sin precedentes e incluso permite la grabación de varios colores de animales rastreros 16. El principio subyacente de este método práctico y eficaz es fácil. Una placa de vidrio acrílico se inunda de luz (por ejemplo, 875 nm infrarrojo). Debido a los diferentes índices de refracción de vidrio acrílico y el aire, la luz se refleja totalmente en el límite vidrio / aire. No hay calefacción del vidrio acrílico se observó 16. Sólo si los objetos con un índice de refracción más alto toquen la mesa luminosa, puede iluminar introducir estos objetos. Si los animales tocan la superficie, la luz se refleja y se puede capturar desde abajo (Figura 1). En consecuencia, sólo el contactoárea de los animales aparece como un punto brillante, que permite imágenes detalladas con un fondo negro en general. Por lo tanto, la FIM-imagen permite grabar películas perfectas para los algoritmos de visión por computador. El uso simple y robusto de FIM ahora trae un análisis detallado del comportamiento animal complejo de alto rendimiento en alcance y se puede utilizar para el estudio de tratamiento de la información: por ejemplo, el olfato 8, 16; visión 17 o thermosensation 18. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1. Configuración FIM con la integración de calor-estímulo y los principios físicos subyacentes. (A) La configuración de FIM. Intensidad de iluminación se puede regular en el panel frontal. (B) Para entregar un estímulo de calor, un negro pintado placa de aluminio, perfundido con agua fría y caliente en ambos lados, se coloca 2 mm por encima de la superficie del agar quesí es de 2 mm de espesor. El gradiente se establece en la placa del radiador de calor y el agar por las diferencias de temperatura (C) El principio físico de la frustrada reflexión interna total:. Una placa de vidrio acrílico es iluminado por la luz infrarroja. θ 1, θ 2, y θ 3 indican los ángulos de reflexión de luz. n A, n 1, n 2 yn 3 denotan los índices de refracción del aire, vidrio acrílico, agar y la larva, respectivamente, y cumplir con la desigualdad n A &lt;n 1 &lt;n 2 &lt;n 3. Debido a la refracción, el ángulo de reflexión cambia durante la transición. Si el ángulo está por debajo del ángulo crítico, la luz no se refleja más, puede pasar a través de las capas y pueden ser capturados desde abajo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> El spectrum de los procesos que pueden ser analizados por la FIM es amplio. Sin ningún otro ajuste, la imagen de la FIM se puede utilizar para controlar todas las fases larvarias de Drosophila (Figura 5B) o se puede utilizar para seguir las pisadas de adultos Drosophila 19. Del mismo modo, las trayectorias de C. elegans o el movimiento de los gusanos planos planarias se pueden grabar fácilmente (Figura 5C). Incluso el análisis de hifas o el pelo de raíz el crecimiento de hongos parece factible 19. En nuestra configuración actual FIM, 4 x 16 diodos emisores de luz infrarroja (LED) IR- están integrados en una placa de vidrio 2 cm acrílico 32 x 32, llamada la tabla de seguimiento (Figura 1). La intensidad de la IR-LED se ajusta dependiendo del peso de los objetos en la tabla de seguimiento, que se puede hacer fácilmente por un micro controlador conectado al circuito a través de la modulación de ancho de pulso (PWM). FIM produce imágenes de muy alta de contraste a través de una amplia gama de intensidades de iluminación. Es importante destacar que la GENtamente excelentes resultados en ya baja irridation infrarrojos general. Una cámara con un filtro de infrarrojos se coloca por debajo de la tabla de seguimiento, lo que permite la integración de estímulos adicionales a la configuración. Estímulos de calor pueden ser aplicados fácilmente por una placa de radiador de calor y estímulos de luz se aplican mediante un proyector LCD. También odorantes pueden estar contenidos en los gradientes de tapas sencillas 8. Para los experimentos de gradiente de calor, la placa de radiador de calor se perfunde con agua caliente y fría en ambos lados, respectivamente, y se coloca 2 mm por encima de las larvas (Figura 1B). La generación de alto contraste, películas de alta calidad abre la posibilidad de sofisticados análisis de imágenes por computadora, por lo que se implementó el software FIMTrack para extraer un gran conjunto de características a partir de imágenes (Figura 2). Las primeras seis funciones principales se definieron a partir del contorno del animal (Figura 3A). Estas características proporcionan la línea de basePara más cálculo de seis características secundarias que describen la forma animales y su posición en ciertos estímulos en un punto de tiempo dado (Figura 3B). Actualmente, nueve características terciarias se calculan que están integrando aspectos temporales y por lo tanto caracterizar la locomoción del animal junto con las características primarias y secundarias (Figura 3C). <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2. Panorama FIMTrack, flujo de trabajo algorítmico y la representación de las larvas. (A) ¿Cómo utilizar FIMTrack. Las imágenes se cargan. Umbral de valor de gris y umbrales de tamaño de las larvas que definen las larvas solo deben establecerse. El área de larvas debe estar en [-min tamaño, de tamaño max]. El seguimiento se inició por el botón resaltado. Flujo de trabajo (B) Seguimiento. Después de hacer clic en el botón de inicio, la imagen de fondo es calculated (intensidades mínimas en el tiempo). Mientras hay marcos de la izquierda, las larvas se segmentado basado en el umbral de gris y la minería y el umbral máximo de tamaño. Para todas las segmentaciones las representaciones de larvas se calculan (comparar con (C)). Cada nuevo modelo se asocia a una trayectoria dada si una pista válida disponible. Si se alcanza el último cuadro, finalizando el procesamiento posterior se realiza seguido por la generación de salida. (C) la representación de las larvas. El animal se compone de una cabeza y un punto de cola (h y t). Entre estos puntos un número impar arbitrario de puntos de la columna s i se puede configurar con un radio r i. Además, el centro de masa m y el cuerpo principal de flexión γ ángulo se calculan. Varios parámetros relacionados con el movimiento se esbozan por líneas de color púrpura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. Características calculados por FIMTrack. (A) características primarias basado en el contorno de los animales. (B) características secundarias, con base en las características primarias. (C) Características del Terciario, con base en las características primarias de cuadros consecutivos y aportes adicionales <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Source</td>
			<td style="width:191px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">FIM setup</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">details for construction or purchase of setups is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylic glass plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Additional for agar pouring</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Heat radiator plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Water calorifier/cooling pumps and hoses</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard Camera (4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Basler</td>
			<td style="width:191px;">acA2040-25gm</td>
			<td style="width:251px;">Camera defaultly used for the FIM setup</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (1.4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">QImaging</td>
			<td style="width:191px;">&#160;1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (0.8 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Point Grey</td>
			<td style="width:191px;">Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test Camera (0.3 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Sony</td>
			<td style="width:191px;">PS Eye USB2.0 camera</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Computer</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [&#62;1TB]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Standard Fly food</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Standard Fly vials 135 ml</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">78,895</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes 9cm</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">821,473</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrapure deionized water</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">Synergy&#160;</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:191px;">3957.2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Food grade agar</td>
			<td style="width:191px;">AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">A0917,5000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paintbrush (small and large)</td>
			<td style="width:191px;">Milan</td>
			<td style="width:191px;">Aquarell 310 Size 0 and 2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Pyrometer</td>
			<td style="width:191px;">Trotec</td>
			<td style="width:191px;">BP20</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fim imaging and fimtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis

El análisis de la función de red neuronal requiere una medición fiable de los rasgos de comportamiento. Dado que el comportamiento de los animales en movimiento libre es variable a un cierto grado, muchos animales tienen que ser analizados, para obtener datos estadísticamente significativos. Esto a su vez requiere una asistido por ordenador cuantificación automática de patrones de locomoción. Para obtener imágenes de alto contraste de objetos que se mueven casi translúcidos y pequeñas, se desarrolló una nueva técnica de imagen basada en frustrado reflexión total interna llamada FIM. En esta configuración, los animales sólo se iluminan con luz infrarroja en la posición muy específica de contacto con la superficie de rastreo subyacente. Esta metodología resulta en imágenes de muy alto contraste. Posteriormente, estas imágenes de alto contraste se procesan mediante algoritmos de seguimiento de contorno establecidas. Basados ​​en esto, hemos desarrollado el software FIMTrack, que sirve para extraer una serie de características necesarias para describir cuantitativamente una gran variedad de locomocióncaracterísticas. Durante el desarrollo de este paquete de software, nos hemos centrado nuestros esfuerzos en una arquitectura de código abierto que permite la fácil adición de nuevos módulos. El programa funciona independiente de la plataforma y se acompaña de una GUI intuitiva guiar al usuario a través de análisis de datos. Todos los valores de los parámetros de locomoción se dan en forma de archivos CSV que permite análisis más datos. Además, un visor de Resultados integrado en el software de seguimiento proporciona la oportunidad de revisar y ajustar la salida, como podría ser necesario durante la integración de estímulos de forma interactiva. El poder de FIM y FIMTrack se demuestra mediante el estudio de la locomoción de larvas de Drosophila.

Para obtener imágenes de varias cámaras diferentes con diferentes propiedades de resolución fueron probados (Figura 4). Todas las cámaras donde equipado con un filtro IR apropiada. De acuerdo con la baja resolución de la cámara de precio más bajo en esta prueba, el campo de visión está limitado a 10 cm x 10 cm. Los mejores resultados se obtuvieron usando un 4 megapíxeles (MP) de la cámara. Esto conduce a una resolución de 100 píxeles por tercer estadio larval longitud y se deja reconocer fácilmente las estructuras internas. Además, la peristalsis del animal puede ser fácilmente extraído (Figura 4A). Sin embargo, todavía se pueden obtener películas de alto contraste con cámaras menos costosas, que también pueden ser analizados por FIMTrack. Utilizando una cámara de 1,4 MP con una profundidad de 8 bits y una resolución de 1392 x 1040 píxeles es aproximadamente la mitad del precio y permite una resolución de 45 píxeles por tercer estadio larval longitud en el campo de visión. La cabeza, pero no hay otras estructuras internas pueden ser reconocidos (Figura 4B). Seguimiento y detección de peristaltismo es posible, pero la precisión se reduce (Figura 4B). Con una cámara de 0,8 MP incluso más barato con una resolución espacial comparable al 1,4 MP cámara, el jefe de las larvas no se puede reconocer con fidelidad más (Figura 4C). Seguimiento y análisis peristaltismo es posible, pero incluyendo más jitter basado en el aumento del ruido. Sorprendentemente, incluso una cámara web de baja resolución USB ofrece películas de calidad suficientes para calcular trayectorias larvales (cámara de 0.3 MP, debajo de los 20 €, Figura 4D). El peristaltismo puede calcularse a partir del área pero las mediciones son muy ruidosas. En nuestra configuración que utilizamos rutinariamente el 4 MP cámara. Para el cribado, esta cámara permite la monitorización de un 22 cm x 22 cm arena, lo que obviamente ofrece la oportunidad de analizar un gran número de animales simultáneamente de modo que el análisis de alto rendimiento es factible. El uso de este ajuste, la longitud de las larvas is representada por 40 píxeles que todavía permite la grabación y análisis de los movimientos peristálticos. Una imagen de ejemplo de 15 trayectorias de larvas en un gradiente de calor se da en la Figura 5A. Además, el uso de una lente macro permite a las larvas de imagen con una resolución muy alta en muchos órganos internos se hacen visibles y reconocimiento se mejora aún más la cabeza (Figura 5B). Además estos pueden ser utilizados para el análisis ulterior más detallada de los comportamientos de una amplia gama 20. La misma configuración se puede utilizar fácilmente para imagen Arrastre C. gusanos elegans (Figura 5C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650" /> Figura 4. imágenes y seguimiento de los resultados de la FIM para diferentes cámaras. (A) Izquierda: imágenes FIM de tres larvas se arrastra en una etapa de seguimiento de 10 cm x 10 cm capturaron con una cámara de 4 MP con 10 fps. Medio:Clipping y el centro de la trayectoria masa de una sola larva. El área del animal se indica. Derecha: Área de la larva traza más de 100 marcos. La flecha roja indica el punto de la imagen recortada tiempo. (B) Equivalente a (A), pero capturaron con una cámara de 1.4 MP. (C) Equivalente a (A), pero capturaron con una cámara de 0.8 MP. (D) Equivalente a ( A) pero capturaron con una cámara de 0.3 MP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650" /> Figura 5. estímulo de calor, y de alta resolución de las solicitudes. (A) la aplicación estímulo de calor (comparar con la Figura 1). Trayectorias calculan a través de FIMtrack. Imagen de la aplicación de alta resolución de una tercera, segunda y primera larva se utiliza un objetivo macro (B). La longitud de las larvas de tercer estadio está representado por 400 píxeles en un campo de visión de 2,5 x 2,5 cm. (C) A C. elegans gusano capturado utilizando imágenes de FIM. Las barras de escala se indican. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM es un sistema novedoso, imágenes rentable diseñado para rastrear objetos en movimiento pequeñas como C. elegans, planaria o larvas de Drosophila. El programa FIMTrack suministrado está diseñado para ofrecer un análisis de datos rápido y eficiente. En conjunto, estas herramientas permiten el análisis de alto rendimiento de los rasgos de comportamiento.

FIM Imaging y FIMtrack: Dos nuevas vías que hagan de alto rendimiento y Análisis de Costo Efectivo Locomoción

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

fim-imaging-fimtrack-two-new-tools-allowing-high-throughput-cost

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K vistas.  Westfälische Wilhelms-Universität Münster.  FIM es un sistema novedoso, imágenes rentable diseñado para rastrear objetos en movimiento pequeñas como C. elegans, planaria o larvas de Drosophila. El programa FIMTrack suministrado está diseñado para ofrecer un análisis de datos rápido y eficiente. En conjunto, estas herramientas permiten el análisis de alto rendimiento de los rasgos de comportamiento. 

Video: FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial products are often expensive, not easily customized, and not submersible. Here we describe a method to design and build a customized, integrated circuit headstage for simultaneous 4-channel neural recording and 2-channel simulation in awake, behaving animals. The headstage is designed using a free, commercially available CAD-type design package, and can be modified easily to accommodate different scales (e.g. to add channels). A customized printed circuit board is built using surface mount resistors, capacitors and operational amplifiers to construct the unity gain source follower circuit. The headstage is made water-proof with a combination of epoxy, parafilm and a synthetic rubber putty. We have successfully used this device to record local field potentials and stimulate different brain regions simultaneously via independent channels in rats swimming in a water maze. The total cost is &lt; $30/unit and can be manufactured readily.

We present a low-cost method to design and construct a light headstage pre-amplifier system with simultaneous neural recording and stimulation capability. This device can be waterproofed for use in swimming animals.

Diseño y construcción de un cabezal rentable para la estimulación simultánea neural y de grabación en el laberinto de agua

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizados análisis de comportamiento de alto rendimiento en larvas de pez cebra

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

Análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: Medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; La unión neuromuscular Morfología

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Análisis de alto rendimiento del comportamiento Locomotor en el ensayo de la isla de Drosophila

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Un Alto Rendimiento De Imagen Guiada Por Neuronavegación Estereotáctica Y Sistema De Ultrasonido Enfocado Para La Apertura De La Barrera Hematoencefálica En Roedores

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Visualización de redes de microtúbulos en uniones neuromusculares y células musculares de Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor destacado: Comprensión de la red de microtúbulos en las uniones neuromusculares de Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.