The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).

1. Construção de Vectores de Expressão <ol><li> O uso de infusão de clonagem por PCR para construir até 96 plasmídeos de expressão em paralelo utilizando os vectores pOPINE-3C-GFP e POPIN-N-GFP que adicionam tanto cliváveis ​​fusões GFP-His6 C-terminal ou N-terminal com as sequências 13, respectivamente. Nota: A escolha do vector é ditada pela topologia da proteína desde a GFP precisa ser expresso no citosol, assim, para uma proteína com um terminal N e citosólica extracelular C-terminal seria usar POPIN-N-GFP e para um N-terminal extracelular e citosólica C-terminal em que usaria pOPINE-3C-GFP. Onde ambos os terminais são cytosolic usaríamos pOPINE-3C-GFP a menos que haja razão funcional para não marcar o C-terminal. </li><li> Amplificar as sequências de DNA que codificam as proteínas de membrana com primers que incorpora as seguintes extensões mostradas: pOPINE-3C-GFP (cartilha Atacante - AGGAGATATACCATG; primer reverso - CAGAACTTCCAGTTT) e Popin-N-GFP (cartilha Atacante - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; - ATGGTCTAGAAAGCTTTA) primer reverso. </li><li> Analisar a reacção de PCR por electroforese em gel de agarose. Uma vez que os produtos limpos de PCR foram obtidos, adicionam-se 5 L Dpnl a cada poço (tornar-se em 5 ul de tampão de reacção Dpnl 1x). Purifica-se os produtos de PCR utilizando esferas magnéticas num formato de 96 poços. Nota: Dpnl é adicionado para remover o vector de molde; este passo não é necessário se o DNA genómico são utilizadas como molde. </li><li> Adicionar 1 ul (100 ng) do vector linearizado apropriado para cada poço de uma placa de PCR. </li><li> Usando um pipetador multicanal suplemento x ul de PCR purificado para inserir os poços apropriados da placa de PCR. Certifique-se de que todos os produtos estão na faixa de 10-250 ng. </li><li> Adicionar (9-x) ul de água para o bem e transferir a totalidade dos 10 ul a um tubo contendo o reagente seco para baixo em fusão. Deixe por 30 seg. </li><li> Misture o conteúdo brevemente por pipetagem cima e para baixo. Transferênciaas reações de volta para a chapa original PCR e selo. </li><li> Incubar durante 30 min a 42 ° C num termociclador. </li><li> Transferir imediatamente as reacções em gelo logo que a reacção está completa e adicionar 40 ul de TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). </li><li> Congelar de uma só vez ou em transformar células competentes. Para a transformação, utilizar 3 ul da reacção diluída por 50 ul alíquota de alta competência (&gt; 5 x 10 9 transformantes / ug) competentes E. células de E. coli. </li><li> Adicionar 1 ml de agar LB suplementado com 50 ug / ml de carbenicilina por poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços (por clonagem, para preparar os poços 2 x número de construções). </li><li> Após crescimento, a excrescência Seguindo placa 25 ul e 25 ul de uma diluição de 1 em 5 de cultura para o agar contendo 24 poços, placas de cultura de tecido. </li><li> Espalhe as células inclinando levemente a placa. </li><li> Seca-se a placa com a tampa durante 10-15 min a 37 ° C ou em um flohood w à temperatura ambiente. </li><li> Substituir a tampa e para girar a placa de cabeça para baixo e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Escolha duas colônias e mini-prep os vetores. </li><li> PCR verificar as construções que utilizam o específico primer reverso construção e um primer específico para a frente vector (por exemplo pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG). </li></ol> 2. Transformação de E. E coli Cepas Xpression Nota: Antes de executar este protocolo, E. As células competentes de E. coli são feitas, aliquotado e armazenado congelado a -80 ° C tal como anteriormente descrito 13. Expressão da proteína de membrana é rotineiramente em duas linhagens, Lemo21 (DE3) e C41 (DE3) pLysS. Para facilitar a interpretação dos resultados, pode ser útil incluir um controlo positivo, por exemplo, um plasmídeo expressando GFP ou uma proteína de membrana fundido a GFP e conhecida por expressar um vector vazio de controlo negativo. <ol><li> Descongelar o aliquotted E. coli em gelo. Adicionar 3 mL de preparado de mini-plasmídeo de expressão para cada alíquota de células competentes. </li><li> Incubar a mistura em gelo durante 30 min. </li><li> De choque térmico das células durante 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Permitir que as células recuperar em gelo durante 2 min e, em seguida, adicionar 300 mL de caldo de energia a cada tubo. </li><li> Incubar durante 1 h num incubador estático 37 ° C. </li><li> Prepare o agar LB numa placa de 24 poços de cultura de tecidos, suplementado com 50 ug / ml de carbenicilina e 35 ug / ml de cloranfenicol. Adicionar ramnose a uma concentração final de 0,25 mM para os poços que contêm Lemo21 (DE3). Nota: Se o produto é susceptível de ser tóxico aos poços contendo C41 (DE3) pLysS pode ser suplementado com 1% (w / v) de glucose. </li><li> Transferir 30 uL de células a partir da mistura de transformação em placas LB de agar. Espalhe e secar a placa conforme descrito no 1,13-1,15. </li></ol> 3. Preparação de fermentos Overnight Nota: Sempre preparar culturas durante a noite do dia depois de transformação nunca de uma placa de transformação de idade. <ol><li> Adicionar 0,7 ml de caldo de potência para cada poço de um de 96 poços de poços profundos placa suplementado com 50 ug / ml de carbenicilina e 35 ug / ml de cloranfenicol. Adicionar ramnose aos poços contendo Lemo21 (DE3) para uma concentração final de 0,25 mM. Opcionalmente, complementar C41 (DE3) pLysS com 1% (w / v) de glucose; veja acima (2.6 nota). </li><li> Escolha uma colônia a partir das placas de transformação durante a noite para cada poço. Selar o bloco com um selo de gás-permeáveis. </li><li> Agitar o bloco a 250 rpm numa incubadora com uma grande arremesso (por exemplo, uma órbita de 25 mm) ou a 600 rpm numa incubadora com uma pequena arremesso (por exemplo, uma órbita 4,3 milímetros) a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 4. Crescimento e Indução de Culturas <ol><li> Adicionar 3 ml de caldo de poder suplementado com 50 ug / ml de carbenicilina e 35 ug / ml de cloranfenicol a cada well de 24 poços de poço profundo prato. Adicionar L-ramnose (e glicose), conforme descrito na seção 3.1. Use 3 ml de cultura para permitir a colheita em duplicado e de permitir uma evaporação de água através da vedação permeável ao gás. </li><li> Defina-se as culturas de expressão por adição de 150 ul de Lemo21 (DE3) ou C41 (DE3) pLysS de culturas durante a noite a cada poço de os blocos de 24 poços profundos poços. </li><li> Agitar os blocos a 37 ° C até a densidade óptica média a 595 nm é de aproximadamente 0,5 através da placa. </li><li> Induzir a expressão pela adição de IPTG para as culturas para uma concentração final de IPTG 1,0 mM. </li><li> Crescer as culturas durante a noite (18-20 h) com agitação a 20 ° C. </li></ol> 5. Análise da Expressão In-gel Fluorescência <ol><li> Colheita em duplicado. Transferir 1 ml da cultura de cada poço em uma praça bem, fundo cônico, de 96 poços bloco de poço profundo. Nota: Colheita em duplicado no caso de quebra do bloco ou para permitir o ensaio de um alternative detergente se desejado. </li><li> Selar os blocos e colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min. </li><li> Inverta o bloco e decantar a mídia. Toque no bloco cuidado sobre uma toalha de papel para escorrer mídia restantes. </li><li> Selar as placas e armazenar a -80 ° C por um período mínimo de 20 min. Opcionalmente, deixar a experiência a este ponto e o bloco processado quando conveniente. </li><li> De-Frost as pelotas por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Usar uma pipeta ou multi-canal ou num agitador orbital (1000 rpm durante 10 min) a 4 ° C para voltar a suspender as células completamente em 200 ul de tampão de lise (50 mM de NaH 2 PO 4, 300 mM de NaCl 10 mM de imidazole a 1% v / v de Tween 20, ajustar o pH para 8,0 utilizando NaOH). </li><li> Adicionar 20 ul da solução DLPI (20 ul ADNasel (4000 unidades / ml), 20 mg de lisozima e 20 ul cocktail inibidor de protease num volume final de 2 ml de água). Incubar durante 10 min com agitação (~ 1000 rpm) a 4 ° C. </li><li&gt; Adicionar 25 ul de 10% de n-dodecil β-D-maltósido (DDM). </li><li> Incubar durante 60 min com agitação (~ 1000 rpm) a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o bloco de poços profundos a 6,000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Transferir 10 uL do ligado clarificado para uma placa de microtitulação e adicionar 10 ul de tampão de carga de gel SDS-PAGE (Tris 100 mM, pH 6,8, 4% w / v de SDS, 0,2% w / v de azul de bromofenol, 10% v / v β mercaptoetanol, e 20% v / v de glicerol). CUIDADO! Não ferver DA AMOSTRA. </li><li> Carga de 10 ml de amostra a partir da etapa 5.11 / reproduzirem bem a SDS gel (s) PAGE e executar a 100-120 V (tensão constante) em câmara fria até a frente de corante atinge a parte inferior (2-2,5 hr). </li><li> Colocar o gel para um gerador de imagens (por exemplo, com um filtro de luz azul para detectar as proteínas de fusão GFP). O tempo de exposição é escolhido para assegurar que as bandas brilhantes não são saturados. </li></ol> 6. Aumento de escala de culturas de células <ol><li> Transformar uma alíquota de competente <em&gt; E. coli como descrito na seção 2. </li><li> Escolha uma colônia em 10 ml de caldo de energia (complementados conforme descrito na seção 3) e crescer durante a noite a 37 ° C. </li><li> Dilui-se 5 ml da cultura durante a noite em 500 ml de caldo de potência. </li><li> Crescer com agitação a 250 rpm a 37 ° C até a densidade óptica a 595 nm é de ~ 0,5. </li><li> Induzir a expressão pela adição de IPTG até a uma concentração final de 1,0 mM. </li><li> Crescer durante a noite com agitação a 250 rpm a 20 ° C. </li><li> Células colheita por centrifugação a 5000 xg durante 15 min. </li><li> Sobrenadante Descartar. Os sedimentos celulares podem ser armazenadas a -80 ° C. </li></ol> 7. Preparação de Membranas <ol><li> Descongelar as células (quando necessário), à temperatura ambiente e ressuspender em 1x PBS pH 7,5 a um volume de 5 mL por grama de sedimento de células; Aumentar o volume que for necessário até viscosidade reduz a uma consistência escorrendo. Adicionar MgCl2 para uma concentração final de 1 mM, ADNase I a uma concentração final de 10 ug / ml e umapré-embalado de inibidor de protease comprimido por 20 g de sedimento celular. Quebrar células abertas utilizando um disruptor de células gelada a uma pressão de 30 kpsi. </li><li> Sedimentar as células intactas e os detritos a 30.000 g durante 15 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo de ultracentrifugação. </li><li> Recolher a fracção de membrana total por centrifugação do sobrenadante para baixo de um ultra-centrifugar a 200.000 xg durante 1 h a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender o pellet membrana no geladas 10 ml PBS pH 7,5 utilizando um homogeneizador celular. 1 ml de membranas ressuspensas são necessários para cada detergente. Opcionalmente, nesta fase, flash congelar a suspensão de membranas em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 8. A solubilização e Análise da fração de membrana <ol><li> Descongelar fracção de membrana (se necessário), e para cada um detergente para ser utilizado para a solubilização, alíquotas de 900 ul da suspensão de membranas para um 1,5 ml de polialómero micro-centrifutubo de ge. </li><li> Adicionam-se 100 ul de cada detergente preparada de fresco (10% w / v de soluções DDM, DM, Cymal-6 e LDAO) para uma concentração final de 1% para o tubo especificado 1,5 ml. Para a solubilização de proteínas de membrana eucariótica hemissuccinato de colesterol (0,2% concentração final) podem ser adicionados aos detergentes. </li><li> Incubar as misturas a 4 ° C durante 1 hora com agitação suave. </li><li> Peletizar a fracção insolúvel em detergente com uma bancada de ultra-centrifugação, assegurando tubos são pelo menos semi-cheia, a 150000 g a 4 ° C durante 45 min e reter sobrenadante. Nota: A eficácia do detergente de solubilização pode ser estimada utilizando um leitor de placas fluorescente através da medição da fluorescência de GFP das membranas solubilizadas com a fracção insolúvel em detergente ressuspensas no mesmo volume de PBS. </li><li> Analisar o mono-dispersibilidade do detergente diferente: complexos de proteínas de membrana, utilizando cromatografia de exclusão de tamanho detectado por fluorescência (FSEC). </li><li> Para a análise FSEC, equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho com uma gama ampla de fraccionamento, por exemplo 5.000 a 5.000.000 de peso molecular, com tampão de corrida (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,03% de DDM) a um caudal de 0,3 ml / min . Utilize este tampão para todas as amostras, ou seja, ele não é alterado para cada detergente testado. </li><li> Injectar 100 ul de membranas solubilizadas na coluna a uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min. Monitorar perfil de eluição usando óptica de fluorescência (excitação a 488 nm e emissão a 512 nm). Se um monitor em linha de fluorescência não está disponível, recolher as fracções e ler a fluorescência em um leitor de placas. </li><li> Import volume de eluição e os dados de intensidade de fluorescência em um programa de planilha para exibição gráfica. </li><li> Analisar restante material da membrana solubilizado por fluorescência in-gel conforme descrito no capítulo 5. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

No protocolo descrito neste artigo, a clonagem independente de ligação num vector repórter GFP é combinada com detecção de fluorescência para rastrear rapidamente a expressão relativa de várias proteínas da membrana em E. coli. Vetores pode ser feita em quatro dias de trabalho com triagem expressão primária dar mais um semana. In-gel de fluorescência de lisados ​​detergentes de células inteiras é usado para classificar expressão bate para posterior análise em uma tela secundária. O ecrã primário expressão como apresentado não requer qualquer equipamento especializado para além de um incubador agitador adequado para células crescendo em blocos de poços profundos. Todas as outras manipulações, líquido que envolve placas de 96 poços SBS pode ser levada a cabo usando pipetas multicanal. O protocolo pode ser facilmente modificado para incluir outras estirpes de E. coli cultivadas sob diferentes condições de expressão (por exemplo, temperatura mais baixa). No caso de o LEMO21 (DE3) titulando o nível de ramnose (de 0 a 2,0 mM)adicionado para modular a taxa de transcrição pode aumentar o nível de expressão de algumas proteínas da membrana 7. Excepto DDM detergentes pode ser utilizado para a extracção no ecrã primário embora detergentes mais severas podem solubilizar proteínas de corpos de inclusão e, por conseguinte, dar falsos positivos. Claramente, quanto mais elaborada da primeira tela se torna, mais o experimento demorado. O ecrã secundário envolve a preparação de uma fracção de membranas totais a partir dos sucessos de expressão identificados no rastreio primário. Este é um passo crítico uma vez que irá confirmar a localização das proteínas de fusão com a membrana da E. células de E. coli. Extracção subsequente da proteína de fusão de GFP em diferentes detergentes é monitorizado por cromatografia de exclusão de tamanho detectado por fluorescência de material solubilizado para avaliar o mono-dispersividade dos complexos detergente-proteína. Este é mais um passo crítico, uma vez que identifica o detergente mais adequado parasolubilização da proteína de membrana para o processamento subsequente a jusante. No entanto, a experiência mostra que uma maior optimização da escolha do detergente (s) ainda pode ser necessário durante a purificação e cristalização. Evidência de comportamento uniforme em diferentes detergentes, incluindo aqueles com um tamanho de micelas relativamente pequenas (por exemplo, LDAO) parece ser um bom indicador da tendência para formar cristais bem diffracting, pelo menos, para as proteínas de membrana procariotas 14. A este respeito, o perfil mostrado para a proteína de membrana na Figura 2B parece altamente favorável. A principal vantagem da utilização de um repórter GFP é que dá uma rápida leitura de expressão em amostras purificadas por un. Uma desvantagem é que a proteína de fusão de GFP tem que ser removidos durante a purificação da proteína por cristalização. No caso dos vectores utilizados aqui, um sítio de protease 3C de rinovírus permite a clivagem da GFP. Em alternativa, é simplesre clone de proteínas candidatos, identificados na tela, em vetores que só adicionar um polihistidina ou outra marca de afinidade para a purificação subseqüente. Isso pressupõe que a fusão de GFP não é necessária para a expressão. A principal alternativa para a utilização da fusão para GFP para a detecção de expressão de proteína de membrana e a solubilização é adicionar apenas um marcador de histidina. No entanto, esta abordagem requer tipicamente a partir de uma fracção de membrana 15, que para a avaliação de diversas variantes iria tornar-se muito demorado. Em resumo, o objectivo principal do protocolo descrito neste artigo é permitir que um grande número de variantes de sequência da proteína de membrana a ser avaliada rapidamente em termos de expressão e detergente de solubilização e priorizados para análise mais profunda.

Estimou-se que as proteínas de membrana são responsáveis ​​por cerca de 20-30% dos genes codificados em todos os genomas sequenciados 1, incluindo o genoma humano 2. Dado o papel crucial em muitos processos biológicos, por exemplo, o transporte de metabolitos, a geração de energia e como alvos para fármacos, há um grande interesse na determinação da sua estrutura tridimensional. No entanto em comparação com proteínas solúveis, proteínas de membrana são muito sub-representadas no Protein Data Bank. De fato, dos 99.624 estruturas lançado no PDB ( <a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ) apenas 471 ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) são classificadas como proteínas de membrana. Isso reflete as dificuldades técnicas de se trabalhar com as proteínas da membrana que são naturalmente expressos em níveis relativamente baixos; rodopsina é uma das poucas exceções 3,4. A sobre-expressão da versão recombinantes em células heterólogas muitas vezes resulta em fraca enrolamento incorrecto e direccionamento para a membrana que limita o nível global de produção. Selecionando o melhor detergente para extração e solubilização de uma proteína da membrana uma vez expressou faz purificação posterior difícil e requer otimização cuidadosa. Escherichia coli continua a ser o hospedeiro de expressão mais utilizada para as proteínas de membrana que representam 72% ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) de estruturas resolvido até ao presente que são quase exclusivamente a partir de fontes bacterianas. E. Specific estirpes de E. coli, C41 (DE3) e C43 (DE3), ter sido isolado, que não levam à expressão de proteínas através da membrana e, portanto, evitar os efeitos de toxicidade observados para a outra estirpes BL21 5,6. Ajustando o nível de expressão da proteína de membrana recombinante parece ser crítica para optimizar o nível de produção de 6,7. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Em muitos casos, a produção bem sucedida de proteínas da membrana para a determinação da estrutura foi necessária a avaliação de várias versões incluindo eliminações amino e carboxi-terminais, múltiplos ortólogos de explorar variação de sequência natural e diferentes proteínas de fusão 6-8. Por conseguinte, um método para o rastreio de expressão de múltiplas proteínas de membrana em paralelo é essencial. Uma abordagem é vulgarmente utilizada para fundir a proteína para proteína fluorescente verde (GFP), que permite a expressão a ser rastreado, sem a necessidade de purificar a proteína. Deste modo, a informação sobre o nível de expressão, estabilidade e comportamento em diferentes detergentes pode ser avaliada com pequenas quantidades de material purificado por un 9-12. Neste artigo vamos descrever um protocolo simplificado para clonagem e expressão de triagem de proteínas de membrana em E. coli utilizando fusão de GFP como um repórter de produção e posterior caracterização de detergente: proteína complexes (Figura 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPIN-N-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPINE-3C-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C41(DE3)pLysS</td>
			<td>Lucigen (http://lucigen.com/</td>
			<td>60444-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEMO21(DE3)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2528H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns</td>
			<td>Clontech/Takara</td>
			<td>639688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power broth</td>
			<td>Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)</td>
			<td>MD12-106-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8849</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-&#946;-D-Maltoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM ( n-Dodecyl &#223;-maltoside )</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D97002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM (n-Decyl &#223;-maltoside)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D99003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D71111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>4672030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200&#181;L LTS Spacer</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>LA6-300XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20&#181;L LTS</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-20XLSPLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200&#181;L LTS Tip</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-1200XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well V bottom deep well blocks</td>
			<td>Porvair sciences</td>
			<td>360115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5928</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WG1203BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WR0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibramax 100</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-21200-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tension rollers attachment</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>549-81000-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393253</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs</td>
			<td>Shel Lab&#160;</td>
			<td>SSI5R-HS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova44R incubator</td>
			<td>New Brunswick /Eppendorf</td>
			<td>Innova44R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI)</td>
			<td>Constant systems</td>
			<td>PL083016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli

A produção de proteínas da membrana recombinante para estudos estruturais e funcionais permanece tecnicamente desafiador devido aos baixos níveis de expressão e da instabilidade inerente de muitas proteínas da membrana uma vez solubilizado em detergentes. Um protocolo é descrito que combina ligadura clonagem independente de proteínas de membrana na forma de fusões com expressão de GFP em Escherichia coli detectadas por fluorescência da GFP. Isso permite a construção e expressão de triagem de proteína de membrana múltipla / variantes para identificar candidatos adequados para posterior investimento de tempo e esforço. O repórter da GFP é utilizado em uma tela primária de expressão através da visualização da fluorescência de GFP após electroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). As proteínas da membrana que exibem não só um elevado nível de expressão com degradação mínima, como indicado pela ausência da GFP livre, são seleccionados para um ecrã secundário. Estas construções são escalados e uma fracção total de membrana preparada e solubilizard em quatro detergentes diferentes. Após ultracentrifugação para remover o material insolúvel em detergente, os lisados ​​são analisados ​​por cromatografia de exclusão de tamanho de detecção de fluorescência (FSEC). Monitorização do perfil de exclusão de tamanho por fluorescência da GFP fornece informações sobre o mono-dispersibilidade e integridade das proteínas de membrana em diferentes detergentes. Proteína: combinações de detergentes que eluem com um pico simétrico com pouco ou nenhum acesso GFP e agregação mínimo são candidatos a purificação subseqüente. Utilizando a metodologia acima, a expressão heteróloga em E. coli de SED (forma, alongamento, divisão, e esporulação) proteínas de 47 espécies diferentes de bactérias foi analisada. Estas proteínas normalmente têm dez domínios transmembranares e são essenciais para a divisão celular. Os resultados mostram que a produção dos ortólogos SED em E. coli foi altamente variável em relação aos níveis de expressão e a integridade das proteínas de fusão de GFP. O i experimentodentified um subconjunto para uma investigação mais aprofundada.

A família de proteínas (SEDS forma, alongamento, divisão e esporulação) é essencial para a divisão celular bacteriana. Estas proteínas integrais têm tipicamente dez domínios transmembranares com ambos os terminais amino e carboxi no interior da célula. Para exemplificar o protocolo descrito acima, 47 SED ortólogos foram clonados no vector pOPINE-3C-eGFP. Uma tela de expressão em pequena escala das construções foi realizado em duas estirpes de E .coli, Lemo21 (DE3) foram cultivados na presença de 0,25 mM para bloquear a expressão ramnose gotejante e C41 (DE3) pLysS, que são rotineiramente usadas para a expressão de membrana proteínas 5-8. Detergentes solubilizadas lisados ​​de culturas induzidas foram analisadas por electroforese em SDS-poliacrilamida. Usando fluorescência em gel para visualizar as proteínas de fusão expressas GFP mostrou que entre as duas estirpes 38 dos 47 SED construções foram produzidas. Curiosamente havia diferenças entre as duas cepas de expressão. Dos 38 expressa construções, apenas 18 foram produzidos em ambas as linhagens, sendo 14 apenas expresso em Lemo21 (DE3) e 6 apenas em C41 (DE3) pLysS. No geral, houve uma maior taxa de sucesso para a Lemo21 (DE3) em comparação com o pLysS C41 (DE3) (38 vs 24). No entanto, a observação de que algumas proteínas parece ser específica estirpe significa que a triagem em ambos é útil. Os dados representativos para 24 dos 47 SED construções estão apresentados na Figura 1. A intensidade das bandas dá uma indicação do nível de expressão, por exemplo, a proteína de fusão bem em C4 na Figura 1A e 1B é bem expressa em ambas as estirpes no entanto o adicional bandas de menor peso molecular sugerem que a proteína é parcialmente degradado. Em muitas pistas há uma banda que corresponde em tamanho a GFP sozinha. Uma avaliação qualitativa da integridade da proteína pode ser realizada, olhando para a intensidade da proteína de fusão relativamente à GFP livre;eg G4 e H4 são completamente discriminados ao GFP livre em C41 (DE3) pLysS (Figura 1B), enquanto que no Lemo21 (DE3) há alguma proteína intacta (Figura 1A). Para 14 das 38 proteínas expressas a intensidade da banda de GFP livre é semelhante à da proteína de fusão, por 21 a intensidade da banda de GFP livre é maior do que a da proteína de fusão e uma minoria das proteínas de fusão (3 / 38 expresso) por exemplo, F6 e G6 na Figura 1A tem relativamente pouco GFP livre em comparação com a proteína de fusão. Duas das construções que expressavam bem nos B5 tela principal (bandas de alta intensidade para GFP livre e proteínas de fusão) e G6 (pouco livre GFP) foram expressos e uma fração de membrana total preparado a partir de 500 ml de cultura de células. Membranas ressuspensas foram divididas em alíquotas e analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho detectado por fluorescência (FSEC). Os perfis FSEC são apresentados na Figure 2A e 2B, respectivamente, e mostram que as duas proteínas SED se comportam de maneira diferente nos quatro detergentes testados. Num dos casos (Figura 2A: amostra B5) a proteína só deu um pico simétrico, com pouca agregação em DDM que seria, portanto, o detergente de escolha para a purificação subsequente. Em contraste, a outra proteína de fusão (figura 2B: amostra G6) deu um perfil semelhante em todos os detergentes testados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> Figura 1: Diagrama de fluxo de trabalho para o rastreio de expressão de proteína de membrana em E. coli utilizando um repórter GFP. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> Figura 2: tela primária de expressão da proteína de membrana utilizando fluorescência in-gel. </strong&gt; lisados ​​detergentes de E. coli foram analisadas por SDS-PAGE e géis fotografada usando iluminação azul Epi e um 530/28 filtro. Os resultados são apresentados durante 24 construções marcadas (A4-H6 com base na sua posição em uma placa de 96 poços). São indicadas as posições das bandas de GFP livre e proteínas de fusão de GFP. (A) As proteínas expressas em Lemo21 (DE3). (B) As proteínas expressas em C41 (DE3) pLysS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Ecrã secundário da expressão da proteína de membrana utilizando cromatografia de exclusão de tamanho detectado por fluorescência (FSEC) Total de fracções de membrana foram extraídos em quatro detergentes diferentes e as proteínas de membrana solubilizadas analisada por cromatografia de exclusão de tamanho utilizando um sistema de FPLC acoplado a um detector de fluorescência. Perfis FSEC para (A) B5 proteína da membrana e (B) </strong&gt; G6 proteína de membrana. A posição dos picos correspondentes a proteína agregada, solubilizado proteína de fusão de GFP e GFP livre são indicados. Os detergentes testados são indicados abaixo dos perfis.

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Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Uma abordagem simplificada para a triagem para a expressão de proteínas de membrana recombinantes em Escherichia coli com base na fusão de proteína fluorescente verde é apresentada.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

green-fluorescent-protein-based-expression-screening-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

32.6K visualizações.  Research Complex at Harwell.  Uma abordagem simplificada para a triagem para a expressão de proteínas de membrana recombinantes em Escherichia coli com base na fusão de proteína fluorescente verde é apresentada. 

Vídeo: Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolos para implementação de uma<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Detecção de Vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em

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