저자는 엘리 아나 디 카이 라노 (박사후)과 스테파니 모레티 (박사 교제)에 지원 Università 글리 스투 디 밀라노을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 CP에 대학 연​​구 프로그램 PUR에 의해 지원되었다 pHluorin가 구성 박사 ​​Dotti 프란체스코 데이터 분석 지원 및 기술 지원에 대한 실비아 Marsicano에 대해 우리는 교수 제레미 M. 헨리, 생화학 학교, 브리스톨, 영국의 대학에 감사의 말씀을 전합니다.

1. 세포 배양 및 형질 <ol><li> SH-SY5Y 세포 배양 주 : 실험 SY5Y 인간 신경 아세포종 SH- (ATCC # CRL-2266) (15)를 사용하여 수행되었다. SH-SY5Y 세포는 부동 클러스터 및 부착 세포의 혼합물로서 성장한다. 단단히 TIRFM 위해 매우 중요 유리 커버에 부착 성장 세포를 가지고 프로토콜 (셀 밀도, 분할 비율, 등.)에보고 된 지시 사항을 따르십시오. <ol><li> 시작하기 전에, 층류 생물 안전성 캐비닛 하에서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 배양 배지의 부피를 좋은 기회. <ol><li> 150 mM의 NaCl을, 24 mM의 인산염 완충액, pH가 7.4의 농도로 PBS 50 ㎖를 확인합니다. 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 고 글루코스, 10 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎍ / ㎖), L- 글루타민 (가진 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 세포 배지 50 mL로 2 mM)을하고피루브산 나트륨 (1 mM)을. 솔루션을 필터링합니다. </li></ol></li><li> 완전한 성장 배지를 제거하고 PBS의 3 ㎖로 세포를 씻어. </li><li> 37 ° C에서 5 분 (6cm 페트리 접시)에 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 2 ㎖ (EDTA)와 세포를 품어 5 % CO 2를 피펫을 사용하여 세포를 분리. </li><li> 2 ml의 DMEM을 첨가함으로써 트립신을 비활성화하고, 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집한다. </li><li> 단일 세포 현탁액으로 세포를 분산시키는 것이 충분히 아래로, 상층 액을 제거 펠릿 DMEM 1 ㎖를 추가하고, 용액을 피펫. </li><li> 전체 매체의 3 ㎖를 포함하는 새로운 6cm 직경 페트리 접시에 4 : 그들에게 일을 분할합니다. 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서, 6cm 직경 배양 접시에서 배양 세포를 유지한다. 일주일에 한 번씩 서브 배양 또는 80 덮여 때 - 표면적의 90 %. </li></ol></li><li> 이미징을위한 SH-SY5Y 세포 도금 <ol><li> TIRFM 실험의 경우, 판커버 글래스 상 세포. 고용 유리는 0.17 ± 0.005 mm 두께 1.5255 ± 0.00015 굴절률 다룹니다. 시작하기 전에 다음과 같이 커버 글라스를 준비 : <ol><li> 유리 청소 90 % 에탄올, O / N로 다룹니다. </li><li> 증류수 (증류수 3 번)에 철저히 씻어. 드라이 유리 건조 오븐에서 다룬다. </li><li> 장소는 유리 페트리 접시에서 커버하고 3 시간 동안 200 ° C로 예열 된 오븐에서 소독. </li></ol></li><li> 일 형질 감염 전에, 3.5 cm 페트리 접시에 각 커버 슬립을 배치 배지 1 ㎖를 추가하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 1.1.5, 완전 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 중단하고 카운트 - 단계 1.1.3에 기재된 바와 같이 세포를 Trypsinize. 잘 / 3 × 10 5 세포를 산출하기 위해 각 페트리 접시에 추가 세포 현탁액의 올바른 볼륨을 계산합니다. 이 밀도는 세포의 최적 성장 및 효율적인 형질 전환에 필요한. 37 ° C에서 품어5 % CO 2 배양기 O / N에서. </li></ol></li><li> 폴리에틸렌 이민으로 SH-SY5Ytransfection (PEI) 참고 : 시냅스 소포 역학을 시각화하려면, synapto - pHluorin를 포함 pCB6 벡터가 사용되었습니다. synapto-pHluorin 녹색 형광 단백질 (GFP) (16)와 구조가 광범위하게 뉴런 (9) 내에서 시냅스 소포 특성을 조사하기 위해 사용 된 2 시냅 토브 기공을 막 단백질의 pH에 민감한 변형의 프레임 융합에 의해 생성되었습니다. <ol><li> 형질 전환을 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 10 ㎖를 확인합니다. 1개월으로 최대로 솔루션을 유지합니다. <ol><li> 150 mM의 NaCl 용액을 확인합니다. 0.01 N 염산으로 pH 5.5로 조정합니다. </li><li> 150 mM의 NaCl 용액에 10 % 폴리에틸렌 이민 (25 kDa의 선형 PEI)에서 PEI 솔루션을합니다. 용액의 pH는 8.8로 상승한다. 0.01 N HCl로 7.8 산도를 조정합니다. </li></ol></li><li> 도금 후 24 시간, 배지를 제거하고 1.5 ml의 새로완전 배지. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 유지. </li><li> 층류 생물 안전성 캐비닛에서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에, 150 mM의 NaCl 용액 25 μL 및 3.5 cm 페트리 접시 당 PEI 용액 100 ㎕로 플라스미드 DNA 3㎍을 추가. </li><li> 와동 10 초 후, RT에서 30 분 동안 DNA / PEI 혼합물을 배양한다. </li><li> 조심스럽게 세포와 커버 슬립을 함유하는 페트리 접시로 DNA / PEI 혼합물을 추가하고 부드럽게 동일 배양 접시에서 시약을 분배 흔들어. </li><li> 4 시간 후에 배지를 변경하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 O / N을 배양한다. 형질 전환 후 48 시간 - 이미징 실험 24을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 총 내부 반사 형광 현미경 2. 세포 이미징 (TIRFM) <ol><li> 영상 설정 <ol><li> 그림 1에 설명 된 셋업과 TIRF 이미징을 수행합니다. 그것은 거꾸로 모터 구성현미경 (도 1, 인셋), 레이저 소스 (도 1, 인셋 B) 및 TIRF-슬라이더 (도 1, 인셋 C). 높은 개구 수 (NA 1.45 - 알파 플랜 Fluar) 100X 오일, 침지 대물 통해 TIRFM 조명에 도달한다. </li><li> TIRFM 조명용, 멀티 라인 (458/488/514 ㎚) 100 mW의 아르곤 이온 레이저를 이용한다. 모노 모드 광섬유를 사용 TIRF 슬라이더를 통해, 빔 경로에 직선 편광의 레이저 광을 소개한다. 반사 된 빛의 빔 경로의 발광 필드 격막면에 TIRF 슬라이더를 삽입합니다. <ol><li> 넓은 필드 조명의 경우, 기존의 수은 쇼트 아크 램프 HBO 흰색 빛에 현미경을 연결합니다. 슬라이더의 편파 유지 이중 프리즘 TIRF 조명과 백색광의 동시 결합을 보장한다. </li></ol></li><li> 여기 필터 (밴드 폭 10분의 488 ㎚)와 레이저 광 필터 레이저 경로에 도입 필터 휠에 탑재. 고용고속, 소프트웨어 제어, 셔터는 레이저 조명의 빠른 제어를 가능하게합니다. pHluorin 분석을 위해, 밴드 50분의 525 nm의 방출 필터를 통과 마운트합니다. 이미지 PROPLUS 소프트웨어 냉각 고속 CCD 카메라에 디지털 이미지 (512 X 512 픽셀)를 캡처합니다. </li></ol></li><li> TIRF 조명을 달성 (그림 2) <ol><li> 레이저, 컴퓨터, 카메라, 필터 휠, 셔터 컨트롤러를 켭니다; 다음, 레이저는 따뜻하게하고 안정을 필요로하는 실험을 시작하기 전에 20 분을 기다립니다. </li><li> 촬영하기 전에 다음과 같은 솔루션의 좋은 기회 볼륨을 확인합니다. <ol><li> 1.2 mM의 KH 2 PO 4, 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산 (HEPES) (완충액을 125 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1.2 mM의 MgSO4로에서 크렙스 (KRH) 용액 50 mL로 하여 pH 7.4), 2 mM의 CaCl2를, 6 mM의 포도당. </li><li> 80 mM의 염화나트륨, 50 mM의 KCl을, 1.2 mM의 황산, 1.2 mM의 KH 2 PO 4에서의 KCl-KRH 솔루션 (PH 7.4) 10 mL로25 mM의 HEPES는, 2 mM의 CaCl2를, 6 mM의 포도당 (7.4의 pH로 완충). </li></ol></li><li> 형질 세포와 유리 커버를 제거하고 적절한 영상 실에 삽입합니다. 챔버를 조립하고 유리의 중앙에 KRH 용액 500 μL를 추가한다. </li><li> 목표를 통해 오일을 추가합니다. 현미경의 무대에 영상 실을 놓고 유리 커버 슬립 아래의 목적을 놓습니다. 샘플을 통해 안전 커버를 배치합니다. </li><li> 표면 형광 모드에서, 커버 슬립 (상면)에 초점을 실 중앙에 배치 형질 감염된 세포를 선택합니다. 그의 형광 신호 분명히 80 밀리 초 미만의 노출 시간을 사용하여 기록 될 수있는 셀을 선택. </li><li> 소프트웨어 제어, 라이브 모드에서 TIRF 조명으로 전환합니다. </li><li> TIRF 구성을 설정하려면, 샘플 커버 (그림 2B)에, 목적에서 나오는 빔의 위치를 확인합니다. t는 빔의 중심에 위치 할 때그 대물 렌즈 (좌측도 2a)은, 스폿 (왼쪽,도 2B) TIRF 샘플 커버의 중앙에 표시되고 셀 표면 형광 모드에 이미징된다 (몇몇 포커스 평면, 높은 배경 형광도 2C, 왼쪽) . </li><li> 임계각에 도달하기 위해, Y 방향으로 집광 스폿을 이동 (전방 또는 후방도 2B, 중앙) TIRF 슬라이더 (도 1C)에 각도 조절 나사를 이용. 빔 (우측도 2a) 임계각보다 큰 각도로 시료면에 집광함으로써, 스폿은 사라지고 직선, 얇은 초점 선 (우측도 2B) 샘플 덮개의 중앙에 분명하다. </li><li> 미세 조정하려면 TIRF 각도는 세포 샘플 (그림 2C)를 사용합니다. 이 단계에서, 표면 형광 같은 이미지가 여전히 표시, 비디오의 형광 이미지를보세요. 부드럽게, TIRF 콘 때까지 나사를 이동dition 달성된다 : 셀의 단지 하나의 광학면은 포커스 (즉, 커버 슬립에 접하는 플라즈마 막),이 (오른쪽,도 2C) 콘트라스트가 높은 평면 화상 결과이다. </li></ol></li><li> 샘플 영상 <ol><li> 단일 채널 시간 경과 실험을 설정합니다. photobleaching에 최소화하기 위해, 낮은 노출 시간 및 높은 이득을 이용하여 이미지를 캡처. 80 밀리 초 - 적절한 노출 시간은 40 사이입니다. 2 Hz의 샘플링 주파수 - 1에서 이미지를 획득. 소포 반응 속도는 더 높은 주파수 (10 Hz에서)에서 더 극명하게 샘플링 할 수있다. 관찰 일정한 시간은 통상 2 분이다. </li><li> TIRFM 모드에서 KRH 솔루션 및 기록 세포의 500 μl를 추가합니다. 이 휴식 상태이다. 시간 순차 이미지를 저장합니다. </li><li> 휴식의 동일한 조건 (레이저 파워, 노출 시간, 프레임 번호)에서 동일한 셀 기록에 초점을 맞 춥니 다. 다섯 프레임 후, KCl을-KRH 솔루션의 500 μl를 추가하고 챔버에서의 KCl을 유지합니다.이것은 자극 된 상태이고; 시간 순차 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 분석 및 데이터 처리 주 : 이미지를 분석하기가 매크로 이미지 분석 소프트웨어 기존의 기능에 기초하여, 실험실에서 개발되었다; 비슷한 매크로 온라인 (재료 및 장비의 표에서 제공하는 URL)를 사용할 수 있습니다. <ol><li> 형광 강도 정량화 <ol><li> 동영상의 과정을 통해, 이미지 관심 영역 (ROI)의 영역에서 형광 강도 정량화 &quot;시퀀스 형광 강도&quot;매크로를 사용. </li><li> 시간 순차 이미지를 엽니 다. 매크로 메뉴로 가서 &#39;시퀀스 형광 강도&#39;를 선택합니다. &#39;분석&#39;창에서 &quot;투자 수익 (ROI)을 선택합니다&quot;가 나타납니다. </li><li> 투자 수익 (ROI)을 생성하기 위해 메뉴에서 선택 도구 중 하나를 선택합니다. 관광 명​​소 (배경 ROI)없이 세포막의 지역에서 3 ROI를 배치합니다. 생을 고용S &quot;배경 ROI&quot;광표백을 평가하고 융합 이벤트 분석 (도 3A)에 대한 임계 값을 설정. </li></ol></li><li> 광표백 수정 및 임계 값 결정 (그림 3B) <ol><li> 광표백을 평가하기 위해 형광 강도 행 &quot;배경 ROI를&quot;, (그림도 3B)을 엽니 다. 초기 강도 값 (F0) (F / F0) (도 3BB) 각 프레임에서 형광 강도 값을 정규화한다. 값을 평균. </li><li> 평균 데이터를 선택하고 차트 메뉴 옵션을 사용하여 선 그림을 만듭니다. </li><li> 데이터 분석 메뉴에서 플롯 분석 대화 상자를 엽니 다 &quot;추세선&quot;를 선택합니다. 회귀의 유형을 선택합니다. 설정 &quot;지수&quot;회귀. 그런 다음 &quot;차트에 표시 방정식&quot;을 선택합니다. 그래프 창에서, 지수 방정식이 나타나고 매개 변수 값이 자동으로 (그림 3BC 할당 </strong&gt;). </li><li> 다음과 같이 각각의 프레임의 휘도 값으로 보정 지수 적용 : FN은 (수정) FN / 애 썼는데 = (α *) FN = 프레임 N에서 측정 실험 형광 강도; N = 프레임 수; photobleaching에 의한 강도로 손실율을 발현 = 표백 계수 (정수; &#160; 그림 3BD). </li><li> 임계 값을 설정하려면, 정규화 및 수정 &quot;배경 투자 수익 (ROI)을&quot;열기 평균 형광 신호 및 표준 편차 (SD)를 계산한다. 3 SD 플러스 평균값은 임계 값 (도 3Be)을 나타낸다. 데이터 분석이 임계 값을 사용합니다. </li></ol></li><li> 반자동 절차를 이용하여 융합 이벤트의 선택 <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어와 시계열 화상을 연다. 활성 이미지 시퀀스에 가우시안 필터를 적용합니다. </li><li> 을 선택할 수 있습니다 도구 &quot;개체를 계산&quot;또는 매크로를 사용하여 이미지를 분석픽셀들이 정의 된 범위 내에서의 평균 형광 강도를 가지고 개체. 수동 임계 함수를 사용 범위 설정 강도 (바 메뉴로 이동을, 계수 설정 → 임계치는 관심 영역을 강조하기 위해). 적절한 임계 값은 로컬 형광 배경 시그널이 30 % 이상이다. </li><li> 매크로는 다음과 같은 기준을 충족 객체 만 선택 &quot;개체를 필터&quot;적용 : <ol><li> 측면에 대한 범위 옵션 (최소 및 최대 포함)를 적용합니다. 양태는 장축과 객체 타원 상당의 보조 축 간의 비율을보고한다. 화면은 항상 ≥1. 적절한 값은 분 = 1, 최대 = 3이다. </li><li> 직경에 대한 범위를 적용합니다. 두 직경도 구간 두 윤곽 점 접합과 물체의 중심을 통과하는 직경 측정의 평균 길이를보고한다. 픽셀 범위를 설정 (또는 μm의에서, 보정 시스템을 사용하는 경우). </li><li> prelimin에서 최적의 범위를 정의진 실험 수동 관심 지점을 선택하고 플롯 프로파일 함수를 사용하여 직경을 측정한다. </li></ol></li><li> &quot;표시 객체&quot;를 선택 : 선택된 개체가 TIRFM 이미지 (그림 4B)에 중첩되어 나타납니다. </li><li> 분석 만 짧은 (1-3 프레임) 표시 스폿 즉시 신호 (과도 스폿)의 현저한 손실이어서 형광 강도 일시적인 증가를 포함한다. 선택한 소포 ​​/ 스팟 (실험의 ROI) 주위에 약 한 스폿 직경 반경 투자 수익 (ROI)을 생성하기 위해 원형 선택을 사용한다. 수동으로이 단계를 수행합니다. </li><li> ROI 영역을 선택하면, 영화에 걸쳐 각 ROI의 평균 형광 강도를 계산한다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 (도 3C-D) <ol><li> 스프레드 시트에 각 &quot;실험적인 투자 수익 (ROI)&quot;에서 측정 된 형광 변화의 시간 코스를 보냅니다; (그림 3DA). 초기 형광 강도 (F / F0) (도에서 3dB)에 대한 각 프레임의 강도 값을 정규화한다. </li><li> 단계 3.2.4 (도 3DC)에보고 된 각 프레임의 강도 값의 지수에 보정을 적용한다. </li><li> 융합 이벤트들의 총 수 (피크 수), 각각의 융합이 발생 시간 (피크 폭)와 형광 피크 (피크 높이 및 AUC)의 진폭을 계산하기 위해 스프레드 시트 또는 수학 패키지를 사용하여 논리 함수를 적용한다. 논리식을 사용하여 융합 이벤트 분석의 일례가도 3Dd 및 3DE에보고된다. </li><li> 원형질막 소포 융합과 같은 임계 값 (평균 ± 3SD 배경 형광 강도)를 초과 형광 강도의 증가와 융합 이벤트로 인한 피크를 가정한다. </li><li> 마지막으로 각 피크의 제 x 값의 차이로서 피크 폭을 계산한다. 1 / (샘플링 주파수)이 값을 곱합니다. 이 값을 고려소포 다시 산성화 및 재활용 (도 3Dd) 전에 세포막에서 소포 융합 및 부착 시간이야. </li><li> 임계 값 이상의 값의 합으로 전체 세포 AUC를 계산합니다. 때문에 자연 (휴식)에 녹화 시간 동안 순 형광 변화 또는 유발 (자극) 시냅스 활동이 값을 고려하십시오. </li><li> 각 피크 및 임계치 Y의 최대 값 사이의 차이로서 피크 높이를 계산한다. 융합 형 (대 단일 동시 / 순차 융합 또는 과도 대 전체 퓨전)의이 값으로 나타내는 것이 좋습니다. </li></ol></li></ol>

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S., Ballabio, M., Magnaghi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosteroid+allopregnanolone+regulates+EAAC1-mediated+glutamate+uptake+and+triggers+actin+changes+in+Schwann+cells.">Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells.</a> J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).</li><li>Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic-like+microvesicles+exocytosis+of+B-cells+using+a+live+imaging+technique.">Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique.</a> PlosOne. 9, e87758 (2014).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+treatment+of+SH-Sy5Y+cells+with+retinoic+acid+and+brain-derived+neurotrophic+factor+gives+rise+to+fully+differentiated,+neutrophic+factor-dependent,+human+neuron-like+cells.">Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells.</a> J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).</li><li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype.">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li><li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching.">Photobleaching.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 690-699 (2006).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 논문은 이미지에 프로토콜을 제시하고, 형광 cDNA를 인코딩 벡터와 TIRFM를 사용하여, 분비 세포에서 소포 역학을 분석 할 수 있습니다. TIRFM에 의해 성공적으로 영상의 핵심 요소 소포 자료 및 재활용의 유전자 인코딩 광학 지표와 셀룰러 모델과 세포 형질의 선택입니다. TIRFM는 이상적으로 유리 커버에 부착 성장과 세포막과 융합 이벤트의 안정적인 시각화를 허용하기에 충...

신경 세포 사이의 화학 시냅스 전달은 신경 시스템의 통신의 주요 메커니즘이다. 이 시냅스 사이트에서 소포 융합 및 검색의 동적 사이클을 통해 신경 전달 물질의 방출에 의존한다. 소포 역학에 관여하는 단백질의 대부분은 확인되었다; 그러나, 현상에 특정 공헌 1 명확히 남아있다. 이해 부분적 엑소 / 엔도 사이토 시스에 가장 널리 사용되는 분석은 항상 가장 적합하지 않은 사실에 의해 제한된다. 여러 소포 융합 관련 연구와 역학 전기 생리 기술에 의존하고있다. 이 기술은 최적의 시간 해상도를 제공하며 세포막에 소포 초기 융합을 조사하는 우수하지만 연접 기능을 지원하는 기본 분자 많은 이벤트를 감지 할 수있다. 전자 현미경은, 다른 측면에서, 최고의 morphologica을 제공합니다시료를 분석하기 위해 고정되어야하기 때문에 각 스텝 단수이지만 이벤트의 동적 양태의 설명은 L, 포착 할 수 없다. 형광 분자 프로브 개발 4-6의 발전과 함께 새로운 광 기록 기술 2,3의 출현, 따라서 시냅스 구조 및 기능에 대한 정보를 제공하는 새로운 수준, 생균의 exocytic 프로세스 시각화 할 수있다. 초기 연구 악용 활동에 의존 스티 릴 염료 (FM1 - 43 및 관련 유기 염료) 7,8. 최첨단 영상 기술은 내강 소포 단백질 9 닿는 녹색 형광 단백질 (GFP) (pHluorin)의 pH 민감성 변종을 사용합니다. 이 프로브는 일반적으로 낮기 때문에 내강의 pH의 소포에 존재하는 경우 꺼져 있습니다. 세포막과 융합 후, 소포 내부는 중성 세포 외 공간에 노출된다 산도<html> 갑자기, 증가 pHluorin의 양성자에 의존 담금질을 완화하고, 형광 신호가 빠르게 나타납니다. pHluorin 변화 형광 증가를 모니터링함으로써, 융합 이벤트보다 빠르기 때문, 막과 소포 융합 측정하고 분석 할 수있다. 표면 pHluorin 태깅 분자 endocytosed되므로 형광 신호는 이후, 따라서 동일한 구조가 소포 9 재활용을 모니터링하도록 또한 사용될 수있다, 기저 레벨로 되돌아 간다. 베지 태그 pH의 센서 만 실제로 세포막과 융합 그 소포 시각화을 보장하면서, 높은 시공간 해상도 이미징은 상세 엑소 / 이입 과정에 관련된 단계를 설명하는 데 필요하다. 필요한 시공간 해상도를 제공하는 광학 기술은 전반사 형광 현미경 (TIRFM), 형광 현미경 (10)의 애플리케이션이다. &quot;&gt; 내부 전반사가 광 통로가 임계각보다 큰 입사각으로 유리 커버 슬립에 도달 유리 커버 슬립 샘플. 사이의 계면에서 발생 된 여기 광은 샘플에 송신되지만되지 않는다 완전히 다시 반영. 이러한 조건, 계면에서의 에바 네 센트 광 웨이브 형태 및 아래 산장의 강도의 침투 깊이 (계면으로부터의 거리와 함께 지수 함수 적으로 감소있다. 이하의 광학 밀도 (샘플)과 매질에서 전파 멀리 경계로부터 사람들은 GFP-제물로 형질 세포에서.없는 동안 약 100㎚) 커버 슬립에 가장 가까운 근방에만 형광체가 여기 될 수 있으며, 이러한 깊이는 세포막에 발현 된 단백질 또는 소포 성 구조에 대응 셀 내부에 형광 물질이 여기 될 수 없기 때문에, 배경 형광을 최소화하고, 화상이 매우 높은 신호 / 배경 쥐된다. 그것에 접근IO (11)을 형성한다. 몇 가지 특성은 소포 역학 모니터링을위한 선택의 TIRFM 기술을합니다. 완벽한 콘트라스트 및 높은 신호 대 잡음비는 단일 소체로부터 도출 매우 낮은 신호들의 검출을 허용한다. 각 프레임에 칩 기반 이미지 획득은 매우 동적 인 프로세스를 검출 할 필요 시간 해상도를 제공한다. 마지막으로, 샘플의 다른면에서 빛 세포의 최소한의 노출은 강하게 광독성을 줄이고 오래 지속 시간 경과 기록 (12)을 수 있습니다. 데이터 분석이 기술의 가장 도전적이고 중요한 측면 남아있다. 소포 융합을 모니터링하는 간단한 방법은 13 시간 동안, 세포 표면에 형광 리포터 단백질의 축적을 측정하는 것이다. 물론 융합 증가 순 형광 신호가 증가함에. 그러나,이 방법은 특히 큰 셀에서 및 휴식 조건에서, 공정을 과소 수도엔도 시토 시스와 광표백 프로세스 인해 엑소 사이토 시스 소포로 형광 강도의 증가를 상쇄하기 때문이다. 다른 방법은 각각의 단일 융합 이벤트 (14)을 따르는 것입니다. 이 후자의 방법은 매우 민감하고 융합 메커니즘에 대한 중요한 세부 사항을 공개 할 수 있습니다. 완전히 자동화 된 절차는 소포를 따라 자신의 형광 신호의 변동을 등록 항상 사용할 수 없기 때문에 그러나, 하나의 이벤트의 수동 선택이 필요합니다. 소포 역학 관측은 높은 주파수에서 샘플링 세포가 필요합니다. 이것은 거의 직접 분석 할 수없는 대량의 데이터를 생성한다. 이 논문의 제안은 모두, 실험실에서 개발 된 절차는 데이터를 분석하기 위해 SH-5YSY 신경 아세포종 세포주에서 기저 및 자극을 신경 전달 물질 방출을 모니터링 TIRFM 영상 법을 최적화하고 설명하는 단계별이고 전체 셀 및 단일 소포 수준.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

시냅스 소포가 융합 및 검색의 동적 사이클을 화학적 시냅스에서 신경 전달 물질을 방출. 실시간 시냅스 활성을 모니터링하고 단일 소포 수준에서 엑소 엔도 시토 시스의 여러 단계를 해부하면 건강과 질환에서 시냅스 기능을 이해하는데 중요하다. 직접 시냅스 소포 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 대상으로 pH 민감성 프로브 소포 역학을 수행하는 데 필요한 공간 - 시간 해상도를 제공을 유전자 인코딩. 내부 전반사에 의해 생성 산장은 엑소 엔도 시토 시스의 과정이 일어나는 정확한 위치, 세포가 접착 된 커버 유리 위에 박층 (&lt;150 ㎚)에 배치 된 형광체를 여기 할 수있다. 얻어진 높은 콘트라스트 이미지는 이상적으로 추적 소포 융합 이벤트의 정량 분석​​에 적합하다. 이 프로토콜에서는, SH-SY5Y 인간의 Neuroblastoma 세포 때문에 평평한 표면, TIRFM에 의해 단일 ​​소포 수준에서 신경 전달 물질 방출을 연구하기위한 귀중한 모델과 분산 된 소포의 존재로 제안된다. 부착 세포로 SH-SY5Y 성장과 synapto-pHluorin로 형질 감염에 대한 방법은 TIRFM 및 이미징을 수행 할 수있는 기술뿐만 아니라, 제공됩니다. 마지막으로, 개수를 선택하고, 전체 셀 및 단일 소포 수준에서 융합 이벤트를 분석하는 것을 목표로 전략을 제시한다. 이미지를 만드는 절차 및 데이터 분석 방법의 유효성을 검사하기 위해, pHluorin 태그가 소포의 역학은 휴식에서 분석하고 조건 (칼륨 농도 탈분극) 자극. 막 탈분극 융합 이벤트의 빈도를 증가시키고, 전체 셀 내에 기록 순 형광 신호의 병렬 인상을 야기한다. 단일 소포 분석 융합 이벤트 동작 (증가 피크의 높이와 폭)의 수정을 보여준다. 이 자료는 제 제안칼륨 탈분극에 엄청난 신경 전달 물질 방출을 유도뿐만 아니라 소포 융합 및 재활용의 메커니즘을 수정 아닙니다. 적절한 형광 프로브,이 기술은 항시 분비 자극 메커니즘을 해부 다른 셀룰러 시스템들에서 사용될 수있다.

설명 TIRF 이미징 및 데이터 분석 절차는 셀룰러 시스템에서 소포 역학을 연구하기 위해 설계되었습니다. 이 기술은 융합 이벤트 및 신경 전달 물질 소포 (17) 상에 분자 역학 및 약물 시그널링의 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. GFP 표지 된 세포막 단백질 사용 TIRFM 분석 교세포에서 GFP 표지 된 글루타메이트 수송 상피 세포 (18,19)의 구성 적 특징을 거래하기 위해 사용되어왔다....

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K 조회수.  Università degli Studi di Milano. This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

비디오: TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

연구

신경과학

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized cells use this process to execute vital body functions such as insulin secretion from &#946; cells and neurotransmitter release from chemical synapses. Owing to its physiological significance, exo-/endocytosis has been one of the most studied topics in cell biology. Many tools have been developed to study this process at the gene and protein level, because of which much is known about the protein machinery participating in this process. However, very few methods have been developed to measure membrane lipid turnover, which is the physical basis of exo-/endocytosis.
This paper introduces a class of new fluorescent lipid analogs exhibiting pH-dependent fluorescence and demonstrates their use to trace lipid recycling between the plasma membrane and the secretory vesicles. Aided by simple pH manipulations, those analogs also allow the quantification of lipid distribution across the surface and the intracellular membrane compartments, as well as the measurement of lipid turnover rate during exo-/endocytosis. These novel lipid reporters will be of great interest to various biological research fields such as cell biology and neuroscience.

This protocol presents a fluorescence imaging method that uses a class of pH-sensitive lipid fluorophores to monitor lipid membrane trafficking during cell exocytosis and the endocytosis cycle.

pH에 민감한 형광 지질 아날로그 ND6를 사용한 막 지질 회전율 측정

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

액틴 다이내믹스, 클러치 커플링, 성장 콘 발전을 위한 견인력 분석

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...