Los autores desean reconocer la Università degli Studi di Milano para el apoyo a Eliana Di Cairano (beca post-doctoral) y Stefania Moretti (beca de doctorado). Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de la Universidad de PUR CP Nos gustaría dar las gracias al profesor Jeremy M. Henley, Facultad de Bioquímica de la Universidad de Bristol, Reino Unido, por el pHluorin construir y el Dr. Francesco Dotti para la asistencia en el análisis de datos, y Silvia Marsicano para la asistencia técnica.

1. Cultivo celular y transfección <ol><li> Cultivo de células SH-SY5Y NOTA: Los experimentos se han realizado utilizando el neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. Células SH-SY5Y crecen como una mezcla de grupos flotantes y las células adherentes. Siga las instrucciones indicadas en el protocolo (densidad celular, relación de división, etc.) Para tener células que crecen firmemente unidos a la cubierta de cristal, que es crucial para TIRFM. <ol><li> Antes de comenzar, bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, hacer que el volumen oportuna de solución de fosfato estéril solución salina tamponada (PBS) y medio de cultivo. <ol><li> Hacer 50 ml de PBS con concentraciones de NaCl 150 mM, tampón fosfato 24 mM, pH 7,4. Se filtra la solución. </li><li> Hacer 50 ml de medio de células de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml), L-glutamina ( 2 mM), ypiruvato de sodio (1 mM). Se filtra la solución. </li></ol></li><li> Retire medio de crecimiento completo y lavar las células con 3 ml de PBS. </li><li> Se incuban las células con 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,05% (EDTA) (por 6 cm plato Petri) durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 y separar las células con una pipeta. </li><li> Inactivar la tripsina mediante la adición de 2 ml de DMEM, y recoger las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante, añadir 1 ml de DMEM al sedimento y la pipeta la solución arriba y hacia abajo suficientemente para dispersar las células en una sola suspensión celular. </li><li> Ellos dividieron 1: 4 en una nueva placa de Petri de diámetro 6 cm que contiene 3 ml de medio completo. Mantener las células en cultivo en placas de 6 cm de diámetro Petri, a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Sub-cultivo una vez a la semana o cuando se han cubierto 80 - 90% de la superficie. </li></ol></li><li> Chapado de células SH-SY5Y para imágenes <ol><li> Para los experimentos TIRFM, placacélulas sobre cubiertas de vidrio. Emplear vidrio cubre con 0,17 ± 0,005 mm de espesor y un índice de refracción 1,5255 ± 0,00015. Antes de empezar, prepare los cubreobjetos de vidrio de la siguiente manera: <ol><li> Limpie el vidrio cubre con etanol al 90%, O / N. </li><li> Enjuague bien en agua destilada (tres cambios de agua destilada). Vidrio seco cubre en un horno de secado. </li><li> Lugar cubre en platos Petri de vidrio y esterilizar en un horno precalentado a 200 ° C durante 3 horas. </li></ol></li><li> El día antes de la transfección, coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 3,5 cm, agregar 1 ml de medio de cultivo y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. </li><li> Tripsinizar las células como se describe en los pasos 1.1.3 - 1.1.5, suspender el sedimento celular en 1 ml de medio completo y contar. Calcular el volumen correcto de la suspensión celular para añadir a cada plato Petri para producir 3 x 10 5 células / pocillo. Se requiere esta densidad óptima para el crecimiento celular y transfección eficiente. Se incuba a 37 ° Cen un incubador de CO2 al 5% O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection por polietilenimina (PEI) NOTA: Para visualizar la dinámica de las vesículas sinápticas, se ha utilizado vector que contiene pCB6 synapto-pHluorin. El synapto-pHluorin ha sido generada por fusión en el marco de una variante sensible al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) 16 y la proteína de membrana vesicular sinaptobrevina 2. La construcción se ha empleado ampliamente para investigar las propiedades de vesículas sinápticas dentro de las neuronas 9. <ol><li> Antes de iniciar la transfección, hacer 10 ml de las siguientes soluciones. Mantenga las soluciones como máximo 1 mes. <ol><li> Hacer una solución 150 mM de NaCl. Ajustar el pH a 5,5 con HCl 0,01 N. </li><li> Prepare una solución de PEI en el 10% de polietilenimina (PEI; 25 kDa lineal) en solución de NaCl 150 mM. El pH de la solución se eleva a 8,8. Ajustar el pH a 7,8 con HCl 0,01 N. </li></ol></li><li> 24 horas después de la siembra, se elimina el medio y refrescar con 1,5 ml demedio completo. Mantenga las células a 37 ° C, en un incubador de CO2 al 5%. </li><li> Bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 3 g de ADN plásmido a 25 l de solución de NaCl 150 mM y 100 l de solución de PEI por 3,5 cm de placa de Petri. </li><li> Vortex durante 10 segundos, a continuación, incubar la mezcla de ADN / PEI durante 30 min a RT. </li><li> Añadir con cuidado la mezcla de ADN / PEI a la placa de Petri que contiene cubreobjetos con células y agitar suavemente para distribuir por igual el reactivo en la placa de Petri. </li><li> Después de 4 horas cambiar el medio y se incuban las células O / N a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Realizar experimentos de imagen 24 a 48 horas después de la transfección. </li></ol></li></ol> Imagen 2. Celular por reflexión interna total microscopía de fluorescencia (TIRFM) <ol><li> Imaging configuración <ol><li> Realizar imagen TIRF con la puesta a punto se describe en la Figura 1. Comprende un motorizado invertidamicroscopio (Figura 1, recuadro A), la fuente de láser (Figura 1, recuadro B) y el TIRF deslizante (Figura 1, recuadro C). Alcanzar la iluminación TIRFM a través de una alta apertura numérica (NA 1.45 Alfa Plan-Fluar) aceite de 100X, objetivo de inmersión. </li><li> Para la iluminación TIRFM, emplear una multilínea (458/488/514 nm) 100 mW láser de argón-ion. El uso de una fibra monomodo, introducir la luz láser polarizada linealmente en la trayectoria del rayo, mediante el control deslizante TIRF. Insertar el control deslizante TIRF en el plano diafragma de campo luminoso de la trayectoria del haz de luz incidente. <ol><li> Por amplia iluminación de campo, conecte el microscopio a una lámpara de mercurio de arco corto convencional HBO luz blanca. Un doble prisma mantenedora de polarización en el control deslizante asegura la combinación simultánea de TIRF iluminación y luz blanca. </li></ol></li><li> Se filtra la luz láser con un filtro de excitación (banda ancho de 488/10 nm) montado en una rueda de filtros, introducido en la trayectoria del láser. Emplearuna alta velocidad, controlado por software, obturador para permitir un control rápido de la iluminación láser. Para el análisis pHluorin, montar una banda paso 525/50 nm filtro de emisión. Captura imágenes digitales (512 x 512 píxeles) en una cámara CCD enfriado rápido con el software Image ProPlus. </li></ol></li><li> El logro de la iluminación TIRF (Figura 2) <ol><li> Encienda el láser, el ordenador, la cámara y la rueda de filtros, y los controladores de obturación; luego, esperar 20 minutos antes de comenzar el experimento como los láseres necesitan calentarse y estabilizarse. </li><li> Antes de formación de imágenes, hacer que el volumen oportuno de las siguientes soluciones. <ol><li> Hacer 50 ml de solución de Krebs (KRH) en NaCl 125 mM, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) (tamponada a pH 7,4), 2 mM CaCl 2, y glucosa 6 mM. </li><li> Hacer 10 ml de solución de KCl-KRH (pH 7,4) en NaCl 80 mM, KCl 50 mM, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (tamponada a pH 7,4), 2 mM CaCl 2, y glucosa 6 mM. </li></ol></li><li> Retire la cubierta de cristal con células transfectadas e insertarlo en la cámara de imagen apropiado. Montar la cámara y añadir 500 l de solución KRH en el centro del cristal. </li><li> Añadir el aceite sobre el objetivo. Coloque la cámara de imágenes en la platina del microscopio y la posición del objetivo bajo el cubreobjetos de vidrio. Colocar la tapa de seguridad sobre la muestra. </li><li> En el modo de epifluorescencia, se centran en el cubreobjetos (superficie superior) y elija células transfectadas colocados en el centro de la cámara. Seleccione las celdas cuya señal fluorescente puede grabarse claramente utilizando un tiempo de exposición por debajo de 80 ms. </li><li> Bajo el control del software, cambiar a la iluminación TIRF en modo directo. </li><li> Para establecer la configuración TIRF, compruebe la posición del haz que emerge del objetivo, en la portada de la muestra (Figura 2B). Cuando el haz se coloca en el centro de tél lente objetivo (Figura 2A, izquierda), un lugar es visible en el centro de la cubierta de la muestra TIRF (Figura 2B, a la izquierda) y la célula se forma la imagen en el modo de epifluorescencia (varios planos de enfoque, de alta fluorescencia de fondo; Figura 2C, izquierda) . </li><li> Para alcanzar el ángulo crítico, mover el punto enfocado en la dirección Y (hacia adelante o hacia atrás; Figura 2B, centro) con el tornillo de ajuste del ángulo en el control deslizante TIRF (Figura 1C). Cuando el haz converge en el plano de la muestra en un ángulo mayor que el ángulo crítico (Figura 2A, derecha), el punto desaparece y una, delgada, línea recta centrado es evidente en el medio de la cubierta de la muestra (Figura 2B, derecha). </li><li> Para ajustar el ángulo TIRF utilizar la muestra de células (Figura 2C). Ver la imagen de fluorescencia en el video, en esta etapa, una imagen-epifluorescencia como aún es visible. Con cuidado, mueva el tornillo hasta TIRF concondición se logra: un solo plano óptico de la celda está en el foco (es decir, la membrana plasmática en contacto con la hoja de la cubierta), esto resulta en una imagen plana con alto contraste (Figura 2C, derecha). </li></ol></li><li> Muestra imágenes <ol><li> Ajuste el canal único experimento de lapso de tiempo. Para minimizar fotoblanqueo, capturar la imagen con bajo tiempo de exposición y de alta ganancia. Tiempos de exposición apropiados son entre 40 - 80 ms. Adquirir imágenes en 1 - 2 Hz de frecuencia de muestreo. La cinética de vesículas de muestreo pueden ser mejor apreciado en mayor frecuencia (10 Hz). El tiempo regular de observación es generalmente de 2 min. </li><li> Añadir 500 l de células de solución KRH y grabar en el modo de TIRFM. Esta es la condición de reposo. Guarde las imágenes secuenciales de tiempo. </li><li> Centrarse en la misma celda y registro en las mismas condiciones de reposo (potencia láser, tiempo de exposición, de número de fotograma). Después de cinco marcos, añadir 500 l de solución de KCl-KRH y mantener KCl en la cámara.Esta es la condición estimulada; guardar las imágenes secuenciales de tiempo. </li></ol></li></ol> Análisis 3. Imagen y Procesamiento de Datos NOTA: Para analizar las imágenes, macros se han desarrollado en el laboratorio, basado en funciones existentes del software de análisis de imagen; macros similares están disponibles en línea (URL proporcionado en la Tabla de Materiales y Equipos). <ol><li> Cuantificación intensidad de fluorescencia <ol><li> Utilice una macro &quot;intensidad de fluorescencia Sequence&quot; para la cuantificación intensidad de fluorescencia en una región de interés (ROI) de la imagen, en el transcurso de la película. </li><li> Abra las imágenes en tiempo secuencial. Ir al menú de macro y seleccione &#39;intensidad de fluorescencia Secuencia&#39;. En la ventana &quot;Análisis&quot; aparece &quot;seleccione el retorno de la inversión&quot;. </li><li> Elija una de las herramientas de selección en el menú para crear el ROI. Coloque 3 ROIs en las regiones de la membrana celular sin manchas (fondo ROI). Emplear this &quot;fondo ROI&quot; para evaluar la photobleaching y para establecer el umbral para el análisis de actividad de fusión (Figura 3A). </li></ol></li><li> Corrección Photobleaching y determinación del umbral (Figura 3B) <ol><li> Para evaluar la fotoblanqueo, abra las filas de fluorescencia intensidad &quot;ROI de fondo&quot;, (Figura 3ba). Normalizar los valores de intensidad de fluorescencia en cada marco para el valor de intensidad inicial (F0) (F / F0) (Figura 3BB). La media de los valores. </li><li> Resaltar los datos medios y crear un esquema lineal utilizando las opciones de menú gráfico. </li><li> Desde el menú de análisis de datos, seleccione &quot;línea de tendencia&quot; para abrir el diálogo de análisis de la representación. Seleccione el tipo de regresión. Ajuste de regresión &quot;exponencial&quot;. A continuación, seleccione &quot;ecuación de pantalla en la carta&quot;. En la ventana gráfica, la ecuación exponencial aparece y los valores de los parámetros se asignan automáticamente, (Figura 3bc </strong&gt;). </li><li> Aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada trama de la siguiente manera: Fn (corregido) = Fn / exp (-n * a) Fn = intensidad de la fluorescencia experimental medido en la trama n; n = número de fotogramas; a = factor de blanqueo (constante que expresa la tasa de pérdida de intensidad debido a photobleaching; &#160; Figura 3Bd). </li><li> Para establecer el umbral, abrir un normalizado y corregido &quot;fondo ROI&quot;, calcular la media de la señal de fluorescencia y su desviación estándar (SD). El valor promedio más 3 SD representa el umbral (Figura 3be). Utilice este umbral para el análisis de datos. </li></ol></li><li> Selección de los eventos de fusión utilizando un procedimiento semiautomático <ol><li> Abra las imágenes secuenciales en el tiempo con el software de análisis de imágenes. Aplicar un filtro de Gauss a la secuencia de imagen activa. </li><li> Analizar las imágenes con la función &quot;contar objetos&quot; o una macro que permite la selecciónde un objeto cuya píxeles tienen intensidad media de fluorescencia dentro de un rango definido. Ajuste el rango de intensidad de forma manual, utilizando la función de umbral (ir al menú de la barra, defina medida → umbral para resaltar el área de interés). Un umbral adecuado es 30% más que la señal de fondo fluorescente local. </li><li> Aplicar una macro &quot;Filtros de objetos&quot; para seleccionar sólo los objetos que cumplan los siguientes criterios: <ol><li> Aplicar opción rangos (mínimo y máximo incluido) para los aspectos. Aspecto informa de la relación entre el eje mayor y el eje menor de la elipse equivalente al objeto. Aspect es siempre ≥1. Valores adecuados min = 1, max = 3. </li><li> Aplicar rangos de diámetro. Diámetro informa de la duración media de los diámetros medidos a intervalos de dos grados que une dos puntos de contorno y que pasa a través del centroide del objeto. Ajuste el rango de píxeles (o en micras, si se utiliza un sistema calibrado). </li><li> Defina el rango óptimo en preliminexperimentos ary: seleccionar manualmente los puntos de interés y luego medir su diámetro utilizando la función de perfil parcela. </li></ol></li><li> Seleccione &quot;objetos de visualización&quot;: los objetos seleccionados se presentarán superpuestas a la imagen TIRFM (Figura 4B). </li><li> Incluir en el análisis sólo aquellos puntos que muestran un corto (uno a tres marcos) aumento transitorio de la intensidad de fluorescencia, seguido inmediatamente por una marcada pérdida de señal (puntos transitorios). Emplear la selección circular para crear un retorno de la inversión de diámetro aproximadamente un punto radialmente alrededor de las vesículas seleccionados / spots (ROI experimental). Realice este paso manualmente. </li><li> Con las ROIs seleccionado, calcular la intensidad media de fluorescencia de cada ROI en el transcurso de la película. </li></ol></li><li> Análisis de los datos (Figura 3C-D) <ol><li> Exportar el curso de tiempo de los cambios de fluorescencia medidos en cada &quot;ROI experimental&quot; a una hoja de cálculo; (Figura 3DA). Normalizar el valor de intensidad en cada trama a la intensidad de fluorescencia inicial (F / F0), (Figura 3Db). </li><li> Aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada trama como se informó en el paso 3.2.4 (Figura 3Dc). </li><li> Para calcular el número total de eventos de fusión (número de pico), el tiempo se produce cada fusión (anchura de pico) y la amplitud de pico fluorescente (altura del pico y AUC) aplicar funciones lógicas utilizando los paquetes de hojas de cálculo o matemáticas. Un ejemplo de análisis de eventos de fusión usando fórmulas lógicas se informó en la Figura 3Dd y 3De. </li><li> Suponga que el aumento de la intensidad de fluorescencia que excede el umbral (intensidad media de fluorescencia de fondo ± 3SD) como la fusión de vesículas a la membrana plasmática y el pico resultante como un evento de fusión. </li><li> Calcular la anchura de pico como diferencia entre el último y el primer valor de x de cada pico. Multiplique este valor por 1 / (frecuencia de muestreo). Considere este valor uns el momento de la fusión de vesículas y la adhesión a la membrana plasmática antes vesícula re-acidificación y reciclaje (Figura 3Dd). </li><li> Calcular el AUC de células enteras como una suma de los valores por encima del umbral. Considere este valor como el cambio neto fluorescente durante el tiempo de grabación debido a la espontánea (en reposo) o evocada (estimulado) la actividad sináptica. </li><li> Calcular la altura del pico como la diferencia entre el valor máximo y de cada pico y el umbral. Considere este valor como indicativo del tipo de fusión (fusión única vs. simultánea / secuencial o transitoria vs. fusión completa). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle.">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li><li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+deep-layer+cortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+non+bioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).</li><li>Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurements+of+activity-dependent+membrane+recycling+in+motor+nerve+terminals+of+mammalian+skeletal+muscle.">Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle.</a> Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).</li><li>Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+transmission,+vesicle+dynamics,+and+transmitter+release+machinery+at+NCAM-deficient+neuromuscular+junctions.">Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions.</a> Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).</li><li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+with+FM+dyes.">Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity.">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Wyatt, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balice-Gordon+R.J.+Heterogeneity+in+Synaptic+Vesicle+Release+at+Neuromuscular+Synapses+of+Mice+Expressing+SynaptopHluorin.">Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin.</a> J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+&#34;kiss-and-run&#34;+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy.">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13, 563-567 (2003).</li><li>Miloso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid-Induced+Neuritogenesis+of+Human+Neuroblastoma+SH-SY5Y+Cells+Is+ERK+Independent+and+PKC+Dependent.">Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent.</a> J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+Membrane+Drift+Recruits+AMPA+Receptors+to+Dendritic+Spines.">Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines.</a> J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).</li><li>Treccani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+corticosterone+rapidly+increase+the+readily+releasable+pool+of+glutamate+vesicles+in+synaptic+terminals+of+prefrontal+and+frontal+cortex.">Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex.</a> Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).</li><li>D'Amico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+density+of+the+glutamate+transporter+EAAC1+is+controlled+by+interactions+with+PDZK1+and+AP2+adaptor+complexes.">The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes.</a> Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).</li><li>Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells.">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li><li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique.">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758 (2014).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated,+neutrophic+factor-dependent,+human+neuron-like+cells.">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este artículo presenta un protocolo para la imagen y analizar la dinámica de vesículas en las células secretoras, utilizando vectores cDNA codificada fluorescentes y TIRFM. Los elementos clave del éxito de formación de imágenes por TIRFM son la selección del modelo celular y transfección celular con indicadores ópticos genéticamente codificados de la liberación de vesículas y el reciclaje. TIRFM es ideal para las células de crecimiento adherente a una cubierta de vidrio planas ...

La transmisión sináptica química entre las neuronas es un mecanismo principal de la comunicación en el sistema nervioso. Se basa en la liberación de neurotransmisores a través de un ciclo dinámico de la fusión de vesículas y la recuperación en el sitio presináptica. Muchas de las proteínas implicadas en la dinámica de vesículas han sido identificados; Sin embargo, su contribución específica al fenómeno queda por aclarar 1. Nuestro entendimiento está parcialmente limitada por el hecho de que los ensayos más utilizados para exo / endocitosis no siempre son las más adecuadas. Varios estudios relacionados con la fusión de vesículas y la dinámica se basan en técnicas electrofisiológicas. Esta técnica proporciona una resolución temporal óptimo y es excelente para la investigación de la fusión inicial de vesículas a la membrana plasmática, pero es incapaz de detectar muchos de los eventos moleculares subyacentes que apoyan la función presináptica. La microscopía electrónica, en el otro lado, ofrece la mejor morphological descripción de cada paso singular, pero el aspecto dinámico del evento no puede ser capturado, ya que las muestras deben ser fijados con el fin de ser analizados. El advenimiento de nuevas técnicas de grabación óptica de 2,3, en combinación con los avances en el desarrollo de sondas moleculares fluorescentes 4-6, permite la visualización de los procesos de exocytic en células vivas, proporcionando así nuevos niveles de información sobre la estructura y la función sináptica. Los estudios iniciales explotadas tintes dependientes de la actividad de estirilo (FM1-43 y tintes orgánicos relacionados) 7,8. Estado-of-the-art técnicas de imagen emplean variantes sensibles al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) atado a proteínas vesículas luminales 9. Estas sondas están normalmente desconectados cuando está presente en las vesículas debido al bajo pH luminal. Después de la fusión con la membrana plasmática, el interior de vesículas se expone al espacio extracelular neutral, el pH<html> aumenta abruptamente, alivia la extinción de protones dependiente de pHluorin y la señal fluorescente aparece rápidamente. Como el cambio en pHluorin es más rápido que el evento de fusión, mediante el control de los incrementos de fluorescencia, la fusión de vesículas con la membrana se puede medir y analizar. Debido a que las moléculas de pHluorin-etiquetado de superficie se endocitosis, la señal de fluorescencia posteriormente vuelve al nivel basal, por lo tanto, la misma construcción puede utilizarse también para controlar la vesícula reciclaje 9. Mientras que el sensor de pH de vesículas etiquetado asegura la visualización solamente de las vesículas que realmente se fusionan con la membrana plasmática, se requiere formación de imágenes en alta resolución espacial y temporal para describir en detalle los pasos implicados en los procesos de endocitosis exo /. La técnica óptica que proporciona la resolución espacio-temporal es necesario microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM), una aplicación de la microscopía de fluorescencia 10. &quot;&gt; La reflexión interna total se produce en la interfase entre el cubre de vidrio y la muestra. Cuando la trayectoria de la luz alcanza el cubre de vidrio con un ángulo de incidencia mayor que el ángulo crítico, la luz de excitación no se transmite en la muestra, pero es completamente reflejada de nuevo. En estas condiciones, un evanescentes formas de onda de la luz en la interfase y se propaga en el medio con menos densidad óptica (la muestra). Como la intensidad del campo evanescente decae exponencialmente con la distancia desde la interfaz (con una profundidad de penetración de alrededor de 100 nm) sólo los fluoróforos en la proximidad más cercana a la hoja de la cubierta puede ser excitado mientras que aquellos más lejos de la frontera no lo son. En las células transfectadas con GFP-construcciones, esta profundidad corresponde a las proteínas expresadas en la membrana plasmática o en estructuras vesiculares acercarse a ella. Como fluoróforos en el interior de la célula no pueden ser excitados, la fluorescencia de fondo se reduce al mínimo, y una imagen con una señal de muy alta / fondo de rataio se forma 11. Varias características hacen TIRFM la técnica de elección para el seguimiento de la dinámica de las vesículas. El contraste perfecto y la relación señal a ruido más alta relación de permiten la detección de señales muy bajas derivadas de vesículas individuales. Adquisición de imágenes basado en un chip en cada cuadro proporciona la resolución temporal necesaria para detectar procesos altamente dinámicos. Por último, la mínima exposición de las células a la luz en cualquier otro plano de la muestra reduce fuertemente la fototoxicidad y permite la grabación de largo lapso de tiempo duradero 12. Análisis de los datos sigue siendo el aspecto más difícil y crucial de esta técnica. La manera más simple para monitorizar la fusión de vesículas es medir la acumulación de proteínas fluorescentes reportero en la superficie celular, con el tiempo 13. A medida que aumenta la fusión, neto aumenta señal de fluorescencia así. Sin embargo, este método puede subestimar el proceso, sobre todo en las células grandes y en condiciones de reposo,porque los procesos de endocitosis y fotoblanqueo compensar el aumento en la intensidad de fluorescencia debido a la exocitosis de vesículas. Un método alternativo es seguir cada evento de fusión única 14. Este último método es muy sensible y puede revelar detalles importantes sobre los mecanismos de fusión. Sin embargo, requiere la selección manual de los eventos individuales, porque los procedimientos completamente automatizados para seguir vesículas y registrar la fluctuación de sus señales fluorescentes no siempre están disponibles. Observación de la dinámica de vesículas requiere células de muestreo a alta frecuencia. Esto genera una gran cantidad de datos que difícilmente pueden ser analizados manualmente. La propuesta de este trabajo es optimizar la técnica de imagen TIRFM para el seguimiento de la basal y estimulado la liberación de neurotransmisores en la línea celular de neuroblastoma SH-5YSY, y describir, paso a paso, un procedimiento desarrollado en el laboratorio para analizar los datos, tanto en los niveles de células enteras y de una sola vesícula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Las vesículas sinápticas liberan neurotransmisores en las sinapsis químicas a través de un ciclo dinámico de la fusión y la recuperación. Supervisión de la actividad sináptica en tiempo real y la disección de los diferentes pasos de exo-endocitosis en el nivel de una sola vesícula son cruciales para la comprensión de las funciones sinápticas en salud y enfermedad. Genéticamente codificados sondas sensibles al pH directamente dirigidos a las vesículas sinápticas y Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) proporcionan la resolución espacio-temporal necesario seguir la dinámica de la vesícula. El campo evanescente generada por la reflexión interna total sólo puede excitar fluoróforos colocados en una capa delgada (&lt;150 nm) por encima de la cubierta de vidrio sobre el cual las células se adhieren, exactamente donde los procesos de exo-endocitosis tienen lugar. Las imágenes de alto contraste resultantes son ideales para vesículas de seguimiento y análisis cuantitativo de los eventos de fusión. En este protocolo, SH-SY5Y n humanaeuroblastoma células se proponen como un modelo valioso para el estudio de la liberación de neurotransmisores en el nivel de una sola vesícula por TIRFM, debido a su superficie plana y la presencia de vesículas dispersas. Los métodos para el cultivo de SH-SY5Y como células adherentes y para transfectar con synapto-pHluorin se proporcionan, así como la técnica para llevar a cabo TIRFM y de imagen. Por último, se presenta una estrategia con el objetivo de seleccionar, contar y analizar los eventos de fusión a nivel de células enteras y de una sola vesícula. Para validar el método de análisis de procedimiento de imágenes y datos, la dinámica de las vesículas de etiquetado pHluorin se analizan bajo reposo y estimuladas (despolarizar las concentraciones de potasio) condiciones. Despolarización de la membrana aumenta la frecuencia de eventos de fusión y causa un aumento paralelo de la señal de fluorescencia neta registrada en células enteras. Análisis de una sola vesícula revela modificaciones del comportamiento de fusión-evento (altura máxima y una mayor anchura). Estos datos sugieren ésimoen la despolarización de potasio no sólo induce una liberación masiva neurotransmisor sino también modifica el mecanismo de la fusión de vesículas y reciclaje. Con la sonda fluorescente apropiada, esta técnica se puede emplear en diferentes sistemas celulares para diseccionar los mecanismos de secreción constitutiva y estimulado.

Los procedimientos de imágenes TIRF y datos de análisis descritos están diseñados para estudiar la dinámica de vesículas en los sistemas celulares. Esta técnica se puede utilizar para determinar los efectos de las moléculas de señalización y las drogas en los eventos de fusión y la dinámica de vesículas de neurotransmisores 17. El uso de proteínas de la membrana plasmática GFP-etiquetados, el análisis TIRFM se ha empleado para caracterizar el tráfico constitutiva de los transportadores de glu...

Watch this Scientific Journal Video about TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis at JoVE.com

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K vistas.  Università degli Studi di Milano. This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

Video: TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Investigación

Neurociencias

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized cells use this process to execute vital body functions such as insulin secretion from &#946; cells and neurotransmitter release from chemical synapses. Owing to its physiological significance, exo-/endocytosis has been one of the most studied topics in cell biology. Many tools have been developed to study this process at the gene and protein level, because of which much is known about the protein machinery participating in this process. However, very few methods have been developed to measure membrane lipid turnover, which is the physical basis of exo-/endocytosis.
This paper introduces a class of new fluorescent lipid analogs exhibiting pH-dependent fluorescence and demonstrates their use to trace lipid recycling between the plasma membrane and the secretory vesicles. Aided by simple pH manipulations, those analogs also allow the quantification of lipid distribution across the surface and the intracellular membrane compartments, as well as the measurement of lipid turnover rate during exo-/endocytosis. These novel lipid reporters will be of great interest to various biological research fields such as cell biology and neuroscience.

This protocol presents a fluorescence imaging method that uses a class of pH-sensitive lipid fluorophores to monitor lipid membrane trafficking during cell exocytosis and the endocytosis cycle.

Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...