We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. Preparación de la solución <ol><li> Preparar 5 ml de búfer SUV &#39;que contiene 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) o TRIS (pH 7,5), y la trehalosa 2 mM. Filtrar el tampón con un filtro de jeringa de 0,2 micras y se dividen en alícuotas de 1 ml que se pueden almacenar a -20 ° C. NOTA: Los detalles adicionales de los reactivos e instrumentos se dan en la lista de materiales. </li><li> Preparar 40 ml de &#39;Crecimiento Buffer&#39; GUV que llenará el GUV interior durante la rehidratación película. Para un crecimiento &#39;baja en sal &quot;, se combinan 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) o 1 mM TRIS (pH 7,5), y sacarosa ~ 400 mM. Para un crecimiento &#39;salina fisiológica&#39;, combinar mM KCl 100, 5 mM HEPES (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), y ~ 200 mM de sacarosa. </li><li> Preparar 40 ml de &#39;Observación Buffer&#39; para la solución externa en la cámara experimental mediante la combinación de KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), y ~ 200 mM de glucosa. NOTA: Estos amortiguadores son sólo examples. Véase la discusión para adaptar los tampones para otros experimentos. </li><li> Mida las osmolaridades de los buffers de crecimiento y de observación con un osmómetro. Añadir gránulos de sacarosa o glucosa para que coincida con ellos dentro del 1% de manera que GUVs no lisar o contraer cuando se transfieren desde la cámara de crecimiento a la cámara de observación. NOTA: En este rango de concentración, la adición de 1 mM de sacarosa (13,7 mg por cada 40 ml) o glucosa (7,2 mg por 40 ml) aumenta la osmolaridad por ~ 1 mOsm. </li><li> Filtrar los buffers de crecimiento y observación con un filtro de 0,2 micras y almacenar a 4 ° C para inhibir el crecimiento bacteriano. </li><li> Disolver 50 mg de beta-caseína en 10 ml de TRIS 20 mM (pH 7,5) tampón para formar una solución de beta-caseína 5 mg / ml necesaria para pasivar las superficies de cámaras experimentales de modo que GUVs no se adhieren, se propagan y se rompen. Una vez que la beta-caseína se disuelve por completo (hasta varias horas a 4 ° C), el filtro (0.2 m) en alícuotas de 0,5 ml que se puede flash congelado y almacenadoa -20 ° C para su uso posterior (alícuotas descongeladas almacenados a 4 ° C por lo general se puede utilizar durante un máximo de un 1 semana). </li></ol> 2. Preparación SUV <ol><li> Prepare y congele alícuotas de Proteo-SUV siguiendo el protocolo detallado publicado previamente 28. Use KvAP marcada con fluorescencia con Alexa-488 maleimida, reconstituida en DPhPC SUVs (10 mg / ml) a una proteína a la relación de lípido de 1:10 (en masa). NOTA: De tipo salvaje KvAP contiene una cisteína por monómero situado cerca del extremo C-terminal intracelular (aminoácido 247). </li><li> Fluorescentes, en lípidos sólo SUV: NOTA: Maneje cloroformo bajo una campana de humos con guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Evite el uso de cualquier plástico como cloroformo puede disolverlos. Soluciones de cloroformo se pueden almacenar en viales de vidrio ámbar con tapas de teflón y se transfieren utilizando jeringas de vidrio. Tener cuidado para enjuagar todo el material de vidrio al menos 5 a 10 veces con cloroformo antes y después de pipetear los lípidos. <ol><li> Preparar 100 l de10 SUVs mg / ml DPhPC que contienen 0,5% en moles del lípido fluorescente de color rojo, rojo de Texas-DHPE, mediante la mezcla de 100 l de solución de DPhPC (10 mg / ml en cloroformo) con 8,2 l de solución de Rojo Texas-DHPE (1 mg / ml en metanol) en un vial de vidrio de 1,5 ml de color ámbar. </li><li> Secar los lípidos hacia abajo bajo una corriente de nitrógeno en una campana química mientras gira el vial. Cuando la película parece estar seca, coloque los lípidos en condiciones de vacío durante 3 horas para eliminar cualquier disolvente residual. </li><li> Añadir 100 l de tampón SUV a los lípidos, y agitar vigorosamente hasta que no lipídico queda pegado a las paredes del vial y la solución es uniformemente lechoso. </li><li> Sonicar la solución de lípidos para formar SUVs. Ajuste la posición del vial hasta que el ultrasonido hace que la mayor parte del movimiento y el flujo en el interior del vial, y tener cuidado de no calentar la solución innecesariamente. Continuar sonicación hasta que la solución se vuelve traslúcido, o cuando sea posible, transparente (2-5 minutos de sonicación punta, ~ 20 min de tratamiento con ultrasonidos de baño). </li><li> Aliquot SUV (por ejemplo, 10 l ó 20 l) y de congelación (-20 ° C) para su uso posterior. NOTA: Los lípidos, especialmente los lípidos insaturados, puede fácilmente avería. Soluciones de lípidos tienda a 20 ° C (o 80 ° C) en atmósfera de argón y utilizan dentro de los 6 meses. Productos de degradación de lípidos pueden ser detectados con cromatografía de capa fina. </li></ol></li></ol> 3. GUV Crecimiento por Electroformation <ol><li> Prepare la cámara electroformation. <ol><li> Si la cámara no se ha limpiado, retire las ventanas, elimine todo el sellador y la grasa, extraiga los cables, y enjuague y frote la cámara con un paño con agua y etanol (≥70%) alternativamente. </li><li> Frotar los cables así, se sumergen los alambres y la cámara en acetona, y sonicar durante 5 min. Limpie todo con un tejido nuevo utilizando acetona. Ponga la cámara en etanol y se somete a ultrasonidos durante 5 min. </li><li> Montar la cámara mediante la inserción de los cables a través de los agujeros, y girar y limpie los cables para asegurarse de que are limpio. Ponga la cámara en agua destilada, sonicar durante 5 min y secar la cámara con una corriente de nitrógeno o aire. </li></ol></li><li> Preparar 30 l de 3 mg / suspensión SUV ml en tampón SUV. Para formar GUVs que contienen proteínas, combine 8 l de Proteo-SUV (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), 2 l de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5% en moles TexasRed-DHPE) y 20 l de SUV tampón en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para una proteína final de lípidos (masa) relación de 1 a: 12,5 y 0,1% en moles TexasRed-DHPE. Mezclar enérgicamente la solución. <ol><li> Alternativamente, para practicar el protocolo de sólo con lípido SUVs, simplemente combinar 10 l de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC y 0,5% en moles TexasRed-DHPE) con tampón de SUV 20 l. </li></ol></li><li> Deposite la Solución SUV. <ol><li> Usar una pipeta de 2 l o 5 l jeringa de vidrio para depositar pequeños (&lt;0,2 mu l) gotitas de la solución SUV en los cables. Aproximadamente se necesita 1 l de solución para formar una serie de gotas a lo largo1 cm de alambre. Asegúrese de que las gotas son lo suficientemente pequeños y espaciados lo suficientemente aparte que no se toquen o fusible. </li><li> Deje que los SUVs depositados sequen durante ~ 30 minutos en el aire libre. Cuando todas las gotas se han asentado, gire el cable por lo que los depósitos de lípidos son más fáciles de observar con el microscopio. NOTA: Si los SUVs no se sequen lo suficiente, que sólo puede lavar los cables cuando se añade el tampón de crecimiento, mientras que el secado en exceso puede dañar la proteína. Debido a la humedad del aire influye en la velocidad de secado, el tiempo de secado y / o la humedad del aire se puede ajustar para obtener resultados óptimos 30. La película de lípidos en los cables debe ser visible en el microscopio. </li></ol></li><li> Montar la cámara. <ol><li> Sellar el fondo de la cámara: Utilice una jeringa para aplicar grasa de vacío a la parte inferior de la cámara alrededor de los tres pozos y presione un 40 mm x 22 mm cubreobjetos suavemente contra él para sellar el fondo de la cámara para que se adhiera sin un hueco. Selle los lados de la cámara (en la salida cables) consellado pasta. Aplicar grasa de vacío en la parte superior de la cámara de esbozar los tres pozos. </li><li> Agregue lentamente tampón crecimiento hasta cada pozo se llena hasta el tope. Evite cualquier movimiento rápido de la solución en los pozos, ya que esto puede pelar la película de lípido de los electrodos. </li><li> Cerrar la cámara pulsando el portaobjetos cubierta superior con cuidado sobre la grasa, teniendo cuidado de no desplazar el portaobjetos inferior. Utilice un tejido para eliminar las gotas de tampón a los bordes de la hoja de la cubierta superior. NOTA: Este es un buen momento para examinar la cámara bajo el microscopio para confirmar que la película de lípido se ha mantenido en los cables. </li></ol></li><li> Conecte el generador de señales a los cables utilizando dos pinzas de cocodrilo. Ajuste la frecuencia (10 Hz / 500 Hz onda sinusoidal de tampón salino de baja / alta) y usar un multímetro para medir y ajustar el voltaje a través de los cables de 0,7 / 0,35 V raíz cuadrada (Vrms) para el búfer de sal baja / alta significar. Cubra la cámara con papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz. Deja tél GUVs crecer durante 2 a 3 h para el tampón bajo en sal, y 12 hr o O / N para el tampón de alta sal. </li><li> Desconecte la cámara del generador y que lo coloque en un microscopio invertido para evaluar el crecimiento GUV. Utilice, movimientos lentos y firmes o flujo de líquido en los pozos pueden desprenderse prematuramente GUVs de los cables. NOTA: GUVs en los bordes de alambre son generalmente visibles en contraste de fase (40X mucho trabajo objetivo distancia), mientras GUVs en cualquier lugar en la mitad inferior de los cables se pueden ver con epifluorescencia. Si no hay GUVs son visibles, intente girar los cables a mirar a la cara superior. GUVs se pueden almacenar a 4 ° C en una cámara de crecimiento durante varios días. </li></ol> 4. GUV Crecimiento por Hinchazón asistida-Gel <ol><li> Preparar 10 ml de una solución de agarosa al 1% mediante la mezcla de 100 mg de agarosa con 10 ml de agua pura. Calentar hasta que hierva colocándolo en un microondas a 480 W durante ~ 20 seg. Revuelva para asegurarse de que la agarosa se disuelva por completo. NOTA: La soluciónse puede almacenar a 4 ° C y recalentado cuando sea necesario. </li><li> -Plasma limpia (plasma de aire) a-corredera de cobertura de 1 min de manera que la solución de agarosa se extenderá muy bien en él. Utilice los toboganes de cobertura dentro de los próximos 15 minutos como el efecto de limpieza por plasma desaparece rápidamente. </li><li> Aplicar 200 l de solución de agarosa caliente a cada 22 x 22 mm 2 diapositiva para la solución moja toda la superficie. Inclinar la placa verticalmente y tocar el borde inferior de un pañuelo de papel para eliminar el exceso de líquido y dejar sólo una capa lisa fina de agarosa en la diapositiva. </li><li> Colocar el portaobjetos en una placa caliente o un horno a 60 ° C y se deja secar durante al menos 30 minutos. La película de agarosa es apenas visible a simple vista. Después de las diapositivas se enfríen a temperatura ambiente, utilizar inmediatamente o almacenar durante un máximo de una semana en un recipiente cerrado a 4 ° C. </li><li> Coloque el cubreobjetos de agarosa recubiertas de 3,5 cm en un plato de Petri estándar. </li><li> Preparar la solución SUV como en la Sección 3.2 y aplicar ~ 15 l de la solución SUV (3 mg / ml de lípidos) en~ 30 gotas muy pequeñas suavemente sobre la superficie de agarosa. Tenga cuidado de no distorsionar la capa de agarosa demasiado. </li><li> Colocar el portaobjetos bajo una corriente suave de nitrógeno durante aproximadamente 10-15 min y seguir la evaporación de la memoria intermedia por el ojo como las gotitas se secan. </li><li> Tan pronto como las SUVs se han secado, añadir tampón de crecimiento para cubrir la superficie de deslizamiento. Para un pequeño 3,5 cm placa de Petri de uso ~ 1 ml de tampón. </li><li> Deje que la hinchazón de proceder para ~ 30 min, y luego examinar el crecimiento de GUVs en la cámara usando un microscopio invertido con contraste de fase o de contraste de interferencia (DIC). NOTA: la observación de epifluorescencia es difícil debido a la sólida formación de fluoróforos en el gel y la auto-fluorescencia de la agarosa. </li></ol> 5. La cosecha y de Observación GUVs <ol><li> Pasivar la cámara de observación (por ejemplo, pequeña placa de Petri o cubreobjetos de vidrio) para que GUVs no se pegan, se extendió y estalló en el fondo de la cámara. Cubra el chamBER parte inferior con una solución de beta-caseína, incubar durante 5 min, enjuagar la solución de caseína con agua pura, seca con una corriente de aire o nitrógeno, y finalmente añadir tampón de observación (por ejemplo, ~ 5 mm de profundidad para una pequeña placa de Petri). </li><li> Recoger las GUVs. Corte el extremo de unos 100 puntas de pipeta mu l por lo que la apertura es más grande (~ 2 mm de diámetro), y aspirar lentamente a medida que la tensión de corte de pipeteo puede destruir fácilmente GUVs. <ol><li> Para GUVs electro-formado, abrir la cámara de crecimiento quitando suavemente el cubreobjetos superior. Coloque la punta de la pipeta directamente sobre cada cable y aspirar ~ 50 l mientras se mueve la punta de la pipeta a lo largo del alambre para desprender las GUVs. NOTA: Puede ser útil para hacer girar el alambre para recoger GUVs en el &quot;otro lado&quot; del alambre. </li><li> Para GUVs &quot;gel asistida inflamación&quot;, primero toque el lado de la placa de Petri un par de veces para ayudar a los GUVs se desprenden de la superficie de cubreobjetos. Coloque la punta de la pipeta justo por encima del cubreobjetos y aspirado de 50 l mientras que Pulling la punta hacia atrás sobre la superficie. Transferir directamente GUVs cosechadas a una cámara de observación, o almacenar en un tubo de 1.5 ml a 4 ° C hasta por 1 semana. </li></ol></li><li> Coloque la cámara de observación en un microscopio invertido, agregue las GUVs a la cámara de observación, y espere unos minutos para que los GUVs que se depositan en el fondo de la cámara. </li><li> Encuesta de la cámara con contraste de fase o CID para localizar rápidamente, esféricas (&#39;defecto libres &quot;)&quot; candidatos GUV &quot;lisas. Examine cada &quot;candidato GUV&quot; en epifluorescencia para excluir cualquier liposomas más pequeños que contienen anidadas dentro. Por último, compruebe que la intensidad de la fluorescencia de lípidos es uniforme y compatible con una sola membrana (es decir, unilaminar). NOTA: En algunos bilaminar (o multi-lamelares) vesículas, las membranas son demasiado juntos por resolver para que aparezcan unilaminar en contraste de fase o DIC imágenes. Sin embargo, estos objetos se pueden distinguir de unilame realGUVs llar por su fluorescencia de lípidos, que es dos veces (o más) más brillantes. </li></ol> 6. GUVs Parche de sujeción <ol><li> Haga pipetas de parche con un diámetro de la punta 1-2 micras de vidrio estándar capilar borosilicato utilizando el programa recomendado para el extractor de la pipeta. NOTA: Los tratamientos especiales tales como pulido al fuego no son necesarios, y las pipetas se pueden utilizar durante varios días después de haber sido tirados si se mantienen en una caja cerrada. </li><li> Pasivar la cámara mediante la incubación con una solución de beta-caseína (5 mg / ml) para asegurar que GUVs no se adhieren, se propagan y ruptura en superficies de la cámara. Enjuague la caseína después de 5 min. </li><li> Inserte el electrodo de tierra, llenar la cámara con tampón de observación, transferir 10 l de la suspensión GUV como se describe en el paso 5.2 y 5.3, y espere unos minutos para que los GUVs se asienten en la parte inferior. </li><li> Llenar una pipeta parche nuevo con la solución (buffer de observación u otra solución iso-osmótica) ymontarlo en el patch-clamp amplificador cabezal de la platina. </li><li> Buscar a través de la cámara de la localización de un GUV &quot;sin defectos&quot; como se describe en la sección 5.4, y compruebe que contiene proteína fluorescente. </li><li> Aplique una presión positiva constante (&gt; 100 Pa, o aproximadamente 1 cm H 2 O en un manómetro) para mantener el parche pipeta interior limpio e inserte la pipeta parche en la cámara. Traiga la pipeta parche en el campo de visión, aplicar pulsos de prueba para medir / compensar el desplazamiento y la resistencia de tensión pipeta, y examinar la pipeta con iluminación fluorescente para confirmar que la punta esté limpio. </li><li> Lleve el parche pipeta hacia el GUV, y si es necesario, al mismo tiempo reducir la presión positiva por lo que el flujo hacia el exterior de la pipeta parche no hace que el GUV &quot;huir&quot;. Cuando el parche pipeta está cerca del GUV, aplique una presión negativa (hasta 5 cm H 2 O) para tirar del GUV contra la pipeta parche. Vigilar la resistencia como la &quot;; La lengua &quot;de la membrana GUV entra en la pipeta de parche y las formas gigaseal. </li><li> Si un gigaseal no se formó, retire el parche pipeta de la cámara y vuelva al paso 6.4. Si el parche de la membrana forma una gigaseal, pero el GUV permanece unido a la pipeta, escindir el parche tirando lejos de la GUV, estallando la GUV contra el fondo de la cámara, o brevemente mover la pipeta de la solución. </li><li> Cuando el parche de membrana de dentro a fuera se ha escindido del GUV y la gigaseal es estable, apagar los pulsos de prueba y aplicar un protocolo de voltaje tal como la que se muestra en la Figura 13. NOTA: La Figura 13 sigue la convención electrofisiológico estándar para un parche de dentro a fuera, en la que la corriente que fluye en el parche-electrodo es &quot;positivo&quot;, y V = V baño - V pipeta. Sosteniendo el parche a un potencial negativo (por ejemplo, V = -100 mV) para ~ 30 seg KvAP lugares en el estado de reposo, mientras que los pasos (100 ms a 5 s) a potenciales más positivos (por ejemplo, V = 100 mV) se puede conducir en la realización (es decir, abiertos) estados activos. </li><li> Después de que se terminaron las mediciones en un parche de membrana, romper el parche con un pulso zap o presión y comprobar que el desplazamiento del electrodo de conexión de tensión no se ha desviado. Retire el parche pipeta de la cámara, y vuelva al paso 6.4. </li></ol>

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P., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Lipids+in+VDAC+Oligomerization.">The Role of Lipids in VDAC Oligomerization.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+voltage-dependent+K++channel.">X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reconstitution+of+a+Voltage-Gated+Potassium+Channel+in+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles.</a> PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. 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S., Crowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+trehalose+special+for+preserving+dry+biomaterials.">Is trehalose special for preserving dry biomaterials.</a> Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sistemas de modelos biomiméticos son una herramienta importante para el estudio de las propiedades e interacciones de proteínas y membranas. En comparación con otros sistemas reconstituidos como BLM o membranas de lípidos compatibles, GUV sistemas basados ​​presentes varias oportunidades incluyendo considerable control de la composición de la membrana, la tensión y la geometría, así como ser verdaderamente libre de aceite. Sin embargo, la incorporación de proteínas transmembrana, como KvAP, en GUVs requier...

Al estudiar los principios físicos que rigen los sistemas vivos, los enfoques ascendentes permiten un experimentalista para controlar la composición del sistema y otros parámetros que no son fácilmente manipulables en sistemas basados ​​en células 1. Para los procesos basados ​​en membranas, vesículas unilamelares gigantes (GUVs, diámetro ~ 1-100 micras) han demostrado ser un sistema muy útil biomimético 2 - 7 ya que son muy adecuado para estudios de microscopía y micromanipulación 8 - 10. Si bien hay muchos protocolos diferentes para producir GUVs, la mayoría caen en dos categorías - emulsión a base aproxima 11,12 y técnicas basadas en la rehidratación de una película lipídica 13-16. En los métodos basados ​​en emulsión, las láminas interior y exterior de las membranas GUV se ensamblan secuencialmente a partir de monocapas de lípidos en las interfases agua / aceite. Este método es ideal para la encapsulación de proteínas solubles conen los GUVs, y para la formación de GUVs con composición lipídica valva asimétrica. Sin embargo, GUVs formados a partir de emulsiones pueden retener trazas de disolvente que cambian las propiedades mecánicas de la membrana 17, y el enfoque no es especialmente adecuado para la reconstitución de proteínas trans-membrana. Métodos de rehidratación de película se basan en el hecho de que el secado (deshidratación) causa muchas mezclas de lípidos para formar una pila multi-lamelar de las membranas. Si esta pila se coloca entonces en contacto con un tampón acuoso, las membranas de la pila se moverán flujos separados como disolvente entre ellos y en la superficie de la pila, las membranas individuales pueden separar para formar GUVs 13,18 (así un verdadero zoológico de otros objetos lipídicos). Sin embargo, incluso para las composiciones de amortiguación y de lípidos óptimos, este método clásico &quot;inflamación espontánea&quot; tiene un rendimiento relativamente bajo de GUVs libres de defectos. Un método muy utilizado para aumentar el rendimiento de GUVs sin defectos es &quot;electroformation221 ;, en el que se aplica un campo de corriente alterna (AC) durante la rehidratación de la película. Mientras que el mecanismo sigue siendo poco conocida, &quot;electroformation&quot; puede dar rendimientos GUV espectaculares (&gt; 90% en circunstancias favorables) para los búferes de baja concentración de sal (&lt;5 mM) 14,19, e incluso se puede trabajar en tampones fisiológicos (~ 100 mM) usando una mayor frecuencia (500 Hz frente a 10 Hz) de campo de CA y electrodos de platino 15. Un enfoque alternativo para aumentar el rendimiento de GUVs libres de defectos es &quot;gel asistida inflamación&quot;, en el que se deposita la solución de lípidos sobre un sustrato de gel polimérico en lugar de la pasiva sustratos (por ejemplo, vidrio, PTFE) utilizado en &quot;inflamación espontánea clásica &quot;. Cuando se rehidrata la película de lípido / gel resultante, GUVs pueden formar rápidamente incluso para tampones fisiológicos 16,20. Todos estos métodos pueden producir GUVs lípidos sólo que se pueden utilizar para estudiar los fenómenos asociadas a la membrana tales como lala interacción entre las proteínas y las membranas solubles. Sin embargo, para incorporar una proteína trans-membrana en GUVs, se necesitan modificaciones importantes para asegurar que la proteína permanece en un estado funcional durante todo el procedimiento de reconstitución. Mientras que las soluciones de lípidos en disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo, ciclohexano) son ideales para la producción de películas de lípidos, las proteínas trans-membrana son típicamente sólo es estable cuando su dominio trans-membrana hidrófoba se incorpora en una bicapa lipídica, o rodeado por una micela detergente ( por ejemplo, durante la purificación de proteínas). Por lo tanto, el material de partida para una reconstitución es típicamente membranas nativas, proteína purificada en una solución de detergente, o pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas (Proteo-SUVs) y / o vesículas multilamelares (proteo-MLV) formado por la eliminación del detergente en el presencia de lípidos. La mayoría de los métodos para incorporar estas proteínas de membrana en GUVs se dividen en tres categorías. Insertio directon: Trans-proteína de membrana suspendida en el detergente se mezcla con, de sólo lípidos, GUVs solubilizadas ligeramente detergentes preformadas, y el detergente elimina a continuación usando Biobeads 21. Si bien conceptualmente simple, este método requiere un control preciso de la concentración de detergente, como una concentración demasiado alta de detergente puede disolver los GUVs mientras que una concentración demasiado baja puede causar la proteína se despliegue o agregado. GUV / Proteo-SUV Fusión: La proteína en Proteo-SUV se combina con preformadas, lípidos sólo para GUVs y fusión se facilita con péptidos de fusión especiales 22 o detergente 21. Normalmente la extensión de la fusión es limitada llevando a GUVs con baja densidad de proteínas. La deshidratación / rehidratación: Una película de lípidos que contiene proteína está formada por deshidratación parcial de un proteo-SUV (o proteo-MLV) solución y GUVs se cultivan como para una película lipídica pura. El reto es obvio para proteger a la proteína durante la dehydrati parcialen el paso 23, pero el método se ha utilizado con éxito para reconstituir proteínas trans-membrana tales como bacteriorodopsina, calcio-ATPasa, integrina y VDAC en GUVs 7,23 - 25. Este artículo describe protocolos de deshidratación / rehidratación para hacer GUVs que contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP, desde el Archaea, Aeropyrum pernix hiper-termófilo. KvAP tiene un alto grado de homología con los canales de potasio dependientes de voltaje eucariota 26 y una estructura cristalina conocida 27 , por lo que es un buen modelo para estudiar el mecanismo de compuerta de voltaje. La producción de los proteo-SUV ha sido descrito en detalle anteriormente y no es parte de este tutorial 26,28,29. Es importante destacar que, KvAP Proteo-SUVs no tienen que ser producidos para cada preparación GUV, ya que pueden ser almacenados en pequeñas alícuotas (por ejemplo, 10 l) a -80 ° C durante largos períodos de tiempo (&gt; 1 año). Electroformationo hinchazón gel asistida se puede usar entonces para crecer GUVs de los proteo-SUVs KvAP (o proteo-MLV). Los pasos clave para el protocolo electroformation se ilustran en la Figura 1. Gotitas de una solución de SUVs que contienen la proteína se depositan sobre alambres de platino (que se muestran en la Figura 2). Deshidratación parcial de la suspensión de SUV conduce a la formación de una película de lípidos y proteínas a través de la fusión de SUVs. Durante la rehidratación, un campo de corriente alterna se aplica a los electrodos para ayudar a las capas de lípidos a la delaminación y formar GUVs. Un campo de 10 Hz funciona bien cuando se utiliza &quot;bajo en sal&quot; (&lt;5 mM) rehidratación de amortiguación 28 y GUVs tardan varias horas para crecer. En contraste, los tampones fisiológicos (que contiene ~ 100 mM de sal) trabajar bien con un voltaje más bajo, campo 500 Hz AC pero requieren un prolongado (~ 12 h) hinchazón período 15. Este método se basa en un protocolo anterior usando ITO se desliza 24, pero utiliza un cont cámara de encargoaining dos alambres de platino, como se muestra en la Figura 2 (ver la discusión de los detalles de diseño y sugerencias para la más simple, cámaras improvisado). La Figura 3 ilustra el método hinchazón gel asistida. El protocolo funciona bien con tampones con concentraciones fisiológicas de sal, es rápida, y produce GUVs con una distribución más homogénea de proteínas. Sin embargo, el rendimiento de GUVs, aparentemente sin defectos aislados (es decir, la membrana GUV es uniforme en la longitud de las escalas ópticas y no encierra ningún objeto) es menor, a pesar de que ofrece un número suficiente de patch-clamp y experimentos de micro-manipulación . Este método se basa en un protocolo usando gel de agarosa para producir GUVs lípidos sólo 16 y requiere un equipo menos especializado que el método electroformation. La caracterización de GUVs con microscopía de fluorescencia se describe, así como los procedimientos que utilizan un estándar de patch-clamp set-up amedir la actividad KvAP en &quot;dentro-fuera&quot; extirpados parches de membrana. Cultivo GUVs que contienen proteínas pueden ser más difícil que GUVs lípidos solamente. En particular, el rendimiento GUV final puede depender sensiblemente de exactamente cómo la solución SUV se deposita y se deshidrata para formar la pila de membranas. Para alguien sin ninguna experiencia previa con GUVs, puede ser útil para crecer primero GUVs lípidos sólo siguiendo un protocolo convencional de 15,16 en el que la película de membrana se forma mediante el depósito de lípidos en un disolvente orgánico. Una vez que el protocolo convencional funciona bien, SUV deposición y deshidratación parcial luego se pueden dominar el uso de los SUV de lípidos sólo, que también son muy útiles cuando se ajusta el protocolo para una nueva composición de los lípidos. Cuando GUVs crecen de forma fiable de los SUV de lípidos sólo, entonces es sólo un pequeño paso para producir GUVs que contienen proteínas de Proteo-SUV.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="599">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

Gigante vesículas unilamelares (GUVs) son un sistema biomimético popular para el estudio de la membrana fenómenos asociados. Sin embargo, comúnmente utilizados protocolos para crecer GUVs deben modificarse con el fin de formar GUVs que contienen proteínas transmembrana funcionales. En este artículo se describen dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e hinchazón gel asistida - para formar GUVs contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP. En ambos métodos, una solución de pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas es parcialmente deshidratado para formar una pila de membranas, que después se deja a hincharse en un tampón de rehidratación. Para el método de electroformation, la película se deposita sobre electrodos de platino de manera que un campo de corriente alterna puede ser aplicada durante la rehidratación de la película. En contraste, el método de la hinchazón gel asistida utiliza un sustrato en gel de agarosa para mejorar la rehidratación de la película. Ambos métodos pueden producir en GUVs (por ejemplo, 100 mM) concentraciones bajas (por ejemplo, 5 mM) y fisiológicas de sal. Los GUVs resultantes se caracterizan por medio de microscopía de fluorescencia, y la función de los canales reconstituidas midieron utilizando la configuración de patch-clamp de dentro a fuera. Mientras que la hinchazón en la presencia de un campo eléctrico alterno (electroformation) da un alto rendimiento de GUVs libres de defectos, el método hinchazón gel asistida produce una distribución más homogénea de proteínas y no requiere equipo especial.

El crecimiento de GUVs se puede evaluar de forma rápida mediante el examen de la cámara de crecimiento bajo el microscopio. Para electroformation, los GUVs tienden a crecer en racimos a lo largo de los alambres de platino, como se muestra en la Figura 4. Durante la hinchazón gel asistida, GUVs aparecen como estructuras esféricas que crecen y se fusionan juntos (Figura 5) rápidamente. GUVs sin defectos son más fácilmente identificados y evaluados despu...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

reconstitution-transmembrane-protein-voltage-gated-ion-channel-kvap

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K vistas.  Université Pierre et Marie Curie.  La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp. 

Video: Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Investigación

Biología

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploración del músculo liso arterial KV7 función del canal de potasio mediante electrofisiología Patch Clamp y miografía presión

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Examinando familia Bcl-2 Función con grandes vesículas unilamelares

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...