著者は、Elianaのディカイラーノ（ポスドクフェローシップ）とステファニアモレッティ（博士フェローシップ）への援助をUniversitàデッリ大学地区ミラノを承認したいと思います。この作品は、CPに大学の研究プログラムPURによってサポートされていました私たちは、技術支援のためにpHluorinための教授ジェレミーM.ヘンリー、生化学、ブリストル大学の大学院、イギリス、構築し、博士Dottiフランチ​​ェスコデータ分析をアシストするために、そしてシルビアMarsicanoに感謝したいと思います。

1.細胞培養およびトランスフェクション<ol><li> SH-SY5Y細胞培養 注：実験は、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y（ATCC＃CRL-2266）15を用いて行われてきた。 SH-SY5Y細胞は、浮遊クラスタおよび接着細胞の混合物として成長する。しっかりとTIRFMのために重要であるガラスカバーに付着して増殖する細胞を持っているプロトコル（細胞密度、分割比など ）で報告された指示に従ってください。 <ol><li>開始する前に、層流生物学的安全キャビネットの下で、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培養液の適切な容積を行う。 <ol><li> 、150mMのNaClの濃度でPBSを50mlを加える24 mMリン酸緩衝液（pH7.4）。溶液を濾過する。 </li><li>高グルコース、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン（100 U / ml）を、ストレプトマイシン（100μg/ ml）を、L-グルタミン（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で細胞培地50mlを加える2ミリモル）、及びピルビン酸ナトリウム（1mM）を。溶液を濾過する。 </li></ol></li><li>完全増殖培地を除去し、3mlのPBSで細胞を洗浄。 </li><li> 37℃で5分間（6センチメートルシャーレ用）0.05％トリプシンエチレンジアミン四酢酸2ml（EDTA）、5％CO 2で細胞をインキュベートし、ピペットを用いて細胞を取り外す。 </li><li> DMEM 2 mlを添加することによってトリプシンを不活性化し、5分間300×gでの遠心分離によって細胞を収集する。 </li><li>上清を除去し、ペレットに1mlのDMEMを追加し、ソリューションをピペット上下十分に単一細胞懸濁液に細胞を分散させるために。 </li><li>完全培地の3ミリリットルを含む新しい直径6cmシャーレに4：彼らに1を分割。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で、直径6cmのペトリ皿中で、培養中の細胞を維持する。週に一回継代培養あるいは80に覆われたとき - 表面積の90％。 </li></ol></li><li> イメージング用のSH-SY5Y細胞のメッキ <ol><li> TIRFM実験のために、プレートガラスカバーの上に細胞。ガラスは0.17±0.005ミリメートルの厚さと1.5255±0.00015屈折率でカバーして採用する。開始する前に、次のようにカバーガラスを準備します。 <ol><li>きれいなガラスを90％エタノール、O / Nで覆う。 </li><li>蒸留水（蒸留水を3回交換）でそれらを徹底的に洗浄します。乾燥したガラスは、乾燥オーブンで覆う。 </li><li>場所は、ガラスペトリ皿にカバーし、3時間、200℃で予熱したオーブン中で滅菌する。 </li></ol></li><li>トランスフェクションの前日に、3.5センチメートルペトリ皿に各カバースリップを置き、1mlの培地を追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートする。 </li><li> 1.1.5、完全培地1mlの細胞ペレットを中断し、カウント - ステップ1.1.3で説明したように細胞をトリプシン処理。ウェル/ 3×10 5個の細胞を得るために各ペトリ皿に追加し、細胞懸濁液の正確な体積を計算する。この密度は、最適な細胞成長および効率的なトランスフェクションのために必要とされる。 37℃でインキュベート5％CO 2インキュベータO / Nである。 </li></ol></li><li> ポリエチレンイミン（PEI）によるSH-SY5Ytransfection NOTE：シナプス小胞の動態を可視化するために、synapto-pHluorinを含むpCB6ベクターが使用されている。 synapto-pHluorinは、緑色蛍光タンパク質（GFP）16のpH感受性変異体のフレーム融合にすることによって生成された構築物2小胞膜タンパク質シナプトブレビンが広くニューロン9内のシナプス小胞の特性を調査するために採用されている。 <ol><li>トランスフェクションを開始する前に、次のソリューションの10ミリリットルを作る。 1月として最大のようなソリューションをしてください。 <ol><li> 150 mMのNaCl溶液を作る。 0.01 N HClでpH5.5に調整します。 </li><li> 150 mMのNaCl溶液中で、10％のポリエチレンイミン（25 kDaの直鎖PEI）でのPEI溶液を作る。溶液のpHは8.8に上昇する。 0.01 N HClで7.8にpHを調整する。 </li></ol></li><li>めっき24時間後、培地を除去し、1.5 mlのリフレッシュ完全培地。 5％CO 2インキュベーター中で、37℃で細胞を保管してください。 </li><li>層流バイオセーフティキャビネットの下で、1.5mlマイクロチューブに、150 mMのNaCl溶液を25μlと3.5センチメートルペトリ皿当たりPEI溶液100μlにプラスミドDNA3μgのを追加します。 </li><li>渦は、10秒間、次いで室温で30分間DNA / PEI混合物をインキュベートする。 </li><li>慎重に細胞をカバーガラスを含むペトリ皿にDNA / PEI混合物を追加し、穏やかに均等にペトリ皿に試薬を分配するために振る。 </li><li> 4時間後、培地を変更し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞のO / Nインキュベートする。トランスフェクション後48時間 - イメージング実験24を実行します。 </li></ol></li></ol>全反射蛍光顕微鏡2.細胞イメージング（TIRFM） <ol><li> イメージングセットアップ <ol><li> 図1で説明したセットアップでTIRFイメージングを実行します。それは、電動倒立と、顕微鏡（ 図1、挿入図A）、レーザー光源（ 図1、挿入図B）及びTIRFスライダ（ 図1、挿入図C）。高開口数（NA 1.45アルファプラン-Fluar）100X油、浸対物レンズを通してTIRFM照明リーチ。 </li><li> TIRFM照明用、マルチライン（458/488/514 nm）で100 mWのアルゴンイオンレーザーを採用している。モノモードファイバを使用して、TIRFスライダを介して、ビーム経路に直線偏光のレーザ光を導入する。反射光ビーム経路の発光視野絞り平面にTIRFスライダを挿入します。 <ol><li>広い視野照明の場合、従来の水銀ショートアークランプHBO白色光に顕微鏡を接続します。スライダーで偏波保持ダブルプリズムは、TIRF照明と白色光の同時組み合わせを保証します。 </li></ol></li><li>励起フィルター（バンド幅10分の488 nm）を有するレーザ光をフィルタリングするレーザー経路に導入されたフィルターホイールに取り付けられた。採用する高速、ソフトウェア制御、シャッターは、レーザー照射の高速制御を可能にする。 pHluorin分析のために、バンドは50分の525 nmの発光フィルターを通過マウント。画像PROPLUSソフトウェアと冷却高速CCDカメラ上のデジタル画像（512×512ピクセル）をキャプチャします。 </li></ol></li><li> TIRF照明を実現する（図2） <ol><li>レーザー、コンピュータ、カメラ、フィルターホイール、及びシャッタコントローラをオンにします。その後、レーザーはウォームアップして安定化する必要があるとして、実験を開始する前に、20分待ってください。 </li><li>イメージングの前に、次の解決策の適切なボリュームを作る。 <ol><li>にバッファリング125のNaCl、5mMのKClを、1.2mMの硫酸マグネシウム、1.2mMのKH 2 PO 4、25mMの4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）（少なくとも50mlのクレブス（KRH）溶液を作るpH7.4）に、2のCaCl 2、及び6mMのグルコース。 </li><li> 80のNaCl、50mMのKCl、1.2mMの硫酸マグネシウム、1.2mMのKH 2 PO 4でのKCl、KRH溶液10ml（pH7.4）で行う、25mMのHEPES（pH7.4に緩衝化）、2のCaCl 2、及び6mMのグルコース。 </li></ol></li><li>トランスフェクトした細胞とガラスカバーを取り外し、適切なイメージングチャンバーに挿入します。チャンバーを組み立て、ガラスの中央にKRH溶液500μlを追加。 </li><li>客観にわたってオイルを追加します。顕微鏡のステージ上イメージング室を配置し、カバーガラスの下に目標を置きます。サンプル上の安全カバーを置きます。 </li><li>落射蛍光モードでは、カバースリップ（上面）に着目し、チャンバーの中心に配置されたトランスフェクトされた細胞を選択する。その蛍光シグナルを明確に80ミリ秒以下の露光時間を使用して記録することができますセルを選択します。 </li><li>ソフトウェア制御の下では、 ライブモードで TIRF照明に切り替える。 </li><li> TIRF構成を設定するには、サンプルカバー（ 図2B）で、客観的な外に出てくるビームの位置を確認してください。ビームは、tの中央に配置されたとき彼対物レンズ（左図2A）は 、スポット（左、 図2B）TIRFサンプルカバーの中央に表示され、セルは落射蛍光モードで画像化されている（いくつかの焦点面、高いバックグラウンド蛍光; 図2C、左） 。 </li><li>臨界角に達するように、Y方向に集光スポットを移動させる（前方または後方; 図2B、中央 ）TIRFスライダ（ 図1C）に角度調整ねじを使用して。光が臨界角（ 図2A、右）よりも大きな角度で試料面に収束したとき、スポットが消失し、ストレート、細い、集束ラインは、サンプルカバー（右図2B）の中央には明らかである。 </li><li>を微調整するTIRF角が細胞試料（ 図2C）を使用します。ビデオで蛍光画像を見る、この段階では、エピ蛍光状の画像が表示されたままです。静かに、TIRF詐欺まで、ネジを移動ditionが達成され、細胞の唯一つの光学面が焦点（カバースリップと接触している、すなわち、原形質膜）であり、これは、高コントラスト（右図2C）と平坦な画像が得られる。 </li></ol></li><li> サンプル画像 <ol><li>シングルチャネルタイムラプス実験を設定します。光退色最小限に抑えるために、低露光時間と高利得を使用して画像を取り込む。 80ミリ秒 - 適切な露光時間が40との間である。 2 Hzのサンプリング周波数 - 1で画像を取得する。小胞の動態は、より高い周波数（10 Hz）の時より良く理解サンプリング場合があります。観測の定期的な時間は、通常2分である。 </li><li> TIRFMモードでKRHソリューションとレコード細胞の500μlのを追加します。これは静止状態である。時間の連続画像を保存します。 </li><li> （レーザパワー、時間暴露、フレーム番号）を安静の同じ条件下で同じ細胞とレコードに焦点を当てる。 5つのフレームの後、塩化カリウム、KRH溶液500μlを追加し、チャンバー内のKClを保つ。これが刺激された状態です。時間の連続画像を保存します。 </li></ol></li></ol> 3.画像解析とデータ処理注：画像を分析するために、マクロは、画像解析ソフトウェアの既存の機能に基づいて、研究室で開発されてきた。同じようなマクロは、オンライン（材料および装置の表に記載されているURL）が利用可能である。 <ol><li> 蛍光強度の定量化 <ol><li>映画の過程にわたって、画像の関心領域（ROI）における蛍光強度の定量化のための「シーケンス蛍光強度」マクロを使用する。 </li><li>時系列の画像を開きます。マクロメニューに移動し、 &#39;配列蛍光強度」を選択します。 「分析」ウィンドウで、「ROIを選択」が表示されます。 </li><li> ROIを作成するには、メニューで選択ツールのいずれかを選択します。スポット（背景ROI）なしで細胞膜の領域での3のROIを配置します。 THIを採用の&quot;背景ROI」光退色を評価し、融合事象の分析（ 図3A）のためのしきい値を設定する。 </li></ol></li><li> 退色補正、閾値判定（図3B） <ol><li>光退色を評価するために、蛍光強度の行「バックグラウンドのROI」、（ 図3Baの ） を開きます。初期強度値（F0）（F / F0）（ 図3Bbと ）、各フレーム内の蛍光強度値を正規化する。値を平均する。 </li><li>平均データを強調表示し、グラフのメニューオプションを使用して、ラインプロットを作成します。 </li><li>データ分析メニューから、プロット解析ダイアログを開き、「トレンドライン」を選択します。回帰のタイプを選択します。 「指数関数」回帰を設定します。次に、「チャート上の表示方程式」を選択します。グラフウィンドウでは、指数方程式は、 図3BC（、表示され、パラメータ値が自動的に割り当てられます</stronG&gt;）。 </li><li>以下のよう各フレームの強度値に指数関数補正を適用します。 FN（補正）のFn / EXP（-n * A）= のFn =フレームnにおいて測定された実験的な蛍光強度。 nはフレーム数、 =漂白係数（定数による退色に対する強度損失の速度を表現する。 &#160; 図3BD）。 </li><li>しきい値を設定するには、正規化された補正後の「バックグラウンドROI」を開いて、平均蛍光シグナルとその標準偏差（SD）を計算する。 3 SDプラス平均値が閾値（ 図3BE）を表している。データ分析のためにこのしきい値を使用してください。 </li></ol></li><li> 半自動手順を使用して、融合事象の選択 <ol><li>画像解析ソフトウェアとの時系列画像を開きます。アクティブな画像シーケンスにガウスフィルタを適用します。 </li><li>選択を可能にするツール「オブジェクトを数える」またはマクロを使用して画像を分析画素が定義された範囲内の平均蛍光強度を持つ物体。強度が閾値関数を（関心領域を強調するために、バーメニューにセット尺度→しきい値を行く）を使用して、手動でレンジを設定します。適切な閾値は、ローカル蛍光バックグラウンドシグナル上の30％である。 </li><li>マクロは、以下の基準を満たすオブジェクトのみを選択するための「オブジェクトのフィルタ」を適用します。 <ol><li>側面のための範囲はオプション（minとmax包括的な）を適用します。アスペクトは、長軸とオブジェクトと等価楕円の短軸の間の比率を報告します。アスペクトは常に≥1。適切な値は、分= 1、MAX = 3である。 </li><li>直径の範囲を適用します。 直径が2度の間隔が2の輪郭点を結ぶと、オブジェクトの重心を通過する時に測定された直径の平均長さをレポートします。ピクセル単位で範囲を設定します（または以下で、キャリブレーションシステムを使用している場合）。 </li><li> preliminに最適な範囲を定義する進の実験：手動で興味のあるスポットを選択し、プロットプロファイル機能を使用してそれらの直径を測定します。 </li></ol></li><li> 「表示オブジェクト」を選択します。選択したオブジェクトがTIRFMの画像（ 図4B）に重畳表示されます。 </li><li>分析ですぐに信号の著しい損失（過渡スポット）に続いて蛍光強度の（一から三フレーム）短い一過性の上昇を示してのみスポットを含めます。選択された小胞/スポット（実験のROI）の周りに放射状にROI約スポット径を作成するために円形の選択を使用する。手動でこの手順を実行します。 </li><li>のROIを選択した状態で、映画の過程で各ROIの平均蛍光強度を計算する。 </li></ol></li><li> データ分析（図3C-D） <ol><li>スプレッドシートへの各「実験的なROI」で測定された蛍​​光変化の時間経過をエクスポート。 （ 図3DA）。初期蛍光強度（F / F0）、（ 図3dBの ）各フレームにおける強度値を正規化する。 </li><li>ステップ3.2.4（ 図3DC）で報告されているように、各フレームにおける強度値に指数関数補正を適用します。 </li><li>融合イベントの合計数（ピーク数）を計算するために、それぞれの融合が生じる時間（ピーク幅）と蛍光ピーク（ピーク高さ及びAUC）の振幅は、スプレッドシートまたは数学パッケージを使用して、論理関数を適用する。論理式を用いて融合事象分析の例を図3DDと3DEに報告されている。 </li><li>融合事象として小胞の原形質膜に融合し、得られたピークとして（±3SD平均背景蛍光強度）が閾値を超える蛍光強度の増加を想定している。 </li><li>最後に、各ピークの最初のxの値との差であるピーク幅を計算する。 1 /（サンプリング周波数）のためにこの値を乗算する。この値aを考慮する小胞の再酸性化し、リサイクル（ 図3DD）の前に、原形質膜での小胞融合および接着の時間だ。 </li><li>しきい値以上の値の合計として全細胞AUCを計算します。自発（休息）への記録時間中にネット蛍光変化または誘発（誘導）シナプス活性として、この値を考慮してください。 </li><li>各ピークの最大y値と閾値との差としてのピーク高さを計算する。融合型（同時/逐次的融合対単一または一過対フル融合）を示すものとして、この値を考慮してください。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle.">The synaptic vesicle cycle.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).</li><li>Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+deep-layer+cortical+pyramidal+neurons.">In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Matz, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+from+non+bioluminescent+Anthozoa+species.">Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).</li><li>Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurements+of+activity-dependent+membrane+recycling+in+motor+nerve+terminals+of+mammalian+skeletal+muscle.">Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle.</a> Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).</li><li>Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+transmission,+vesicle+dynamics,+and+transmitter+release+machinery+at+NCAM-deficient+neuromuscular+junctions.">Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions.</a> Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).</li><li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+with+FM+dyes.">Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity.">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Wyatt, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balice-Gordon+R.J.+Heterogeneity+in+Synaptic+Vesicle+Release+at+Neuromuscular+Synapses+of+Mice+Expressing+SynaptopHluorin.">Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin.</a> J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+&#34;kiss-and-run&#34;+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy.">Multiple forms of &#34;kiss-and-run&#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13, 563-567 (2003).</li><li>Miloso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid-Induced+Neuritogenesis+of+Human+Neuroblastoma+SH-SY5Y+Cells+Is+ERK+Independent+and+PKC+Dependent.">Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent.</a> J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).</li><li>Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-dependent+Membrane+Drift+Recruits+AMPA+Receptors+to+Dendritic+Spines.">Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines.</a> J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).</li><li>Treccani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+corticosterone+rapidly+increase+the+readily+releasable+pool+of+glutamate+vesicles+in+synaptic+terminals+of+prefrontal+and+frontal+cortex.">Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex.</a> Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).</li><li>D'Amico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+density+of+the+glutamate+transporter+EAAC1+is+controlled+by+interactions+with+PDZK1+and+AP2+adaptor+complexes.">The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes.</a> Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).</li><li>Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells.">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li><li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique.">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758 (2014).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated,+neutrophic+factor-dependent,+human+neuron-like+cells.">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

本論文では、画像へのプロトコルを提示し、蛍光cDNAコードベクトルとTIRFMを使用して、分泌する細胞内小胞のダイナミクスを分析する。 TIRFMによる成功したイメージングの重要な要素は、小胞のリリースとリサイクルの遺伝的に符号化された光の指標と細胞モデルと細胞トランスフェクションの選択である。 TIRFMは、膜融合事象の安定した可視化を可能にするために、?...

ニューロン間の化学シナプス伝達は、神経系におけるコミュニケーションの主要なメカニズムである。それは、シナプス前サイトでの小胞融合と検索の動的なサイクルを通して神経伝達物質の放出に依存している。小胞動態に関与するタンパク質の多くが同定されている。しかし、現象への具体的な貢献は、1を明確にされていない。 我々の理解は、部分的に、エキソ/エンドサイトーシスのために最も広く使用されるアッセイは、常に最も適切ではないという事実によって制限される。小胞融合とダイナミクスに関連したいくつかの研究では、電気生理学的手法に依存している。この技術は、最適な時間分解能を提供し、原形質膜への小胞の初期の融合を調査するための優れているが、シナプス前機能をサポートする基礎となる分子事象の多くを検出できない。電子顕微鏡は、他の側に、最高級のmorphologicaを提供していますサンプルが分析されるために修正される必要があるため、Lの各特異ステップの説明が、イベントの動的な側面は、捕獲することができない。 新たな光記録技術の出現2,3は 、蛍光分子プローブの開発4-6の進歩と組み合わせて、このようにシナプスの構造と機能についての情報の新しいレベルを提供する、 生きた細胞内のエキソサイトーシスのプロセスの可視化を可能にします。 初期の研究に活用活動依存スチリル染料（FM1-43および関連有機染料）7,8。最先端のイメージング技術は、管腔小胞タンパク質9につなが緑色蛍光タンパク質（GFP）（pHluorin）のpH感受性変異体を使用する。これらのプローブは、通常は低いため管腔のpHをベシクル中に存在する場合にオフになります。原形質膜との融合の後、小胞の内部は中性細胞外空間のpHに曝露される<html>突然、増加pHluorinのプロトン依存消光を軽減し、蛍光シグナルが急速に表示されます。 pHluorinの変化は、蛍光の増加を監視することにより、融合事象よりも高速であるように、膜との小胞の融合を測定し、分析することができる。表面pHluorinタグ化分子はエンドサイトーシスされているので、蛍光シグナルは、その後、基礎レベルに戻るので、同一の構築物は、9のリサイクル小胞を監視するためにも使用することができる。 小胞 - タグ付きのpHセンサーはだけは本当に細胞膜と融合するもの胞の可視化を保証しながら、高い空間と時間分解能でのイメージングは​​細部にエキソ/エンドサイトーシスプロセスに関与する手順を記述するために必要とされる。必要な時空間分解能を提供する光学技術は、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）、蛍光顕微鏡10の適用である。 &quot;&gt;内部全反射は、光路が臨界角よりも大きな入射角でガラスカバースリップに達するとガラスカバースリップと試料との間の界面で発生する励起光を試料に伝達されないが完全界面におけるエバネッセント光の波形は、これらの条件下ではバックの反射が少ない光学濃度（サンプル）を含む培地中で伝播する。エバネッセント場の強度の侵入深さで（界面からの距離とともに指数関数的に減衰するようにさらに、境界から離れたものがGFP構築物でトランスフェクトした細胞ではなくなってから約100nm）をカバースリップに最も近接のみフルオロフォアを励起することができ、この深さは、原形質膜上に発現されるタンパク質、または小胞構造に対応細胞内部でフルオロフォアを励起することができないように、バックグラウンド蛍光が最小化される。それに接近し、非常に高いシグナル/バックグラウンドラットの画像ioが11が形成されている。 いくつかの特徴は、小胞の動態を監視するための選択肢のTIRFM技術を作る。完璧なコントラスト及び高い信号対雑音比は、単一の小胞に由来する非常に低い信号の検出を可能にする。各フレーム内のチップベースの画像取得が非常に動的なプロセスを検出するのに必要な時間分解能を提供する。最後に、サンプル内の他の面での光への細胞の最小限の露出が強く光毒性を軽減し、長期的なタイムラプス記録12を可能にします。 データ分析は、この技術の最も挑戦的で重要な側面のまま。小胞の融合をモニターするための最も簡単な方法は、時間13にわたって、細胞表面でのレポーター蛍光タンパク質の蓄積を測定することである。融合が増大すると、正味の蛍光シグナルも同様に増加する。しかし、この方法は、特に大細胞および休止状態で、プロセスを過小評価することが、エンドサイトーシスおよび光退色プロセスにより小胞のエキソサイトーシスに対する蛍光強度の増加を相殺するためである。別の方法は、各単一の融合事象14に従うことである。この後者の方法は非常に敏感であり、融合のメカニズムに関する重要な詳細を明らかにすることができます。完全に自動化された手順は、小胞を追跡し、それらの蛍光シグナルの変動を登録するために常に利用可能ではないので、それは、単一のイベントを手動で選択する必要がある。小胞の動態を観察したところ、高い周波数でサンプリングセルが必要です。これは、ほとんど手動で分析することができない大量のデータを生成する。 この論文の提案は両方、基礎を監視するためのTIRFMイメージング技術を最適化し、SH-5YSY神経芽細胞腫細胞株における神経伝達物質の放出を刺激し、そしてデータを分析するために、ステップバイステップで、実験室で開発された手順を記述することである全細胞および単一小胞レベルで。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

シナプス小胞が融合し、検索の動的なサイクルを通じて化学シナプスでの神経伝達物質を放出し。 リアルタイムでシナプス活性を監視し、単一小胞レベルでのエキソサイトーシスの異なるステップを解剖することは、健康および疾患におけるシナプスの機能を理解するために重要である。 遺伝的にコードpH感受性直接シナプス小胞をターゲットとプローブと全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）は小胞のダイナミクスに従うことが必要な時空間的分解能を提供。全反射によって生成されたエバネッセントフィールドは、エキソサイトーシスのプロセスが行われる正確な場所は、細胞が付着したガラスのカバーの上の薄層（&lt;150 nm）の中に入れ、フルオロフォアを励起することができる。得られる高コントラスト画像は、理想的には、追跡小胞融合事​​象の定量分析に適している。 このプロトコルでは、SH-SY5Yヒトnはeuroblastoma細胞は、それらの平らな表面と分散小胞の存在のため、TIRFMによって単一小胞レベルでの神経伝達物質の放出を研究するための貴重なモデルとして提案されている。接着細胞としてSH-SY5Yを成長させるためとsynapto-pHluorinでそれらをトランスフェクトするための方法はTIRFMおよびイメージングを実行するための技術と同様に、提供される。最後に、選択してカウントし、全細胞および単一小胞レベルでの融合事象を分析することを目的と戦略が提示されている。 撮像手順及びデータ分析アプローチを検証するために、pHluorinタグ付きの小胞のダイナミクスは、静止条件下で分析し、（カリウム濃度の脱分極）の条件を刺激する。膜の脱分極は、融合事象の頻度を増加させ、全体のセルに記録正味の蛍光シグナルの並列上昇を引き起こす。単一小胞の分析は、融合事象の挙動の改変（増加したピーク高さと幅）を明らかにする。これらのデータは、目を提案カリウム脱分極で大規模な神経伝達物質の放出を誘導するだけでなく、小胞融合やリサイクルの仕組みを変更するだけではなく。 適切な蛍光プローブで、この技術は、構成的分泌刺激のメカニズムを分析するために、異なるセルラーシステムで使用することができる。

記載されTIRFイメージングとデータ分析手順は、セルラーシステムにおける小胞のダイナミクスを研究するために設計されています。この技術は、融合事象と神経伝達物質小胞ダイナミクス17シグナル伝達分子と薬剤の効果を決定するために用いることができる。 GFPタグ付き原形質膜タンパク質を用いて、TIRFM分析はグリア細胞および上皮細胞18,19にGFPタグ付きグルタミン酸輸?...

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K ビュー.  Università degli Studi di Milano. This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.