Ringraziamo l&#39;intero laboratorio Koshy per utili discussioni. Ringraziamo Patty Jansma e la University of Arizona Dipartimento di Neuroscienze per la consulenza e assistenza per l&#39;imaging. Ringraziamo anche il laboratorio Porreca per l&#39;uso del loro Vibratome. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).

NOTA: I topi sono stati allevati e mantenuti in temperatura e umidità ambiente controllata con 12 hr invertito cicli di luce / buio, con cibo e acqua ad libitum presso la University of Arizona. Gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida e l&#39;approvazione della Cura e uso Comitato Animal Istituzionale della University of Arizona. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. I topi Cre-giornalista sono su un C57BL / 6 di fondo 11 e sono disponibili in commercio. 1. mouse Infezione NOTA: Il metodo di infezione mouse con Toxoplasma gondii descritto qui di seguito è stato utilizzato in studi precedentemente pubblicati 10 - 12. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Grow ceppi Toxoplasma nell&#39;uomo prepuzio fibroblasti (HFFS) coltivate in Dulbecco alta glucosio Modificato (DMEM) integrato con il 10% FBS, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml streptomycin, e 2 mM L-glutammina (cDMEM) in un pallone T-25 all&#39;interno di un incubatore CO 2 5% fino parassiti hanno costituito grandi vacuoli parassitoforo. </li><li> Parassiti Siringa a rilascio raschiando cellule dal fondo del pallone e passando la soluzione risultante attraverso un ago calibro 25 collegato ad una siringa da 3 ml 2 volte all&#39;interno del pallone poi trasferire la soluzione in un caso siringa da 5 ml collegato ad un ago calibro 27 che è stato collocato capovolto all&#39;interno di un tubo da 15 ml. Collegare lo stantuffo alla siringa e passare la soluzione del parassita nel tubo conico. </li><li> Centrifugare la provetta per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante quindi risospendere il pellet in 4-6 ml sterile di grado USP 1x tampone fosfato (PBS) pH 7.4 (Soluzione Stock). </li><li> Caricare un emocitometro con 10 ml di soluzione madre, aspettare 5-10 min per i parassiti di stabilirsi poi contare il numero di parassiti nei quattro angoli e centrali piazze della grande piazza centrale. </li><li> Diluire parasiti di adeguata dimensione inoculo di 100K / 200 ml PBS 1X poi iniettare topi per via intraperitoneale (ip) con un volume totale di 200 microlitri. NOTA: Per questa procedura, i topi sono stati inoculati con 100K tipo III (CEP) 13 tachizoiti a 200 microlitri 1x PBS. Quando infettare topi con altri ceppi di Toxoplasma, concentrazione di inoculo può essere necessario un aggiustamento per tenere conto di livello di virulenza. </li></ol> 2. perfusione cerebrale e raccolta NOTA: Questo protocollo è stato condotto a 21 giorni dopo l&#39;infezione (dpi) in quanto questo rappresenta il punto di tempo in cui un picco di cisti si trovano nel cervello di topo, ma altri punti di tempo può essere utilizzato. Size, il numero, la posizione e la presenza o assenza di cisti dipende da molti fattori, tra cui ceppo di topi, parassiti ceppo così come il formato inoculo 7,14 - 17. Gli investigatori dovranno stabilire individualmente l&#39;inoculo appropriato per il mouse e Toxoplasceppo ma lui / lei usa. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Installazione di tutti gli strumenti di raccolta chirurgici (Figura 1). </li><li> Per ogni mouse, preparare e tenere in ghiaccio: siringa 20ml riempito di sodio cloruro 0,9% (NaCl) + 10 U / ml di eparina in 1x sterile grado USP PBS (Eparina / Saline); Siringa da 20 ml riempito con 4% paraformaldeide (PFA); Scintillazione flaconcino con 15 ml 4% PFA. Per di più i topi, preparare un bicchiere pieno di l&#39;intero importo di ogni soluzione necessaria per tutti i mouse poi elaborare una siringa nuova completa di soluzioni per ogni perfusione. </li><li> Anestetizzare l&#39;ip mouse con 200 microlitri / 25 g di peso corporeo di ketamina / xilazina cocktail (24 mg / ml e 4,8 mg / ml) del giorno di interesse. Monitorare il mouse per il livello di anestesia controllando pizzico punta reflex. Continuare con protocollo solo quando il mouse mostra alcuna risposta ad una presa punta ferma. NOTA: Altri metodi di anestesia può essere usato fino a quando il livello appropriato di anestesia viene raggiunto primaprocedere con il protocollo. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina sulla piattaforma di schiuma coperto. Pin tutti e quattro gli arti fuori ai piedi poi spruzzare il petto e l&#39;addome con il 70% di etanolo (EtOH) (Figura 2A). L&#39;aggiunta di alcuni asciugamani di carta sterili sotto il mouse può essere utilizzato per assorbire troppo pieno di liquidi di perfusione. </li><li> Sollevare la pelle appena sotto lo sterno con una pinza poi usare le forbici per fare un&#39;incisione. Tirate la pelle per esporre il torace (Figura 2B). </li><li> Sollevare xiphoid processo ed effettuare una incisione addominale appena sotto il diaframma, esponendo il fegato che viene bruscamente sezionato distanza dal diaframma. Fare due incisioni, uno a sinistra e uno a destra attraverso il diaframma e la parte inferiore delle costole. Estendere le incisioni sinistro e destro circa 1 / 2-2 / 3 fino alla cassa toracica, che viene poi riflessa indietro per aprire la cavità toracica (Figura 2C). NOTA: Fare attenzione a non tagliare tutti gli organi o vasi sanguigni principali duanello questa procedura come in questo modo si compromette la qualità di perfusione. </li><li> Profumato transcardiaca con 10-20 ml eparina / Saline seguita da 10-20 ml 4% PFA. NOTA: Se la perfusione è fatto correttamente, il fegato si trasformerà da rosso a marrone (Figura 2D). Se non fatto correttamente, i vasi sanguigni saranno visibili (Figura 2E). </li><li> Capovolgere il mouse sul suo addome, i piedi ri-pin poi spruzzare testa e il collo con il 70% EtOH. Sollevare pelle dalla base del collo e fare una incisione. Togliere la pelle per esporre il cranio (Figura 2F). Decapitare testa a livello delle spalle. Rimuovere il cranio, rimuovere delicatamente il cervello, e metterlo in una fiala di scintillazione pieno di 4% PFA (Figura 2G-H). NOTA: Se ben perfuso, il cervello appare bianca senza vasi sanguigni visibili (Figura 2i). Se il cervello non è ben perfuso, vasi sanguigni saranno visibili (Figura 2J). </li><li> Posizionare la scintillazione flaconcino con cervello in 4% PFA a 4 ° C durante la notte, coperto dalla luce. Sciacquare il cervello in non-USP grado 1x PBS e trasferimento in un nuovo flacone scintillazione piena di freddo 1x PBS. Conservare il cervello in 1x PBS a 4 ° C, coperto dalla luce. NOTA: compensazione di successo e di imaging è stato realizzato con sezioni memorizzati in 1x PBS per fino a un mese, ma è meglio sezione cervello in pochi giorni lo stoccaggio prolungato in PBS inverte la fissazione PFA e potrebbe portare a meno di immagini ottimali . Autofluorescenza e una maggiore sfocatura sono stati notati in alcuni tratti imaged dopo stoccaggio in 1x PBS per un mese o più. </li></ol> 3. Cervello sezionamento <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere il cervello da 1x PBS e metterlo in una matrice cerebrale (Figura 3A) per consentire una maggiore precisione e taglia anche attraverso il cervello. Tagliare i bulbi olfattivi cervelletto e, se presente, e poi tagliare il cervello coronale in 2 o 3 sezioni. <br /&gt; NOTA: rifilatura e taglio del cervello può essere fatto senza l&#39;aiuto di una matrice cerebrale. Numero di sezioni tagliate coronale dipenderà dalla distanza di taglio del Vibratome utilizzato. Il cervello può essere sezionato in qualsiasi orientamento, anche se le sezioni sagittali e coronali sono più comunemente utilizzati per l&#39;identificazione neuroanatomica. </li><li> Fissare ciascuna sezione del cervello su un blocco di montaggio campione con cianoacrilato. Applicare un piccolo blocco di 5% agarosio gel dietro la parte del cervello per il supporto (Figura 3B). NOTA: altri meccanismi di sostegno possono essere utilizzati, ma senza il sostegno, la Vibratome possono spingere sul cervello provocando sezionamento irregolare. </li><li> Tagliare il tessuto in 160 micron (distanza di lavoro dell&#39;obiettivo utilizzata per l&#39;imaging) sezioni spesse con Vibratome impostati ad una velocità di 4 e ampiezza 9. NOTA: Le impostazioni per la velocità e l&#39;ampiezza può essere regolata a seconda della particolare macchina utilizzata per ottenere anche, sezioni lisce. Se le impostazioni sononon è corretto, il risultato può essere sezioni irregolari, lacerazione dei tessuti marchi o chiacchiere. </li><li> Raccogliere sezioni di tessuto in una fiala di scintillazione pieno di fresche, refrigerate 1x PBS se stanno per essere liquidati entro una settimana. Se le sezioni non stanno per essere liquidati entro una settimana, luogo sezioni in provette da 1,5 ml microcentrifuga riempiti con una soluzione crioconservante e conservare a -20 ° C. </li></ol> 4. Compensazione ottica di tessuto cerebrale Sezioni NOTA: Questo protocollo è stato modificato da un metodo precedentemente pubblicato 8. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparare 25%, 50%, 75% e 90% vol / vol glicerolo in PBS 1x + 2% Tween-20 (Gl / PBST). </li><li> Rimuovere le sezioni da 1x PBS o, se in crioconservante, sciacquare in 1x PBS e trasferimento in una fiala di scintillazione contenente 10 ml di 25% Gl / PBST. Posizionare flaconcino su un agitatore a 4 ° C, coperto dalla luce, per 12 hr. </li><li> Verificare che tutte le sezioni sono affondate al bottom della fiala. Aspirare il 25% Gl / PBST, lasciando appena sufficiente a coprire le sezioni poi riempire la fiala con 10 ml 50% Gl / PBST e posto su un agitatore a 4 ° C, coperto dalla esposizione alla luce, per 12 ore. Ripetere questo processo per il 75% Gl / PBST poi il 90% Gl / PBST. Lasciare sezioni del 90% Gl / PBST per 24 ore per raggiungere la massima compensazione. Nel corso del processo di compensazione, osservare compensazione ottica graduale (Figura 4). NOTA: Questo processo può essere accelerato se le soluzioni sono cambiati immediatamente dopo sezioni sono affondate al fondo della fiala. Nelle soluzioni 75% e 90%, sezioni non affondare fino al fondo del flacone, ma galleggia nel mezzo. </li></ol> 5. montaggio Sezioni tessuto cerebrale <ol style="margin-left: 40px;"><li> Tagliare un No. 1.5 coprioggetto in 5 pezzi per creare un distanziatore. Con una matita righello e diamantata a segnare e rompere il vetrino lungo le linee tratteggiate in Figura 5A. Elimina tegli pezzo centrale, organizzare i 4 pezzi esterni su un vetrino semplice per creare una finestra, e poi spazzolare smalto trasparente sulle cuciture di aderire i pezzi del distanziale alla diapositiva nella configurazione corretta (Figura 5B). NOTA: Il distanziale viene utilizzato per creare lo spazio necessario tra il vetrino e coprioggetto per il montaggio delle sezioni eliminato. Il coprioggetto può essere tagliato in modi diversi per creare qualsiasi finestra dimensione necessaria. Pre-taglio distanziali schiuma sono anche disponibili in commercio. Per consentire smalto si asciughi completamente, è meglio fare le diapositive con distanziatori almeno un giorno prima le sezioni di montaggio. </li><li> Sezioni Trasferire una diapositiva con una pipetta di trasferimento in plastica con la punta tagliata. Assicurati di inserire dintorni con il 90% Gl / PBST. Abbassare delicatamente un coprioggetto sopra sezioni facendo attenzione a non introdurre bolle. Eccesso Gl / PBST può essere malvagio via con un libero di pelucchi. </li><li> Immagine GFP + neuroni contenenti RFP + <em&gt; Cisti Toxoplasma gondii con un microscopio confocale immediatamente (Figura 7A-B), quindi conservare i vetrini piano e coperto dalla luce a 4 ° C. NOTA: In alternativa, tenuta scivola completamente intorno tutti i bordi per memorizzare e ripreso in un secondo momento. L&#39;uso di smalto trasparente per sigillare diapositiva è opzionale e può rendere più difficile da rimuovere coprioggetto se si dovesse rimuovere le sezioni dal vetrino in un secondo momento per ulteriori elaborazioni. </li></ol> 6. Imaging NOTA: Ogni microscopio può essere utilizzato che ha la capacità di ottenere alta risoluzione z-stack. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Dopo aver trovato inizialmente piano focale a 10X, passare ad un obiettivo 20X e la scansione attraverso la sezione di identificare una ciste situata all&#39;interno di una GFP + cellule. Centra la regione di interesse (ROI) nel campo visivo. </li><li> Passare a un obiettivo 40X. Fuoco su e giù attraverso l&#39;intero ROI per assicurarsi che l&#39;intera cella e cyst sono visibili. NOTA: Le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 40X / 1.30 Olio DIC M27. </li><li> Utilizzando il software di imaging installati, ottenere una z-stack che include l&#39;intera cella con cisti. Impostazioni medi utilizzati per ottenere immagini sono mostrate in Figura 6. NOTA: Le impostazioni possono essere necessario modificare a seconda di ogni sezioni investigatori di tessuto e capacità microscopio. </li><li> Ottenere una immagine massima sporgenza del z-stack impostando il numero di proiezioni a 1. Ottenere una vista rotazionale intero impostando il numero di proiezioni a 64. NOTA: Altri pacchetti software sono disponibili e possono essere utilizzati per ottenere la sporgenza massima, rotazionale nonché altre viste immagini z-stack. </li><li> Analizzare l&#39;immagine con il software di analisi delle immagini. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dato che i cambiamenti cellulari nelle cellule ospiti infette sono stati collegati a risultati malattia in infezioni da altri organismi intracellulari come l&#39;HIV, la rabbia, e Chlamydia 18,19, abbiamo sviluppato una tecnica che permetta di studiare le interazioni intime che si verificano tra il sistema nervoso centrale ospitare cellulare e Toxoplasma. Il metodo descritto qui realizza questo obiettivo, consentendo immagini efficiente di neuroni con infezione cronica. Prima dello sviluppo di questo metodo, come immagine era richiede tempo, costosa o impossibile. Ora possiamo usare questa tecnica per rispondere alle domande fondamentali riguardanti l&#39;interazione Toxoplasma -neuron, quali sono specifiche aree neuronali mirate dal parassita? Questo differisce tra i ceppi Toxoplasma? Se le aree cellulari in cui la cisti risiede differire dal resto della cellula (cioè non infettati e dendriti non infette dallo stesso neurone avere lo stesso numero di spine)? Quali sono le caratteristiche cellulari condivise da neuroni infetti? La capacità di rispondere a queste domande è essenziale per la comprensione di come infezione Toxoplasma cambia il CNS, anche a livello di comportamento. Per ottenere le migliori immagini possibili, è molto importante assicurarsi che il tessuto viene tagliato in sezioni anche. Se le sezioni sono irregolari, il vetrino non si siede correttamente sulla sezione che porta a contatto irregolare con l&#39;obiettivo conseguente di imaging sub-ottimali. Durante l&#39;ottimizzazione di questo protocollo, sono state apportate diverse modifiche. Il processo di compensazione originale è stato fatto con fruttosio nel tentativo di riprodurre i risultati mostrati in una tecnica nota come SeeDB 20. Questo metodo è incompatibile con questo modello come si spegnerà la RFP (in particolare mCherry). Un altro passo chiave e probabilmente il più importante di tutti sta permettendo di compensazione massima di sezioni di tessuto. Se non eliminato correttamente, sfondo chiaro di diffrazione sarà più alto eimmagini diventano rumorosi. Abbiamo trovato che l&#39;aggiunta di Tween-20 per il glicerolo ha un&#39;immagine leggermente più chiara rispetto alla sola glicerolo. La tecnologia attuale permette di ottenere immagini di z-stack attraverso sezioni di tessuto cerebrale di spessore 160μm ma in futuro, stiamo cercando di aumentare questo spessore di 500 micron o più per consentire ancora di più in un&#39;analisi approfondita. E &#39;solo guardando l&#39;intera cella e le connessioni che possiamo iniziare a sviluppare una idea meccanicistica di come il cervello è influenzato a livello globale da Toxoplasma. Questo nuovo protocollo offre l&#39;opportunità di studiare l&#39;interazione del Toxoplasma -neuron a livello di singola cellula e di farlo in modo rapido, economico. Dobbiamo ancora esplorare tutte le possibilità di utilizzo di questo protocollo e come si può tradurre in altri sistemi, ma prevediamo che avrà più applicazioni.

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 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

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Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere alta risoluzione, immagini tridimensionali di singoli neuroni che sono infettati dal parassita intracellulare obbligato Toxoplasma gondii. Toxoplasma è spesso considerato uno dei parassiti di maggior successo per la sua vasta gamma ospite intermedio, che comprende l&#39;uomo e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, dopo l&#39;infezione acuta attraverso l&#39;ingestione di cibo o acqua contaminati, Toxoplasma è in grado di causare una infezione persistente del sistema nervoso centrale convertendo dalla sua forma replica veloce (il tachizoite) per la sua lenta replicante e encysting forma (il bradyzoite ). In individui immunocompetenti, questa infezione CNS latente è pensato per essere relativamente asintomatica, ma in individui immunocompromessi, come i malati di AIDS o pazienti sottoposti a trapianto, recrudescenza del parassita può portare alla fatale encefalite toxoplasmic 1,2. Inoltre, studi recenti have dimostrato che l&#39;infezione latente da Toxoplasma può portare a cambiamenti comportamentali nei roditori 3,4, anche se il meccanismo rimane sconosciuto. Sorprendentemente, nonostante questi dati evidenziano l&#39;importanza dell&#39;interazione CNS- Toxoplasma, relativamente poco si sa su questo rapporto, soprattutto a livello cellulare e molecolare. La possibilità di studiare gli aspetti anche semplici dell&#39;interazione cervello parassita è stata ostacolata in parte dalle limitazioni tecnologiche. Ad esempio, la maggior parte del lavoro dimostrando che i neuroni sono le cellule in cui cisti persistono è stato fatto con microscopia elettronica (EM) 5,6. Anche se EM dà alta risoluzione, è ad alta intensità di tempo, di lavoro, e costoso. Immunofluorescenza (IF) saggi sono stati recentemente utilizzato in combinazione con la microscopia confocale per confermare il lavoro fatto da EM 7. Se le analisi sono tecnicamente facili da eseguire e relativamente poco costoso, ma utilizzando queste tecniche per undertand il rapporto spaziale tra la cisti e il neurone infettato richiede la ricostruzione di serie, che richiede molto tempo, tecnicamente difficile, e può portare alla perdita di preziose informazioni. Così, abbiamo sviluppato un metodo che può essere utilizzato con il modello murino di CNS toxoplasmosi e ci permette di immagine la totalità dei neuroni infetti senza EM o immunoistochimica (IHC). Sviluppando tale tecnica, possiamo cominciare a esplorare il rapporto cellulare tra la cellula infettata e la cisti in modo relativamente rapido e poco costoso. Il metodo abbiamo sviluppato combina più recenti tecniche di compensazione otticamente e sezioni di cervello spessore di imaging mediante microscopia confocale 8 con un sistema che segna in cellule in vivo che sono stati iniettati con proteine ​​parassita 9,10. In questo sistema, abbiamo infettare topi Cre-giornalista che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP) solo dopo 11 ricombinazione Cre-mediata con Toxoplasma </em&gt; Ceppi che esprimono una proteina fluorescente rossa (RFP) e iniettano Cre ricombinasi nelle cellule ospiti 9. Questa combinazione ci permette di raccogliere il cervello infetto del mouse dopo l&#39;infezione del sistema nervoso centrale è stabilita, tagliare sezioni di cervello di spessore, e rapidamente individuare le aree di pertinenza immagine trovando la RFP + cisti. È importante notare che, come espressione della GFP cellula ospite dipende unicamente dalla iniezione di Cre da parassiti, infezioni e non su una serie di cellule GFP + non contengono parassiti 10. Poiché l&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di essere in grado di immagine intere neuroni infettati, l&#39;attenzione è solo sulla GFP + neuroni che contengono anche un RFP + cisti, ma il protocollo può essere utilizzato anche per l&#39;immagine della GFP + / RFP - neuroni. Una volta che il cervello infetto è raccolto e sezionata, le sezioni sono resi trasparente glicerolo compensazione. Regioni appropriate di sezioni sono poi ripreso con microscopia confocale, almuggito visualizzazione senza precedenti di cellule ospiti infette e parassiti incistate nella loro interezza. Qui forniamo un protocollo completo per l&#39;identificazione, la compensazione ottica, e di imaging infetti neuroni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1008px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Series 1000 Sectioning System</td>
			<td>Technical Products International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Other vibratomes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#1.5 Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond Scriber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52865-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaject&#174; Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml</td>
			<td>Western Medical Supply, Inc.</td>
			<td>4165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed&#174; Injection Xylazine 20mg/ml</td>
			<td>Lloyd Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZsGreen Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>7906</td>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These are primary cells from human foreskins.&#160; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">200mM L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">25cm2 Canted neck flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1012639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade</td>
			<td>amresco</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:265px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:135px;">H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">20ml Disposable Scintillation Vials</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">FS74500-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td>
			<td style="width:265px;">In-house</td>
			<td>17212945</td>
			<td>This product is purchased from an in-house stockroom.&#160; Other companies are compatible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Imaris Software</td>
			<td style="width:265px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Clear nail polish</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">10ml Syringe with Luer-Lok</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>Other syringes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Three-way Stopcock</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25G x 12&#34; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td>
			<td style="width:265px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">450099</td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii è un obbligato, parassita intracellulare con una gamma ampia di accoglienza, compresi gli esseri umani e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, Toxoplasma stabilisce una infezione persistente per tutta la vita nel cervello. Mentre questa infezione cervello è asintomatica nella maggior parte delle persone immunocompetenti, nel feto in via di sviluppo o individui immunocompromessi, come sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) pazienti, questa predilezione per la persistenza e nel cervello può portare a malattia neurologica devastante. Pertanto, è chiaro che l&#39;interazione cervelli Toxoplasma è fondamentale per la malattia sintomatica prodotto da Toxoplasma, ma abbiamo poco comprensione dell&#39;interazione cellulare o molecolare tra cellule del sistema nervoso centrale (CNS) e il parassita. Nel modello murino di CNS toxoplasmosi è noto da oltre 30 anni che i neuroni sono le cellule in cui il parassita persiste, ma poche informazioni sono disponibili su qualiparte del neurone è generalmente infettato (soma, dendriti, assoni) e se questo rapporto cellulare cambia tra i ceppi. In parte, questa mancanza è secondario alla difficoltà di imaging e visualizzazione interi neuroni infetti da un animale. Tali immagini richiede un complesso di sezionamento di serie e la cucitura del tessuto fotografato al microscopio elettronico o microscopia confocale dopo immunocolorazione. Combinando diverse tecniche, il metodo qui descritto consente l&#39;uso di sezioni spesse (160 micron) per identificare e celle di immagine intera che contengono cisti, permettendo la visualizzazione e analisi del singolo, neuroni cronicamente infette tridimensionale senza bisogno di immunocolorazione, microscopia elettronica , o sezionamento seriale e cuciture. Utilizzando questa tecnica, possiamo cominciare a capire il rapporto cellulare tra il parassita e il neurone infetto.

Figura 7 comprende immagini rappresentative di due cisti contenente GFP + neuroni da 160 micron due differenti sezioni spesse nonché una misurazione rappresentativa della distanza dal cisti-cellula-corpo Figura 7B. Figure 7 A e B illustrano che questa nuova protocollo permette la visualizzazione del neurone infetto nella sua interezza. Figura 7C mostra che con questa tecnica di imaging, è ora possibile quantificare la distanza tra la cisti e corpo cellulare (Imaris 7.7). Figura 7D è una vista completa rotazionale di figura 7B. Visualizzazione dello z-stack in questo modo consente la verifica della cattura completa della cellula e cisti. Figura 7E è un film di rotazione 3D che mostra come l&#39;immagine da 7D può essere analizzato dal software Imaris 7.7 per misurare la distanza dalla cisti il corpo cellulare sia da medio-middle or edge-to-edge. Sebbene la misurazione mostrata è stata effettuata utilizzando una linea retta tra la cisti e corpo cellulare, una misurazione a seguito della GFP + effettivo processo all&#39;organo cellule possono essere generati anche (dati non mostrati). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1: apparecchi chirurgici per la rimozione del cervello di topo. (A) pad assorbente. (B) blocco di schiuma. (C) Gli aghi da definire piedi. (D) 25 G La raccolta del sangue set. (E) rubinetto a 3 vie. (F) siringa da 20 ml per Eparina / Saline. ( G) siringa da 20 ml per il 4% PFA. (H) pinze pollice. (I) forbici Belle, angolato a lato, sharp-sharp. (J) forbici Sharp-sharp. (hemostats K) Kelly. (L) forbici Mayo. (M) </strong&gt; spatola Micro. (N) scintillazione fiala per 4% PFA. Barra di scala = 8 centimetri. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig2highres.jpg" /> Figura 2: raccolta cervello di topo. (A) del mouse immobilizzato e petto spruzzato con il 70% EtOH. (B) al torace esposto. (C) Cassa cavità aperta. (D) Fegato dopo un&#39;adeguata perfusione. (E) Fegato dopo perfusione improprio. (F) cranio esposto. ( G) Cervello con mezzo cranio rimosso. (H) del cervello raccolte in fiala riempita di 4% PFA. (I) del cervello dopo una corretta perfusione. (J) del cervello dopo perfusione improprio. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig3highres.jpg" /> Figura 3: sezionamento cervello di topo. Matri cervello (A) del mouse<html> x. (B) del mouse cervello e gel apposto blocco di montaggio con cianoacrilato all&#39;interno Vibratome camera piena di freddo 1x PBS. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4: processo di compensazione Immagini rappresentative di una sezione di cervello di topo durante ogni fase del processo di compensazione.. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig5highres.jpg" /> Figura 5: Taglio e fissaggio distanziale a scivolare. Un No. 1.5 coprioggetto. Con segni rappresentativi per il taglio coverslip in 5 pezzi. B. Plain vetrino con ogni pezzo di taglio coprioggetto virato in posizione con smalto trasparente per creare una finestra. <html> 2237 / 52237fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figura 6: Schermata di parametri generali utilizzati per l&#39;acquisizione di immagini. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52237/52237fig7highres.jpg" /> Figura 7:. Cisti Toxoplasma gondii possono risiedere all&#39;interno di processi neuronali lontane (AB) immagini sporgenza massima di GFP + neuroni contenenti RFP + cisti (frecce bianche). Barra di scala = 20 micron. (CE) fornire ulteriore visualizzazione e analisi del rapporto cisti-neurone mostrato in B. (C) linea misurazione diretta Imaris generata della distanza dal bordo della cisti al bordo del corpo cellulare (149μm ). (D) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figure 7D.avi" target="_blank">3-D movie rotazionale</a> . (E) Imaris-generatowww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figura &quot;target =&quot; _ blank 7E.avi &quot;&gt; film 3-D che mostra la misura cisti-cellula-corpo sia medio-middle (163 micron) e da bordo a bordo (149 micron).

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3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Usando questo protocollo, siamo stati in grado di immagine di 160 micron di spessore sezioni di cervello di topi infettati con il parassita Toxoplasma gondii, che consente la visualizzazione e l&#39;analisi del rapporto spaziale tra il parassita encysting e il neurone infetto.

3-D imaging e analisi di neuroni infetti<em&gt; In Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K Views.  University of Arizona.  Usando questo protocollo, siamo stati in grado di immagine di 160 micron di spessore sezioni di cervello di topi infettati con il parassita Toxoplasma gondii, che consente la visualizzazione e l'analisi del rapporto spaziale tra il parassita encysting e il neurone infetto. 

Video: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imaging ottico di neuroni nel ganglio Granchio Stomatogastric con tensione sensibili Coloranti

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...