El protocolo estudia las neuronas granulares cerebelosas en diferentes etapas de desarrollo para visualizar el crecimiento morfológico clave. Las ventajas de la técnica incluyen la focalización específica de células, la expresión rápida de construcciones transfectadas y el etiquetado disperso de las células que permite el estudio de los efectos autónomos de las células. Comience cortando un segmento de 11,2 milímetros de la punta de una pipeta de carga y coloque la pieza cortada sobre la punta de la jeringa Hamilton como espaciador para limitar la profundidad de inyección a 1,5 milímetros.
Asegure el espaciador en la punta de la jeringa con adhesivo o parafilm. Para estudiar la morfología de CGN electroporados individuales de secciones cerebrales sagitales del cachorro experimental, tome imágenes de pila Z a 0,5 micrómetros por pila en un microscopio confocal. Imagen de una celda por ventana de imagen para permitir un fácil análisis de imágenes y reconstrucción 3D.
Analice la longitud de la neurita y la formación de garras dendríticas de manera ciega utilizando un trazador de neurita simple. Cargue imágenes de pila Z de un solo canal de CGN electroporadas en Fiji y haga clic en Plugins"Segmentation" y Simple Neurite Tracer"Seleccione Create New 3D Viewer" en el menú desplegable. Desplácese hasta la base de una dendrita que se conecta al soma celular e inicie un camino haciendo clic en la unión.
Trace manualmente la ruta haciendo clic en las secciones donde la señal de relleno de celda es más brillante y presionando Y para mantener el seguimiento. Traza hasta el final de la dendrita y confirma la ruta presionando F.Alternativamente, traza hasta la base de la garra. A continuación, trace la garra desde la base de la estructura hasta el final de la neurita más larga.
Para rastrear las ramas secundarias y terciarias, mantenga presionada la tecla Control en Windows o ALT en un macOS y haga clic en la ruta. Confirme la ruta pulsando F.Observe que las mediciones de las trazas son visibles en una ventana separada. Sume todos los tamaños de las ramas de la garra para obtener la longitud total de cada garra.
En el análisis representativo, las imágenes de proyección de CGNs electroporadas de 3 a 14 días después de la inyección mostraron una disminución progresiva en el número de dendritas. Las CGN se sometieron a una fase de crecimiento dendrítico seguida de un refinamiento de 3 DPI a 7 DPI que resultó en la poda de más del 50% del exceso de dendritas. Este evento coincide con el alargamiento gradual de los cenadores restantes en la formación de estructuras en forma de garra al final de cada dendrita que indica que estos procesos de desarrollo están ocurriendo simultáneamente.
A los 7 DPI, se encontraron garras en aproximadamente el 75% de las dendritas. Cada CGN marcado se reconstruyó en RMN para cuantificar el área de superficie y el volumen somatodendrítico total. No se observaron diferencias significativas en el tamaño de CGN a lo largo del desarrollo.
Aunque a 7 DPI, los CGN mostraron una disminución significativa del 20% en volumen en comparación con 3, 5 y 10 DPI. Lo más importante en el procedimiento es localizar con precisión el cerebelo antes de la inyección. El método se puede adaptar para manipular genéticamente genes in vivo para estudiar su papel en el desarrollo de neuronas granulares mediante la transfección de shRNAs, siRNAs o Cre Recombinase.
