Biz yararlı tartışmalar için tüm Koshy laboratuar teşekkür ederim. Biz Patty Jansma ve tavsiye için Arizona Sinirbilim Anabilim Dalı Üniversitesi teşekkür ve görüntüleme yardım. Biz de onların Vibratome kullanımı için Porreca laboratuar teşekkür ederiz. Bu araştırma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH NS065116, AAK) tarafından desteklenmiştir.

Not: Fareler, Arizona Üniversitesi, yiyecek ve su ad libitum ile ışık / karanlık döngüsü ters yetiştirilen 12 saat olan bir sıcaklık ve nem kontrollü bir odada muhafaza edildi. Deneyler kurallar ve Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında gerçekleştirilmiştir. Tüm çabalar acı en aza indirmek için yapılmıştır. Kre-raportör fareler, C57BL / 6 arka 11 ve ticari olarak temin edilebilir. 1. Fare Enfeksiyon Not: - 12, aşağıda tarif edilen Toxoplasma gondii fare enfeksiyon gibi bir yöntem, daha önce 10 yayınlanan çalışmalarda kullanılmıştır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Fibroblastlar (dikey paketleme) insan alın derisi Toxoplasma suşları büyümek Dulbecco Yüksek Glikoz kültürlenmiş Kartal Ortamı (DMEM),% 10 FBS ile takviye edilmiş, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml strept% 5 CO2 inkübatör içinde, bir T-25 balonuna omycin, ve 2 mM L-glutamin (cDMEM) parazitler, büyük parasitophorus vacuoles gelişimine dek. </li><li> Daha sonra, bir 27 gog iğne bağlanan bir 5 mi şırınga halinde bütün olarak solüsyon bir şişe içinde 2 kez şişenin tabanından hücreler kazıma ve 3 mi bir şırıngaya bağlanmış bir 25 gauge iğne yoluyla elde edilen solüsyon geçirilerek şırınga tahliye parazitler bu ters 15 ml konik bir tüp içinde yerleştirilmiştir. Şırıngaya pistonu bağlayın ve konik tüp içine parazit çözümü geçmektedir. </li><li> Santrifüj 300 x g, 10 dakika boyunca tüpü. Yüzer madde daha sonra 4-6 ml steril USP 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS), pH 7.4 (stok çözelti) pelet tekrar süspansiyon aspire. </li><li> Parazitler orta büyük karenin dört köşe ve orta kareler parazitlerin sayısını daha sonra yerleşmek saymak için stok solüsyonu 10 ul Hemasitometre yükleyin, 5-10 dakika bekleyin. </li><li> Paragraf seyreltin100K / 200 ul, uygun inokulum boyutuna the PBS daha sonra 200 ul toplam hacim periton içine (ip) enjekte fareler 1x. NOT: Bu prosedür için, fareler 100 K Tip III (CEP) PBS 1x 200 ul 13 takizoit aşılanmıştır. Toksoplazma diğer suşları ile fareler enfekte olduğunda, inokulum konsantrasyonunun hastalık oluşturma etkisi hesaba ayarlanması gerekebilir. </li></ol> 2. Perfüzyon ve Beyin Hasat Not: Bu kistlerin tepe numaraları fare beyninde bulunan olduğu zaman noktasını temsil eder Bu protokol, 21 gün sonra enfeksiyonu (dpi) yapıldı, ancak diğer zaman noktaları kullanılabilir. 17 - kist boyutu, sayısı, yeri ve varlığı ya da yokluğu fare zorlanma, parazit gerilme türü yanı sıra aşı miktarı 7,14 dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Müfettişler tek tek fare ve Toxoplas için uygun inokülumu belirlemek gerekirma suşu o / o kullanır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Kur tüm cerrahi hasat aletleri (Şekil 1). </li><li> Her bir fare için, hazırlama ve buz üzerinde tutulur:% 0.9 sodyum klorid (NaCl) ile doldurulmuş 20 ml şırınga + 10 U / ml Heparin 1x steril USP PBS (Heparin / tuzlu su) içinde; 20 ml&#39;lik bir enjektör% 4 paraformaldehit (PFA) ile doldurulmuştur; 15 mi% 4 PFA ile sintilasyon şişesi. Birden fareleri için, daha sonra her bir perfüzyon için solüsyonu ile dolu yeni bir şırınga hazırlamak her fare için gerekli olan her bir çözeltinin toplam miktarı ile dolu bir beher hazırlar. </li><li> 200 ul / Ketamin / Ksilazin kokteyli vücut ağırlığı 25 g (24 mg / ml ve 4.8 mg / ml) ilgi günde fare ip anestezisi. Ayak tutam refleksi kontrol ederek anestezi düzeyi için fare izleyin. Fare bir firma ayak tutam hiçbir yanıt gösterir sadece bir kez protokol ile devam edin. Not: anestezi uygun seviyede ulaşılırsa Anestezi başka yöntemler sürece kullanılabilecektirprotokol ile devam. </li><li> Kapalı köpük platformda yatar pozisyonda fare yerleştirin. Sonra% 70 Etanol (EtOH) (Şekil 2A) ile göğüs ve karın sprey ayaklarına dört uzuvları dışarı Pin. Fare altında birkaç steril kağıt havlu eklenmesi perfüzyon sıvı taşma edilmesine yardımcı olmak için kullanılabilir. </li><li> Sadece forseps ile sternum altında kaldırın ardından cilde bir kesi yapmak için makas kullanın. Göğüs (Şekil 2B) ortaya çıkarmak için geri cilt çekin. </li><li> Süreci kılıç şeklinde kaldırın ve açık açık uzakta diyaframdan disseke edilir karaciğer açığa hemen diyaframın altında bir karın kesi yapmak. İki insizyon, solda diğeri diyafram aracılığıyla sağ ve kaburga altındaki birini yapın. Yaklaşık 1 / 2-2 / 3 yollu kadar sonra göğüs boşluğuna (Şekil 2C) açmak için geri yansır göğüs kafesi, sol ve sağ kesiler uzatın. NOT: Take bakım herhangi bir organ kesmek için değil ya da büyük kan damarları duperfüzyon kalitesini tehlikeye sokacaktır Bunu yaparken bu işlemi halka. </li><li> 10-20 ml% 4 PFA ve ardından 10-20 ml Heparin / tuzlu su ile transkardiyal serpmek. NOT: perfüzyon düzgün yapılırsa, karaciğer (Şekil 2D) tan kırmızı dönüşecektir. Eğer düzgün yapılmazsa, kan damarları görünür (Şekil 2E) olacaktır. </li><li> Onun karın üzerine fareyi çevirin, yeniden-pin ayakları daha sonra% 70 EtOH ile baş ve boyun sprey. Boyun tabanından cilt kaldırın ve bir kesi yapmak. Kafatası (Şekil 2F) açığa cilt çıkarın. Omuz seviyesinde baş başını kesmek. Yavaşça beyin kaldırmak, kafatası çıkarın ve% 4 PFA (Şekil 2G-lH) ile dolu bir sintilasyon şişesine içine yerleştirin. NOT: iyi perfüze Eğer, beyin görünür kan damarları (Şekil 2I) beyaz görünecektir. Beyin iyi perfüze değilse, kan damarları görünür (Şekil 2J) olacaktır. </li><li> Kıvılcımını yerleştirin4 ° C &#39;de% 4 PFA beyin yon şişe gece boyunca ışıktan sahiptir. Soğutulmuş 1X PBS ile donatılmış bir sintilasyon şişesine olmayan USP 1 x PBS&#39;de beyin ve transfer yıkayın. Işıktan kapalı 4 ° C &#39;de 1 x PBS&#39;de beyin, saklayın. NOT: Başarılı takas ve görüntüleme kadar bir ay süreyle 1x PBS içinde saklanan bölümler ile gerçekleştirilebilir, ancak PFA fiksasyon ters olacak ve PBS uzun süreli depolama gibi birkaç gün içinde beyin optimal görüntülerin daha az yol açabilecek bu bölümünde en iyi olduğunu olmuştur . Otofloresans ve artan bulanıklık bir ay veya daha uzun süre 1x PBS depolamadan sonra görüntülenmiş bazı bölümlerde not edilmiştir. </li></ol> 3. Beyin Kesit <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1x PBS beyni çıkarın ve daha hassas sağlamak için bir beyin matrisi (Şekil 3A) içine yerleştirin ve hatta beynin içinden keser. Varsa, beyincik ve koku ampuller keserek, ve daha sonra 2 veya 3 bölüme koronal beyin kesti. <br /&gt; Not: Kırpma ve beyin kesme bir beyin matris yardımı olmadan yapılabilir. Vibratome kesme mesafesi bağlıdır koronal kesme bölümlerinin sayısı kullanılır. sagital ve koronal bölümleri en sık nöroanatomik tanımlama için kullanılır ama beyin, herhangi bir yönde kesitli olabilir. </li><li> Siyanoakrilat ile bir örnek montaj blok üzerine her beyin bölümü yapıştırın. Destek için beyin bölümünde (Şekil 3B) arkasında% 5 agaroz jel küçük bir blok yapıştırmayın. NOT: Diğer destek mekanizmaları kullanılabilir, ancak destek olmadan, Vibratome düzensiz kesitlerinin neden beyne itebilir. </li><li> Vibratome kalın bölümler 4 hızı ve 9 genliği ayarlanmış 160 mikron (görüntüleme için kullanılan objektif çalışma mesafesi) içine doku kesin. Not: hız ve genliği ayarlar özellikle makineye bağlı olarak ayarlanabilir, daha yumuşak bölümleri elde etmek için kullanılır. Ayarları iseDoğru değil, sonuç düzensiz bölümleri, doku ya da sohbet işaretleri yırtılma olabilir. </li><li> Onlar bir hafta içinde temizlenmiş olacak eğer 1x PBS soğutulmuş taze dolu bir parıldama şişesine, içine doku bölümleri toplayın. Bölümler bir hafta içinde temizlenmiş olacak değilseniz, -20 ° C&#39;de karyo-koruyucu solüsyon ve mağaza ile dolu 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yer bölümleri. </li></ol> Beyin Doku Bölüm 4. Optik Takas NOT: Bu protokol daha önce yayımlanmış bir yönteme 8 modifiye edilmiştir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1x PBS +% 2 Tween-20 (Gl / PBST),% 25,% 50,% 75 ve% 90 hacim / hacim Gliserol hazırlayın. </li><li> Karyo-koruyucu olarak ise, 1 x PBS içerisinde çalkala ve% 25 Gl / PBST 10 ml su ihtiva eden bir parıltı şişesine transfer 1x PBS bölümleri çıkarmak ya da. 12 saat süre ile, maruz ışığa kapalı 4 ° C sıcaklıkta bir çalkalayıcı üzerinde yer tüpe konulmuştur. </li><li> Tüm bölümler bo battı olduğunu onaylayınŞişenin ttom. Kesitler daha sonra 12 saat süre ile, ışığa maruz kalma ile ilgili kapalı, 4 ° C&#39;de bir çalkalayıcı üzerinde 10 ml% 50 Gl / PBST ile şişe ve yerini doldurmak karşılamak için yeterli bırakarak,% 25 Gl / PBST aspire. % 75 Gl / PBST sonra% 90 Gl / PBST için bu işlemi tekrarlayın. Maksimal takas ulaşmak için 24 saat boyunca% 90 Gl / PBST bölümleri bırakın. Takas işleminin boyunca, kademeli optik takas (Şekil 4) gözlemlemek. NOT: çözüm bölümleri şişenin dibine battı hemen sonra değişti, bu süreç hızlandırılmış olabilir. % 75 ve% 90 çözümlerinde, bölümler şişenin dibine tüm yol lavabo olmaz ama ortada yüzer. </li></ol> 5. Montaj Beyin Doku Bölümler <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bir ara parçası oluşturmak için 5 parçaya bir numaralı 1.5 lamel kesin. Şekil 5A gösterilen kesikli çizgiler boyunca lamel puan ve kırmak için bir cetvel ve elmas uçlu kalem kullanın. Sil to bir pencere oluşturmak için düz cam slayt 4 dış parçaları düzenlemek, parça merkezi, ve sonra doğru konfigürasyonda (Şekil 5B) slayt için aralama parçaları yapıştırmak için dikişleri üzerine şeffaf tırnak cilası fırça. NOT: boşluk slayt ve temizlenmiş bölümleri montajı için lamel arasında gerekli alan oluşturmak için kullanılır. lamel gerekli herhangi bir boyut penceresi oluşturmak için farklı şekillerde kesilebilir. Önceden kesilmiş köpük ara parçaları da ticari olarak temin edilebilir. Oje tamamen kuruması için, en az bir gün önce montaj bölümlere ayırıcılar ile slaytlar yapmak en iyisidir. </li><li> Ucu ile plastik bir transfer pipeti kullanarak bir slayt aktarın bölümleri kesti. % 90 Gl / PBST ile çevredeki doldurmak için emin olun. Dikkatle emin herhangi bir kabarcıkları tanıtmak için değil yapım bölümler üzerinde bir lamel düşük. Aşırı Gl / PBST bir tüy bırakmayan silin uzakta wicked olabilir. </li><li> Görüntü GFP + RFP içeren nöronlar + <em&gt; Konfokal mikroskop hemen (Şekil 7A-B) Daha sonra mağaza slaytlar düz ve 4 ° C&#39;de ışıktan kaplı ile Toxoplasma gondii kistler. NOT: Alternatif, mühür tamamen çevresindeki tüm kenarları saklamak ve daha sonra görüntülü slaytlar. Slayt mühür net oje kullanımı isteğe bağlıdır ve bir daha fazla işlem için daha sonraki bir tarihte slayt bölümleri kaldırmak olsaydı daha zor lamel kaldırmak için yapabilir. </li></ol> 6. Görüntüleme NOT: Herhangi bir mikroskop yüksek çözünürlüklü z yığınları elde yeteneğine sahip olduğu kullanılabilir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Başlangıçta 10X de odak düzlemi bulduktan sonra, bir 20X objektif değiştirmek ve bir GFP + hücre içinde bulunan bir kist tespit etmek bölümü üzerinden tarama. Görüş alanında ilgi (ROI) bölgesi Merkezlenmesi. </li><li> 40X objektif değiştirin. Emin olmak için tüm ROI ile yukarı ve aşağı odaklanın tüm hücre ve cySt görebilir. NOT: Görüntüler 40X / 1.30 Yağ DIC M27 amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. </li><li> Yüklü görüntüleme yazılımı kullanarak, kist ile tüm hücreyi içeren bir z-yığını edinin. Görüntüler elde etmek için kullanılan ortalama ayar, Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. NOT: Ayarlar her araştırmacılar doku kesitlerinde ve mikroskop özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. </li><li> 64 projeksiyonlar sayısını ayarlayarak tam dönme görünüm elde 1. projeksiyonlar sayısını ayarlayarak z-yığını maksimum projeksiyon görüntü elde. NOT: Diğer yazılım paketleri mevcuttur ve maksimum projeksiyon elde etmek için kullanılabilir, dönme gibi z-yığın görüntüleri diğer görünümler. </li><li> Görüntü analiz yazılımı ile görüntüyü analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats.">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice.">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li><li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii:+a+histological,+immunocytochemical+and+ultrastructural+study.">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li><li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain:+A+Confocal+Study.">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li><li>Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices.">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions.">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li><li>Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites.">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li><li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host.">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li><li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice.">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Enfekte konak hücrelerde hücresel değişiklikler gibi HIV, kuduz, ve Chlamydia 18,19 gibi diğer hücre içi organizmalar ile enfeksiyonlarda hastalık sonuçları ile bağlantılı olduğunu göz önüne alındığında, bize MSS arasında meydana samimi etkileşimleri çalışmak için izin verecek bir teknik geliştirdi hücre ve Toxoplasma ev sahipliği. Burada anlatılan yöntem kronik olarak enfekte nöronların verimli görüntüleme sağlayarak bu hedefe gerçekleştirir. Bu yöntemin geli...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Bu yöntemin genel amacı yüksek çözünürlük, zorunlu hücre içi parazit Toxoplasma gondii ile enfekte olan bireysel nöronlar üç boyutlu görüntüler elde etmektir. Toksoplazma sık sık insanları ve kemirgenler içeren geniş ara konak aralığı, en başarılı parazitlerin biri olarak kabul edilir. Insanlarda ve kemirgenler hem de, kontamine yiyecek veya su tüketilmesi yoluyla akut enfeksiyondan sonra, Toxoplasma formunu yavaş-kopyalayan onun hızlı kopyalayan formu (tachyzoite) dönüştürme ve encysting ile MSS kalıcı enfeksiyona neden yapabiliyor (bradyzoite ). Bağışıklığa sahip bireylerde bu gizli merkezi sinir sistemi enfeksiyonu nispeten asemptomatik olduğu düşünülmektedir, ancak, AİDS hastalarında ya da transplant alıcıları gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde, parazitin açılma ölümcül Toksoplazma ensefalit 1,2 yol açabilir. Buna ek olarak, son çalışmalar hamekanizma bilinmemektedir olsa Toksoplazma latent infeksiyon, kemirgenler 3,4 davranışsal değişikliklere yol açabilir göstermiştir ettik. Şaşırtıcı, CNS- Toxoplasma etkileşimin önemini vurgulayarak, bu verilere rağmen, nispeten daha az, özellikle hücresel ve moleküler düzeyde, bu ilişki hakkında bilinmektedir. Beyin-parazit etkileşimi bile basit yönlerini incelemek için yeteneği teknolojik sınırlamalar kısmen engel olmuştur. Örneğin, işin çoğunluğu nöronlar kistler elektron mikroskobu (EM) 5,6 ile yapılmıştır devam ettiği hücrelerin olduğunu gösteren. EM yüksek çözünürlük verir rağmen, zaman alıcı, emek yoğun ve pahalı. İmmünofloresan (IF) tahlilleri son zamanlarda EM 7 tarafından yapılan işi onaylamak için konfokal mikroskobu ile birlikte kullanılmıştır. Deneyleri gerçekleştirmek için teknik olarak kolay ve nispeten ucuz, ama under bu teknikleri kullanarak IFtand kist ve enfekte nöron arasındaki mekansal ilişki süresi, teknik olarak zor alıcı ve değerli bilgiler kaybına yol açabilir seri rekonstrüksiyon gerektirir. Böylece, biz MSS toksoplazma fare modeli ile kullanılan ve EM veya immünohistokimyasal (İHK) olmadan görüntü enfekte nöronların tamamını bize izin verir edilebilir bir yöntem geliştirdik. Böyle bir teknik geliştirerek, biz nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde enfekte hücre ve kist arasındaki ilişkiyi keşfetmeye hücresel başlayabilirsiniz. Geliştirdiğimiz yöntem parazit proteinleri 9,10 ile enjekte edilmiş in vivo hücrelerinde işaretleri bir sistem ile konfokal mikroskopi 8 ile optik takas ve görüntüleme kalın beyin bölümleri için yeni teknikler birleştirir. Bu sistemde, Toksoplazma rekombinasyonu 11 Kre-aracılı sonra yeşil floresan protein (GFP) ifade Cre raportör fareleri enfekte </em&gt; Kırmızı floresan proteini (RFP) ifade konak hücrelere 9 içine Cre recombinase enjekte suşları. Bu kombinasyon MSS enfeksiyonu kurulduktan sonra, enfekte fare beyin hasat kalın beyin bölümleri kesip, hızla RFP + kistleri bularak görüntüye uygun alanları belirlemek için bize izin verir. Bu GFP konakçı hücre GFP + hücrelerinin sayısı parazitleri 10 içermez, enfeksiyon parazitlerin Cre enjeksiyon yalnızca bağlıdır olup olarak dikkat etmek önemlidir. Bu protokolün amacı görüntü tüm enfekte nöronlar edebilmek için olduğu gibi, odak sadece GFP + ayrıca bir RFP + kist ihtiva nöronlar üzerinde, ancak protokol de görüntü GFP + / RFP kullanılabilir - nöronlar. Enfekte beyin hasat ve bölümlere sonra, bölümler gliserol takas yoluyla şeffaf hale getirilir. Bölümlerin uygun bölgeler daha sonra konfokal mikroskopi, arkadaşları ile görüntülüenfekte olmuş bir ev sahibi hücreleri ve bunların bir bütün olarak, keseli parazitlerin belirtilenlerin benzeri görüntüleme. Burada bir tanımlama için tam protokol, optik takas ve görüntüleme enfekte nöronlar sağlamak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1008px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Series 1000 Sectioning System</td>
			<td>Technical Products International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Other vibratomes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#1.5 Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond Scriber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52865-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaject&#174; Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml</td>
			<td>Western Medical Supply, Inc.</td>
			<td>4165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed&#174; Injection Xylazine 20mg/ml</td>
			<td>Lloyd Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZsGreen Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>7906</td>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These are primary cells from human foreskins.&#160; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">200mM L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">25cm2 Canted neck flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1012639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade</td>
			<td>amresco</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:265px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:135px;">H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">20ml Disposable Scintillation Vials</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">FS74500-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td>
			<td style="width:265px;">In-house</td>
			<td>17212945</td>
			<td>This product is purchased from an in-house stockroom.&#160; Other companies are compatible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Imaris Software</td>
			<td style="width:265px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Clear nail polish</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">10ml Syringe with Luer-Lok</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>Other syringes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Three-way Stopcock</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25G x 12&#34; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td>
			<td style="width:265px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">450099</td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii, insanlarda ve kemirgenler dahil olmak üzere, geniş bir konak yelpazesi ile bir obligat hücre içi parazit. Hem insanlarda hem de kemirgenler ise, Toxoplasma beyinde bir ömür boyu kalıcı enfeksiyon oluşturur. Bu beyin enfeksiyonu gelişmekte olan fetus ya da beyinde kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AİDS) hasta için bu tercihte ve sebat gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde, çoğu immün sistemi kişilerde asemptomatik iken yıkıcı nörolojik hastalığa yol açabilir. Böylece,-beyin-Toxoplasma etkileşim Toksoplazma tarafından üretilen semptomatik hastalığı kritik, henüz biz merkezi sinir sistemi (MSS) ve parazit hücreleri arasındaki hücresel veya moleküler etkileşim az bir anlayışa sahip olduğu açıktır. CNS fare modelinde bu nöronlar parazit devam ettiği hücreler 30 yıldır bilinmektedir toksoplazmozis, ama çok az bilgi hangi kullanılabilirnöronun parçası genellikle (soma, dendrit, akson) bulaşmış ve bu hücresel ilişki suşları arasında değişir eğer. Bölümünde, bu eksikliği görüntüleme zorluk sekonder ve bir hayvandan bütün enfekte nöronlar görselleştirme olduğunu. Bu tür görüntüler tipik seri kesitlerinin ve elektron mikroskobu veya immün sonra konfokal mikroskobu ile görüntülü doku dikiş gerektirir. Çeşitli teknikler birleştirerek, burada açıklanan yöntem immün gerek kalmadan üç boyutlu görselleştirme ve bireysel, kronik olarak enfekte nöronların analizini sağlayan, tespit ve kistler içeren görüntü tüm hücreleri kalın bölümlerin kullanımını (160 mikron) sağlayan, elektron mikroskobu veya seri kesit ve dikiş. Bu tekniği kullanarak, parazit ve enfekte nöron arasındaki hücresel ilişkiyi anlamak başlayabilirsiniz.

Şekil 7, A ve B, bu yeni olduğu kist içeren iki farklı 160 mikron kalınlığında kesitler aynı zamanda Şekil 7B&#39;de kist-hücre vücut mesafenin bir temsili ölçüm. Şekil gelen GFP + nöronlar göstermektedir Şekil 7, iki temsili görüntüleri içerir Protokol, bir bütün olarak enfekte nöron olarak gösterebilir. Şekil 7C, bu görüntüleme tekniği ile birlikte, kist ve hücre gövdesi (I...

Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Bu protokolü kullanarak, biz görselleştirme ve encysting parazitin enfekte nöron arasındaki mekansal ilişkinin analizini sağlayan parazit Toxoplasma gondii ile enfekte farelerde görüntü 160 mikron kalınlığında beyin bölümlerine başardık.

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte<em&gt; İn Vivo</em&gt; Ile<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K Görüntüleme.  University of Arizona.  Bu protokolü kullanarak, biz görselleştirme ve encysting parazitin enfekte nöron arasındaki mekansal ilişkinin analizini sağlayan parazit Toxoplasma gondii ile enfekte farelerde görüntü 160 mikron kalınlığında beyin bölümlerine başardık. 

Video: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Nörobilim

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Gerilim duyarlı Boyalar ile Yengeç Stomatogastric Ganglion Nöronlar Optik Görüntüleme

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

Vivo Multimodal görüntüleme ve fare lazer kaynaklı Choroidal neovaskülarizasyon Model analizi

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.