The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

1. Elaboración de Instrumentos, Sustratos, Medios de Cultivo y platos <ol><li> Manejo de nitruro de silicio (Si 3 N 4) ventanas. <ol><li> Abrir la cápsula ligeramente apretando un extremo que contiene la ventana de una manera tal como para no apretar la propia ventana, mientras gira el otro extremo de la cápsula con la otra mano. </li><li> Echa un par de reversa, pinzas de punta fina bajo microscopio estereoscópico para asegurarse de que no hay adhesivas, lagunas o dobleces en la punta. De lo contrario, las ventanas se pueden romper por las pinzas o vuelan fuera de ellos durante las etapas posteriores. </li><li> Retire la ventana de la cápsula sujetando cuidadosamente el marco de la ventana con pinzas, mientras que apretando suavemente la cápsula cerca del extremo abierto la aplicación de presión en una dirección para hacer que la cápsula más amplio donde los bordes de la ventana necesitan para salir. </li></ol></li><li> Ventana de pre-lavado (opcional). <ol><li> Si lo desea, ventanas pre-lavado por inmersión suavementeen agua destilada durante 5 segundos, seguido por 2 min de lavado en etanol al 70% y 2 min de lavado en etanol al 100%. </li></ol></li><li> Colocación y esterilización de las ventanas en la placa de cultivo. <ol><li> Para colocar las ventanas, configurar la ventana con el lado plano hacia arriba en la parte inferior de la placa de cultivo, coloque un pedazo de cinta adhesiva en un portaobjetos de vidrio limpio. Corte sobre una tira cuarto de pulgada por el lado largo de la cinta. Tome un trozo de cinta adhesiva de la parte corta (en ⅛ &quot;por ¾&quot;) con una hoja de afeitar limpia. </li><li> Use pinzas para aplicar la rebanada de cinta hasta el borde de la red o ventana. Use suficiente para adherirse firmemente que sin cubrir la misma abertura de la ventana. La manipulación de la cinta adherida con pinzas, configurar la ventana hacia abajo sobre la parte inferior de la placa de cultivo. Utilice la punta de las pinzas para adherir la cinta a la parte inferior de la placa de cultivo con firmeza. </li><li> Aplique otra tira de cinta hasta el otro borde y se adhieren a la parte inferior esta firmemente con la punta de las pinzas. </li><li> Una vez que todas las ventanas songrabada, esterilizar ventanas en placas de cultivo con luz ultravioleta (UV). Lograr esto colocando el plato bajo la lámpara UV en una campana de flujo laminar durante aproximadamente 1 hora. </li><li> (Opcional) Si las ventanas son para ser pre-recubiertos con poli-lisina, hacerlo siguiendo ventana esterilización. Escudo de la ventana con 10 l de solución estéril lisina poli-L-0.01% durante 1 hora en una incubadora a 37 °, y luego enjuague la solución restante con los medios de cultivo. </li></ol></li><li> Preparar tampones para lavado final antes XFM. <ol><li> Preparar ya sea una Tris-glucosa o piperazina N, N &#39;bis (ácido etanosulfónico) (tuberías) -sacarosa tampón libre de cualquier metales traza con la osmolalidad y pH equivalente a tampón fosfato salino de Dulbecco (D-PBS) sin calcio y magnesio. Utilice uno de estos tampones para enjuagar las células después de las células se fijan químicamente. <ol><li> Para hacer la solución de Tris-glucosa (10 mM Tris, 260 mM de glucosa, ácido acético 9 mM,) añadir 1,4 g de glucosa, 36 mg de base Tris y16 l de ácido acético a 20 ml de agua ultrapura. Luego, ajustar el volumen final a 30 ml con agua ultrapura. No es necesario ajustar el pH. Guarde a temperatura ambiente hasta por una semana. </li><li> Para hacer que los tubos de sacarosa (TUBOS 20 mM, sacarosa 200 mM) añaden 0,18 g de tuberías y 2,0 g de sacarosa a 20 ml de agua ultrapura y ajustar el pH a 7,4 con pequeñas cantidades de ácido acético concentrado. Luego, ajustar el volumen final a 30 ml con agua ultrapura. Guarde a temperatura ambiente hasta por una semana. NOTA: La razón para evitar el uso de PBS en el enjuague final es que las concentraciones de fosfato, cloruro y potasio en PBS son tan alta que puede interferir con XFM si no se elimina por completo antes de secado al aire. </li></ol></li></ol></li><li> Preparar tampones para chapado celular. <ol><li> Preparar o llevar a cabo todos los medios de comunicación, como medio RPMI 1640, 1x solución de tripsina-EDTA, D-PBS, y cualquier otro reactivo que sean necesarios para la línea de células adherentes especialmente en lo que normalmente se hace para pasar las células adherentes of interés, y calentar a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Chapado de células <ol><li> Para el plato de cultivo esterilizado que contiene las ventanas, en la campana de flujo laminar, agregar suavemente medios de comunicación (10 ml para una placa de cultivo de 100 mm), a lo largo del lado de la placa de cultivo con ella inclinada en un ángulo. Evitar la creación de la tensión superficial innecesarios o dejar caer los medios de comunicación directamente sobre la superficie de las ventanas de nitruro de silicio. A medida que se añadió medio, aliviar lentamente el ángulo de inclinación para recubrir la rejilla y ventana con medios de comunicación. </li><li> Preparar la línea de células adherentes de interés apropiada, trypsinizing o raspar las células fuera de las placas como de costumbre para pases la línea celular. Realizar cualquier recuento celular, u otra preparación necesaria antes de la aplicación de las células a la placa fresca. </li><li> Añadir células a la placa de cultivo con ventanas a una densidad celular que se necesita para alcanzar típicamente 50% -70% de confluencia el plazo de 24-72 hr, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con dióxido de carbono al 5%. </li&gt; <li> Observar el crecimiento de las células de vez en cuando, utilizando un microscopio de luz invertida, hasta que la densidad celular deseada (normalmente 50% -70% de confluencia) se alcanza. </li></ol> 3. Fijación de las células <ol><li> Preparar fresco paraformaldehído al 4% en D-PBS por dilución de una acción comprado (por ejemplo, 25% de paraformaldehído) y ajustando el pH a 7,4 con ácido acético (para evitar la adición de exceso de sodio a la muestra). </li><li> Cuando las células se han cultivado como se desee, y las manchas vitales (como Hoescht) se han aplicado y fotografiado, retire los medios por aspiración suave, inclinando el plato en un ángulo de 45 ° con una mano, y la aspiración con una pipeta mano con la otra . NOTA: En lugar de los medios de pipeteado invertido, una alternativa es escoger la ventana de arriba, sumerja la ventana en tubos de microcentrífuga con D-PBS dos veces y luego se coloca en un nuevo recipiente de cultivo con las soluciones para la adherencia durante 20 minutos seguido de 2 tiempos de lavado PBS para eliminar los fijadores residuales. Si se elige, vaya dircesados ​​directamente al paso 3.5. </li><li> Enjuague el plato suavemente con D-PBS y reemplazar el líquido eliminado inmediatamente por la adición suavemente la fresca 4% PFA / PBS mientras se mantiene el plato en un ángulo de 45 °, el pipeteo hacia el lado del plato, y lentamente se relaja el ángulo de inclinación para permitir la solución de fijación para cubrir las ventanas. Mantener las células cubiertas con el fijador durante 20 min a RT. </li><li> Retire el líquido por aspiración suave, de nuevo como antes, inclinando el plato ligeramente y aspirar a mano. </li><li> Reemplace el líquido eliminado añadiendo suavemente algunos de los tubos / Solución de sacarosa, utilizando el método de inclinación y pipeteo describe en el Paso 3.3. </li><li> Repita los pasos 3.4 y 3.5. </li><li> Preparar los materiales para el secado. <ol><li> Reúna toallas sin pelusa como Kimwipes, y tirar uno fuera de la caja por lo que es muy útil muy rápido y fácil. </li><li> Prepare un lugar limpio, no el nivel para ajustar la ventana que se seque. Establecer una estera de rejilla de caucho del tipo de los utilizados en microscopía electrónica, que tiene crestas tanla ventana puede ser apoyado en un extremo mientras se seca. Esto evitará que la ventana se queden atascados en la superficie de secado cuando se seca, y drenar el buffer restante hasta el borde de la muestra. </li></ol></li><li> Tweeze cuidado la cinta conectado a la ventana para celebrar la ventana hacia arriba fuera del líquido. Recuperar ventanas que se desprenden de la cinta mediante la aplicación de una pequeña cantidad de TUBOS / sacarosa para conseguir que flotan y luego recogerlos con las pinzas inversa. </li><li> Con cuidado (sin tocar la propia ventana) ya fondo embadurnar cualquier TUBOS exceso / sacarosa desde el borde de la ventana con un Kimwipe. También embadurnar la parte posterior área de sangría utilizando un pliegue redondeado de un Kimwipe. NOTA: El objetivo es tener tan poco cristalización de sales o tampones en la superficie de la ventana como sea posible. </li><li> Coloque la ventana sobre la estera de rejilla. Asegúrese de que la ventana no está plano en la estera de rejilla, pero apoyado en un borde (usando las crestas de la estera de rejilla) y tocar el menor de la cuadrículamat posible. Deje la ventana seco. </li></ol> 4. Montaje de la muestra e Imagen <ol><li> Una vez que la muestra se ha secado, verificar la presencia de células en las ventanas utilizando un microscopio de luz. Lleve a cabo esta verificación, antes de preparar las muestras para su transporte a un sincrotrón. </li><li> Paquete de las ventanas para el transporte de la línea de luz de sincrotrón de alojamiento de su experimento. Colocar suavemente las ventanas con cinta en dos lados a un portaobjetos de vidrio, a continuación, colocar el portaobjetos de vidrio con cinta a la parte inferior de una placa Petri de plástico. Pegue el plato de Petri cerrada. NOTA: Antes de este punto, estos pasos pueden llevarse a cabo en cualquier laboratorio típico. Los siguientes pasos mejor se haría en una línea de luz de sincrotrón. </li><li> Retire la cinta de la ventana con cuidado con unas pinzas. Utilice esmalte de uñas, en una capa fina, incluso a lo largo del borde de la ventana, para asegurar las ventanas a un soporte de aluminio proporcionado por los colaboradores línea de luz en el sincrotrón. </li><li> Inserte el soporte de aluminio enuna cinemática de montaje, y luego se coloca en su posición en el microscopio de rayos X. Montar la muestra en un soporte de conectarlo a etapas motorizados, dentro de la cámara de muestra en la línea de luz. </li><li> Después de salir del área de rayos X instrumento microscopio muestra (una jaula hecha de paredes de plomo llena), la configuración de la exploración. Usando software de línea de luz específica, elegir el área apropiada de la muestra a analizar, mientras se visualiza la posición del haz de rayos X sobre la muestra utilizando una cámara equipada con un vídeo en forma de cruz y pre-alineada con una cámara de centelleo aguas abajo. </li><li> Elige la resolución adecuada para la muestra, basándose en una estimación del tamaño de la característica más pequeña de interés. Para imágenes de células de mamíferos individuales (~ 20 a 40 micras de tamaño), utilice una resolución de 0,25 hasta 0,5 micras. Para las áreas de tejidos de imágenes, y distinguir las capas de células entre sí, utilice una resolución de 2.20 micras. </li><li> Elige el tiempo de permanencia apropiado para la muestra, basándose en una estimación de la cantidad de The Metal de interés presente. Para una exploración rápida visión, o si grandes cantidades de metales están presentes, use exploraciones mosca con tiempos de permanencia de 30 a 300 ms por píxel. Si poco material está presente, o para medir metales de baja abundancia relativa, utilizar exploraciones paso con tiempos de permanencia de 1-2 seg por píxel. </li><li> Programar las exploraciones en el software de la línea de luz específica. Adquirir una imagen de trama de exploración. Trabajar en conjunto con los colaboradores línea de luz para analizar los datos con el software que identificarán los picos de energía característicos para cada elemento. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Imágenes de fluorescencia de rayos X es útil en muchos campos, incluyendo las geociencias, ciencias de los materiales y la biología química 26-34. Los avances en los rayos X de sincrotrón, y su centrado, han producido vigas de muy alta intensidad. Enfocado de rayos X vigas suficiente para excitar los metales endógenos en las células existen ahora, la producción de la señal que se puede medir con la tecnología disponible actualmente detector de deriva de silicio. Y el estudio de la biología química...

De rayos X de imágenes de fluorescencia permite tanto la identidad y cantidad de los elementos presentes en una muestra a ser resuelto espacialmente. Los rayos X incidente, de una energía seleccionado para ser mayor que la energía del elemento más pesado de interés de unión de electrones, superar la energía de enlace de los electrones del centro de la concha al núcleo 1. Esto crea un &quot;agujero&quot; en la capa de electrones. Como los electrones de mayor energía caen en estos agujeros, rayos X fluorescentes se emiten cuya longitud de onda depende de la separación de energía de esos orbitales. Desde el espaciado de energía de los orbitales es característica de un elemento dado, la emisión de fluorescencia de rayos X también tiene longitudes de onda características, dependiendo del elemento. Es esta emisión a una longitud de onda característica que permite la identificación de los elementos presentes. La calibración de la intensidad de fluorescencia permite la cuantificación de los elementos presentes. De rayos X microscópicas de fluorescenciay (XFM) se ha convertido cada vez más utilizado, en parte por el desarrollo de fuentes de sincrotrón de rayos X muy brillantes, como los que en primavera-8 en Japón, la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Francia, y el Advanced Photon Source ( APS) en los EE.UU. 2. Estas fuentes proporcionan haces de rayos X de muy alta intensidad. Al mismo tiempo, las mejoras en la óptica de rayos X, tales como la tecnología de placa de zona, permite la concentración de estos haces a manchas sub-micras, aunque bastante ineficiente 3. Con vigas de muy alta intensidad, incluso una relativamente pequeña cantidad de luz que puede enfocarse es suficiente para excitar los metales endógenos en las células, la producción de la señal que se puede medir con la tecnología de detectores actualmente disponibles. Por lo tanto, el estudio de la biología química de metales en la célula es una aplicación en particular, que hace uso de muchos de los acontecimientos recientes en esta técnica 4-10. Hay muchos factores críticos a tener en cuenta mientras Appacostado XFM para investigar la distribución elemental y cuantificación de células de mamífero cultivadas o de otras muestras biológicas. En primer lugar, la muestra debe mantenerse intacta, tanto estructuralmente como con respecto a su composición elemental, para que la medición sea significativa. En segundo lugar, la muestra también se debe preservar de alguna manera para que sea resistente a los daños de radiación que puede ser causado por un haz de rayos X enfocada. Una manera en que una muestra puede cumplir ambos criterios a la vez se va a congelar rápidamente en una vítreo, hielo amorfo 11,12. La congelación rápida se logra a menudo a través de diversas técnicas de criopreservación como la congelación de inmersión o de alta presión congelación 13-16. Es generalmente aceptado que la criopreservación conserva la arquitectura celular general y composiciones químicas en muestras biológicas tan cerca de estado nativo como sea posible. La fijación química, por otro lado, debido a la penetración lenta y selectiva de fijadores en células y tejidos como well cambios posteriores como en la permeabilidad de la membrana, pueden permitir varios iones celulares especialmente los iones difusibles, tales como Cl, Ca y K para ser lixiviado, perdidos o reubicados, haciendo así la investigación de estos elementos subóptimas 17-19. A pesar de la clara ventaja de la crio-fijación sobre la fijación química en general, para células de mamífero adherentes, en particular, la criopreservación tiene varias limitaciones 20-23. La más obvia es que no todos los laboratorios de investigación tiene fácil acceso a los instrumentos de criopreservación. La mayoría de los congeladores de alta presión actuales o incluso sumergen congeladores son costosos y propiedad solamente por un subconjunto de las instalaciones criogénicas, que puede ser muy lejos de donde se incuban las células. El beneficio de la criopreservación podría ser objeto de comercio para la desventaja de estrés del viaje colocado en las células. Así, mientras que la crioconservación es sin duda la forma más rigurosa para preservar muestras para el análisis de fluorescencia de rayos X, ciertamente no es el más accesible a todos los investigadores en todas las circunstancias;ni tampoco es siempre esencial - si los metales de interés están estrechamente vinculados a las macromoléculas que se pueden fijar, y la resolución en la que se tomó imágenes de la muestra es mayor que el daño a la ultra-microestructura que pudiera ocurrir durante el secado. Consciente de las advertencias 24, fijación química y secado pueden ser una buena opción. Otros factores en el éxito de rayos X experimento de imágenes de fluorescencia incluyen un análisis adecuado. Imágenes de fluorescencia de rayos X es fundamentalmente de rayos X espectroscopia de emisión de fluorescencia combinado con la trama de exploración para proporcionar la resolución espacial. Los espectros de emisión de fluorescencia de rayos X recogidos contienen una combinación de la superposición de picos de emisión, los antecedentes y los picos de dispersión elástica e inelástica del haz incidente. Software que permite la de-convolución de estas aportaciones y en el acondicionamiento de los picos de emisión, ha sido un desarrollo crítico a este campo 25. También, el desarrollo y la dist comercialribution de normas de capa fina de composición conocida, que se utiliza para calibrar la intensidad de fluorescencia relativa a la cantidad de material, también ha sido muy importante. Este protocolo proporciona una descripción de la preparación de células adherentes por la fijación química y secado al aire. Un paso vital en este proceso es el crecimiento de las células en las ventanas de nitruro de silicio, que a menudo no se adhieren bien, hacer un enjuague suave en una clave de la moda en particular para el éxito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">silicon nitride windows</td>
			<td style="width:423px;">Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.&#160; Thickness 500 nm.&#160; Frame size: 5 mm x 5 mm.&#160; Frame thickness: 200 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">reverse tweezers</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">78520-5X</td>
			<td style="width:167px;">EMS 5X, NC &#8211; Ultra Fine Tweezers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">rubber grid mat</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">71170</td>
			<td style="width:167px;">Round Grid Mat</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">acetic acid</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">338826</td>
			<td style="width:167px;">trace metals grade concentrated acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PIPES buffer</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:167px;">solid PIPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">formaldehyde stock solution</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">RT 17113</td>
			<td style="width:167px;">10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

La capacidad de formación de imágenes de fluorescencia de rayos X para proporcionar información sobre muestras biológicas es contingente sobre estas muestras se preparan de una manera tal que son robustos a daño de la radiación en la escala de tiempo del experimento, y sin embargo, su composición química y sus características estructurales son bien preservado. En ver el resultado de una muestra que ha sido preparado como se describe anteriormente y la imagen, es posible ver que existe una variación en los elem...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K vistas.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Investigación

Química

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

Difracción de polvo de rayos X en Ciencias de la Conservación: Hacia rutina de determinación de estructura cristalina de los productos de corrosión de objetos de arte del patrimonio

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

Cuantificar datos de fluorescencia de rayos x usando mapas

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for the purpose of biophysical characterization, and measure substrate transfer between periplasmic and cytoplasmic compartments. By carefully limiting the time that the periplasm is separated from the cytoplasm, the experimenter can extract the protein of interest and assay each compartment individually for substrate without carry-over contamination between compartments. The extracted protein from fractionation can then be further analyzed for three-dimensional structure determination or substrate-binding profiles. Alternatively, this method can be performed after incubation with a radiotracer to determine total percent uptake, as well as distribution of the tracer (and hence metal transport) across different bacterial compartments. Experimentation with a radiotracer can help differentiate between a physiological substrate and artefactual substrate, such as those caused by mismetallation.
X-ray fluorescence can be used to discover the presence or absence of metal incorporation in a sample, as well as measure changes that may occur in metal incorporation as a product of growth conditions, purification conditions, and/or crystallization conditions. X-ray fluorescence also provides a relative measure of abundance for each metal, which can be used to determine the best metal energy absorption peak to use for anomalous X-ray scattering data collection. Radiometal uptake can be used as a method to validate the physiological nature of a substrate detected by X-ray fluorescence, as well as support the discovery of novel substrates.

A protocol for the extraction of a periplasmic transition metal chaperone in the context of its native binding partners, and biophysical characterization of its substrate contents by X-ray fluorescence and radiometal uptake is presented.

Absorción de Metal esencial en bacterias Gram-negativas: rayos x de fluorescencia, radioisótopos y fraccionamiento de la célula

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid based on volatile solar and wind sources. The pressing demand of developing high-performance electrochemical energy storage solutions, i.e., batteries, relies on both fundamental understanding and practical developments from both the academy and industry. The formidable challenge of developing successful battery technology stems from the different requirements for different energy-storage applications. Energy density, power, stability, safety, and cost parameters all have to be balanced in batteries to meet the requirements of different applications. Therefore, multiple battery technologies based on different materials and mechanisms need to be developed and optimized. Incisive tools that could directly probe the chemical reactions in various battery materials are becoming critical to advance the field beyond its conventional trial-and-error approach. Here, we present detailed protocols for soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS), soft X-ray emission spectroscopy (sXES), and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) experiments, which are inherently elemental-sensitive probes of the transition-metal 3d and anion 2p states in battery compounds. We provide the details on the experimental techniques and demonstrations revealing the key chemical states in battery materials through these soft X-ray spectroscopy techniques.

Here, we present a protocol for typical experiments of soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS) and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) with applications in battery material studies.

Detección sensible al elemental de la química en las baterías a través de espectroscopia de absorción de rayos x blandos y dispersión inelástica resonante de la radiografía

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Mediada por el ligando de la nucleación y crecimiento de nanopartículas de Metal de paladio

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Mejora de extrusión de alta viscosidad de microcristales para Cristalografía de femtosegundo Serial tiempo resuelto en láseres de rayos x

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...