Los autores desean agradecer a Leonor Fleming y Chen Jessica útil para los debates. El financiamiento fue proporcionado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIH-NIAID) y un Premio R15AI079685 Research Corporation Cottrell Premio Facultad de Ciencias. Apoyo a los estudiantes adicional fue proporcionada por el Instituto Médico Howard Hughes y el fondo de Staley.

1. Preparación de grandes vesículas de lípidos unilamelares (LUVs) <ol><li> Prepare LUVs para servir como membrana de la célula imita para el ensayo 19. </li><li> Fosfatidilcolina Mix (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolamina (DNS-PAPA, 994.350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) disuelto en cloroformo en un 50 : relación de 45:5. Como cada ensayo requiere la preparación por separado de LUVs experimentales y control, dos viales de la torta de lípidos debe estar preparado. 0.376 mg de lípidos totales (0,188 mg POPC, 0.169 POPG mg, 0.019 mg y DNS-PAPA) suele ser suficiente para que las vesículas suficientes para un juicio translocación única. </li><li> Se evapora el cloroformo con una corriente de N2 gas. </li><li> Secar la torta de lípidos 14.09 horas en un desecador de vacío. </li><li> Prepare una solución stock 10 mM tampón HEPES (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58.44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampón HEPES es stOR a 4 ° C. </li><li> Prepare una solución madre de 0,4 mM tripsina porcina (23,3 kg / mol) en tampón HEPES 10 mM preparada anteriormente. Tripsina se almacenan a -20 ° C y, en nuestra práctica, por lo general no pasan por más de dos ciclos de congelación-descongelación antes de su uso. </li><li> Prepare una solución madre de 4,0 mM inhibidor de Bowman-Birk tripsina (8 kg / mol) en 10 mM solución tampón HEPES y almacenar a -20 ° C. En nuestro uso, esta población se abastece mensualmente y por lo general no sufre más de 3 de congelación / deshielo antes de que se hizo de nuevo. </li><li> Reconstituir experimental vesículas multilamelares (MLV) en una solución 0.2 mM de tripsina mediante la adición de un volumen igual de 0,4 mM de valores de tripsina y 10 mM solución tampón HEPES a la torta seca de lípidos. Para una sola muestra de 0.376 mg de lípidos totales, una mezcla de 150 ml de solución de tripsina y 150 l de tampón HEPES es suficiente. </li><li> MLV reconstituir el control en una solución con 0,2 mM de tripsina y 2,0 mM de Bowman-Birk inhibidor de la tripsina mediante la adición de un volumen igual de 0.4 mM tripsina de acciones y 4,0 mM de inhibidor de tripsina de las tortas de lípidos secos. Para una sola muestra de 0.376 mg de lípidos totales, una mezcla de 150 ml de solución de tripsina y 150 l de inhibidor de tripsina es suficiente. </li><li> Transferencia de MLV soluciones de frascos de vidrio de 1,7 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Asunto MLV soluciones al 5 de congelación / deshielo en nitrógeno líquido. </li><li> Prepare lípidos extrusora (Avanti Polar Lipids) mediante la colocación de dos soportes de filtro humedecido en una solución tampón HEPES en cada pieza de teflón extrusora. Colocar una membrana pista Nuclepore grabado con 0,1 micras poros (Whatman, Reino Unido) entre las dos piezas de teflón extrusora, y colocar las piezas del extrusor dentro del recipiente de metal extrusora. Coloque el espaciador dona más de las dos piezas del extrusor antes de apretar la tapa de metal de la lata del extrusor y colocarlo en el soporte. </li><li> Llenar el volumen vacío dentro de la extrusora con 500 l tampón HEPES 10 mM usando una jeringa de vidrio de 250 l para evitar la pérdida de la muestra de la vesícula. &lt;/ Li&gt; <li> Cargar cada muestra MLV en la extrusora y empuje la muestra a través de la membrana por lo menos 21 veces para asegurarse de tamaño uniforme de vesículas unilamelares. LUVs se obtienen a partir de la extrusión siguientes MLV solución. </li><li> LUVs se almacena a 4 º C y utilizar dentro de las 48 horas. </li></ol> 2. La cuantificación de la concentración LUV <ol><li> LUV concentración se cuantificó mediante la determinación del contenido total de fósforo en la muestra 20. </li><li> Prepare 8,9 NH 2 SO 4 en agua Nanopure y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Prepare un 2,5% w / v de amonio molibdato VI (588,04 g / mol) disolución en agua Nanopure. Prepare un 10% w / v de ácido ascórbico (176,1 g / mol) disolución en agua Nanopure. Proteger a la solución de ácido ascórbico de la exposición a la luz por la que cubre el tubo con papel de aluminio. Tienda de ambas soluciones a 4 º C durante un máximo de 2 meses. </li><li> Prepare 0,65 mM de fosfato solución tampón (fosfato monobásico de sodio anhidro, 120 g / mol). </li><li> Preparar seis estándar tubes. Las normas deben contener 0,0 l, 50 l (0,0325 moles), 100 L (0,065 moles), 175 l (0,114 moles), 250 l (0,163 moles), o 350 l (0,228 moles) de solución de fósforo. </li><li> Prepare LUV tubos de muestras por triplicado. Cada tubo de ensayo debe contener aproximadamente 0,1 moles de LUVs. Experimentales y de control LUV concentraciones deben medirse por separado. </li><li> Para corregir las sales de fósforo en el polvo seco inhibidor de Bowman-Birk, un control de LUV en blanco debe estar preparado. El blanco debe contener el mismo volumen del 0,2 mM mM trypsin/2.0 solución de inhibidor de Bowman-Birk que fue colocado en el control LUV tubo de muestra. </li><li> Colocar 450 l de 8,9 NH 2 SO 4 en cada una de las muestras, estándar, y los tubos de vacío. </li><li> Muestras de calor, las normas y los espacios en blanco durante 25 minutos a 175-210 ° C en un horno. </li><li> Retire todos los tubos y deje que se enfríen. Añadir 150 ml de 30% de H 2 O 2 a cada uno de los tubes. </li><li> Muestras de calor, las normas y los espacios en blanco durante 30 minutos a 175-210 º C. </li><li> Quitar las muestras, las normas y los espacios en blanco del fuego. Si alguna de las soluciones aún no son incoloros, se añaden 50 l H 2 O 2 a todos los tubos y el calor durante 15 minutos a 175-210 º C. </li><li> Añadir 3,9 ml Nanopure H 2 O, 0,5 ml de solución de molibdato de amonio y 0,5 mL de solución de ácido ascórbico a cada tubo. </li><li> Todos los tubos de calor durante 5-7 minutos en un baño de agua hirviendo. </li><li> Medir la absorbancia de cada estándar y muestra a 820 nm utilizando un Agilent 8453 espectrofotómetro UV-Visible. El tubo que contiene 0,0 mmol de fósforo se debe utilizar como blanco de todas las normas y experimental LUV muestras. El tubo que contiene el 0,2 mM mM trypsin/2.0 Bowman-Birk solución de inhibidor debe ser utilizado como blanco para el control de la muestra LUV. </li><li> Un contenido de fósforo lineal absorbancia frente a la curva estándar puede ser producido y utilizado para calcular el total de phosphOrus contenido y la LUV concentración de las muestras. </li></ol> 3. La preparación de soluciones de péptidos <ol><li> Disolver péptido en Nanopure H 2 O. Los péptidos utilizados en este ensayo como se describe debe contener un residuo de triptófano. </li><li> Medir la absorbancia de la solución de péptido a 282 nm por triplicado. Calcular la concentración de péptido mediante el coeficiente de extinción molar de triptófano de 5700 M -1 cm -1. </li><li> Diluir en agua Nanopure péptido a una concentración final de 30 micras. Almacenar a -20 ° C </li></ol> 4. Translocación de cuantificación <ol><li> Preparar muestras experimentales y de control en el 1,7 mL tubos de microcentrífuga. Añadir LUVs suficiente para cada solución, para una concentración final de 250 mM. Agregar suficiente Bowman-Birk solución de inhibidor de modo que es inhibidor de una concentración final 10 veces mayor que la concentración de tripsina. Agregar suficiente tampón HEPES 10 mM para llevar el volumen de la solución final a 450 mL. </li> &lt;li&gt; Lugar 50 l solución del péptido en una célula Starna micro fluorómetro de cuarzo. La relación entre LUVs y el péptido es lo suficientemente alta para asegurar que prácticamente todos los péptidos intactos están muy cerca como para un grupo dansilo para dar una señal de FRET, aunque ninguno de ellos ha translocado en la vesícula. Esto es consistente con la observada en el FRET similares condiciones de control de péptidos que hacer y no trasladar en vesículas. </li><li> Añadir la muestra experimental o de control para la solución de péptido en la cubeta. Esto debería reducir la concentración de péptido final a 3 micras. </li><li> Comenzar un experimento de 25 minutos cinética de fluorescencia inmediatamente después de la adición de experimental o de control LUV solución, teniendo una lectura de la fluorescencia por lo menos una vez por segundo. La longitud de onda de excitación a 280 nm, la longitud de onda de emisión a 525 nm, y la temperatura a 25 ° C. El uso de un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse, que ajustar la sensibilidad a la PMT de alta. </li></ol><html> 5. Generación de una Relación de translocación cuantitativos <ol><li> Definir fluorescencia inicial (F o) como la lectura de fluorescencia después de quince segundos de la recopilación de datos. En nuestra configuración del instrumento, hemos encontrado que los primeros quince segundos de los datos de fluorescencia recogidos no son fiables debido a la mezcla, cerrar la cámara de la muestra, y otras perturbaciones en el sistema con la adición de la muestra. Divide cada lectura posterior por F o para obtener la fluorescencia relativa (F / F 0) en cada momento. </li><li> Promedio de todas las lecturas de fluorescencia relativa de la última hora del experimento para obtener una final de fluorescencia relativa media <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Divida el <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> para las muestras de control por parte del <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> para muestras experimentales para obtener un valor corregido de fluorescencia final. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Resultados Representante La Figura 2 muestra los resultados de este ensayo para un péptido representante que mostró translocación robusto. La señal en este experimento (negro traza) muestra un marcado descenso de la señal de FRET en el tiempo. Sin embargo, es importante controlar la posible pérdida de la señal de FRET debido a la inhibición de tripsina incompleta o otros factores no relacionados con la capacidad de desplazamiento. Con este fin, siempre también medir la señal de FRET entre los péptidos y LUVs que contiene tanto la tripsina y Bowman-Birk inhibidor de la tripsina (gris traza, figura 2). En nuestras manos, ha sido importante para llevar a cabo este control para cada péptido cada vez que se ejecute un experimento. Esto nos permite corregir claramente cualquier cambio en la señal debido a las diferencias entre las preparaciones de vesículas de lípidos o el ruido del instrumento, que puede ser significativo para las señales fluorescente relativamente débil suele observarse en estas concentraciones. La importancia de las experiencias de controlriment con LUVs que contiene inhibidor de la tripsina se destaca por los datos mostrados en la Figura 3. En este caso, el péptido señal de disminución de una cantidad similar a la de la Figura 2 en la muestra experimental (rastro negro). Sin embargo, la muestra de control muestra una disminución más rápida de este péptido, por lo que su desplazamiento neto es inferior. La sección 5 de nuestro protocolo describe un método sencillo para cuantificar la translocación de este experimento. Mayores relaciones de translocación son indicativos de los péptidos que trasladar de manera eficiente, la relación de la translocación de los péptidos penetrantes de células se muestra en la Figura 2 es de 1,16, mientras que translocación débilmente péptidos tienen índices de desplazamiento más cercano a 1. En nuestra experiencia, el error estándar de tres experimentos independientes realizados con preparados de diferentes vesícula está en el rango de 0,01 a 0,06. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática de translocatanálisis de iones. Experimental LUV muestras (A) son dopados con fluorescentes PAPA dansilo (barras de color negro) y contienen encapsulado tripsina (tijeras). Inhibidor de la tripsina (círculo rojo) se utiliza para inhibir la tripsina fuera de la LUVs. El LUVs están expuestas al péptido (morado). Péptido junto con los rendimientos de las membranas LUV un traste de la señal (verde), que disminuye a medida que los péptidos translocting encuentro tripsina internos sin inhibiciones. Tanto la tripsina y el inhibidor de tripsina se encapsulan en el control de las muestras LUV (B) para medir la disminución de la señal de FRET no relacionados con la translocación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Figura 2. Datos representativos de un péptido penetran en las células. Un representante de la translocación pepide antimicrobianos muestra un descenso significativo en FRET señal en comparación con su control. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Figura3. Datos representativos destacando la importancia del control. Inhibición incompleta de la digestión tríptica de un péptido de translocación no conduce a una caída en el FRET señal con el tiempo, tanto experimentales y de control LUV soluciones. Debido a la diferencia entre el control y la traza experimental es relativamente pequeño, este mutante se caracteriza por ser un péptido débilmente translocación.

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	<li>Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides+and+antimicrobial+peptides:+how+different+are+they?.">Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?.</a> Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).</li><li>Trehin, R., Merkle, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chances+and+pitfalls+of+cell+penetrating+peptides+for+cellular+drug+delivery.">Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery.</a> Eur. J. Pharm. 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No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo que aquí se presenta puede ser utilizado para evaluar el cambio relativo en la concentración de péptidos dentro y fuera de las vesículas lipídicas. Estos cambios están relacionados con la capacidad de desplazamiento. Este protocolo se puede utilizar para identificar penetran en las células péptidos con potencial como vectores de la administración de fármacos. Como el interés en la celda de penetración de los péptidos crece, será interesante ver cómo los métodos que miden directamente el caso...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansilo PE </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Tripsina porcina </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk tripsina / quimotripsina inhibidor </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-extrusora </td><td> Avanti Polar Lípidos </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Molibdato de amonio (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> El peróxido de hidrógeno, 30% de solución </td><td> Mallinckrodt productos químicos </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

Hay un interés activo en péptidos que atraviesa fácilmente las membranas celulares sin la ayuda de los receptores de membrana de la célula 1. Muchos de estos se conocen como células de penetración de los péptidos, que con frecuencia se caracterizan por su potencial como vectores de administración de fármacos 1-3. Por otra parte, hay un creciente interés en los péptidos antimicrobianos que operan a través de mecanismos no-membrana lítica 4,5, en particular los que atraviesan las membranas bacterianas sin causar lisis celular y destruir las células al interferir con los procesos intracelulares 6,7. De hecho, los autores han señalado cada vez más la relación entre los péptidos penetran en las células y la resistencia a 1,8. Una sólida comprensión del proceso de translocación de membrana y la relación entre la estructura de péptidos y su capacidad para trasladar requiere ensayos de eficacia y reproducible para el desplazamiento. Varios grupos han propuesto métodos para medir el desplazamiento en gran unilamellar vesículas de lípidos (LUVs) 13.09. LUVs servir como modelos útiles para las membranas celulares bacterianas y eucariotas y se utilizan con frecuencia en estudios de péptido fluorescente 14,15. A continuación, describimos nuestra aplicación del primer método desarrollado por Matsuzaki y compañeros de trabajo para considerar los péptidos antimicrobianos, como Magainin y buforin II 16,17. Además de proporcionar el protocolo para este método, también presentamos un método directo para el análisis de datos que cuantifica la capacidad de desplazamiento utilizando este ensayo. Las ventajas de este ensayo de translocación en comparación con otros que tiene el potencial para proporcionar información sobre la tasa de translocación de membrana y no requiere la adición de una etiqueta fluorescente, que pueden alterar las propiedades del péptido 18, al triptófano que contienen péptidos. En pocas palabras, la capacidad de desplazamiento en las vesículas de lípidos se mide en función de la transferencia de energía Fomentar la resonancia (FRET) entre los residuos de triptófano nativos y dansyl fosfatidiletanolamina cuando las proteínas se asocian con la membrana externa LUV (Figura 1). Penetran en las células se rompen como los péptidos que se encuentran inhibidos tripsina encapsulada con la LUVs, lo que lleva a la disociación de la membrana LUV y la caída de la señal de FRET. La caída de la FRET señal observada para un péptido de translocación es significativamente mayor que la observada para el mismo péptido cuando el LUVs contener la tripsina y el inhibidor de tripsina, o cuando un péptido que no espontáneamente atravesar las membranas de lípidos está expuesto a la tripsina que contienen LUVs. Este cambio en la fluorescencia proporciona una cuantificación directa de la translocación de péptidos a través del tiempo.

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Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Este protocolo de detalles un método para la medición cuantitativa de la translocación de péptidos en grandes vesículas de lípidos unilamelares. Este método también proporciona información sobre la tasa de translocación de membrana y puede ser utilizado para identificar péptidos que de manera eficiente y espontáneamente bicapas lipídicas cruz.

La translocación de péptidos en la medición de grandes vesículas unilamelares

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.8K vistas.  Wellesley College. Este protocolo de detalles un método para la medición cuantitativa de la translocación de péptidos en grandes vesículas de lípidos unilamelares. Este método también proporciona información sobre la tasa de translocación de membrana y puede ser utilizado para identificar péptidos que de manera eficiente y espontáneamente bicapas lipídicas cruz.

Video: Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Investigación

Biología

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Examinando familia Bcl-2 Función con grandes vesículas unilamelares

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Tirando de nanotubos de membrana de las vesículas unilaminar gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...