This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1. Generalidades de células endoteliales Cultura <ol><li> Células endoteliales aórticas bovinas Cultura (pasajes 4-9) en matraces de cultivo de tejido recubiertos de gelatina (capa de superficie de cultivo de tejidos con 0,1% w / v de gelatina en PBS a temperatura ambiente durante 15 min) en EGM-2 medios de comunicación (con la bala EGM-2 kit que contiene suero bovino fetal al 5%, factores de crecimiento y todos los suplementos proporcionadas por el fabricante, a excepción de hidrocortisona). </li><li> Cuando las células son casi confluente (ca. 3 días después de la siembra después de un 1: split 4), las células de la cosecha mediante el tratamiento con 0,05% w / v de tripsina / 0,02% w / v EDTA en PBS a 37 ° C. Después de la mayoría de las células se han desprendido, añadir completas EGM-2 medios para inactivar la tripsina y después de centrifugación (100 xg, 5 min). </li><li> Preparar las células para estudios sobre la adherencia de novo de las células endoteliales a la fibronectina (Experimento 1: Sección 2) y la posterior de-adhesión de las células endoteliales con la adhesión establecido en este sustrato (Experimento 2: Sección 3). <ol><li> Lave cosechadocélulas una vez con medio libre de suero que contiene 199 1% w / v de albúmina de suero bovino (BSA) y volver a centrifugar (100 xg, 5 min). </li><li> Vuelva a suspender las células en medio libre de suero 199 conteniendo 1% w / v de BSA en 2,5 x 10 5 células / ml (mediciones de impedancia célula-sustrato) o 5 x 10 5 células / ml (análisis de imágenes de células vivas) y mantener a 37 ° C antes de su uso. NOTA: Las respuestas adhesión de las células son muy sensibles a las diferencias de temperatura (por ejemplo, debido a efectos de convección) para todos los equipos y soluciones utilizados para manejar y tratar las células durante los siguientes protocolos deben mantenerse a una temperatura constante de 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Experimento 1: Cuantificación De Novo adhesión endoteliales celular en nativo y oxidado-MPO fibronectina (Impedancia de la célula-sustrato) NOTA: Experimento 1 examina el grado en el que la oxidación mediada por MPO de la fibronectina perjudica su capacidad para soportar de novo </em&gt; Adhesión de las células endoteliales en suspensión. <ol><li> Fibronectina Escudo en 96 pocillos de células-sustrato arrays de microelectrodos impedancia de oro. Añadir 80 l / pocillo de fibronectina bovina purificada a 5 g / ml en PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C y remover la solución. </li><li> Incubar las superficies recubiertas de fibronectina con MPO para permitir la unión de MPO a la fibronectina unida a la superficie. Añadir 80 l / pocillo de purificado MPO de neutrófilos humanos a 20 nM en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y se incuban durante 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Lave las superficies dos veces con HBSS para eliminar cualquier MPO no unido. </li><li> Añadir H 2 O 2 (0-10 mM concentración final) a los pocillos de la placa de matriz de microelectrodos que contiene 80 l / pocillo HBSS para iniciar MPO catalizada, la oxidación dependiente de fibronectina HOCl y se incuba durante otras 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Para examinar el efecto de los inhibidores o moduladores de reacciones catalizadas-MPO pertinentes (por ejemplo, la enzima alternativa MPOsustratos, inhibidores de la enzima o antioxidantes; ver 9 para más detalles), añadirlos a la HBSS inmediatamente antes de H 2 O 2 adición. </li><li> Después de 0,5 horas, el tratamiento de superficies con metionina para saciar las especies oxidantes residuales de la superficie de éste; es decir, las cloraminas unidos a proteínas reactivas, que pueden ejercer las actividades celulares de confusión. Añadir metionina 10 mM en 80 l HBSS por pocillo e incubar durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Bloquear las superficies con BSA. Añadir 80 l / pocillo de BSA al 0,2% w / v en PBS, incubar durante 2 horas a 37 ° C y remover la solución. NOTA: regiones de la superficie sin recubrimiento residual apoyar la adhesión celular y el bloqueo de estos con una proteína no adhesivo (es decir, BSA) asegura que las respuestas de adhesión celular dependen estrictamente de la célula-matriz adhesiva purificado empleado, en este caso fibronectina. </li><li> Lave las superficies dos veces con HBSS. NOTA: Ninguno de los tratamientos de superficie precedentes afecta apreciablemente readin célula-sustratogs. </li><li> Semilla células endoteliales en suspensión (añadir 200 l / pocillo a aproximadamente 2,5 x 10 5 células / ml, preparado en medio libre de suero 199 que contiene 1% de BSA; ver 1.3) sobre las superficies de fibronectina recubierto nativos u oxidadas-MPO. </li><li> Inmediatamente después de la siembra de células (es decir, antes de cualquier fijación de las células y la difusión), montar la placa matriz de microelectrodos en el puerto de incubadora (alojado en una incubadora a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2). <ol><li> Usando el software del instrumento tomar inmediatamente una &quot;en blanco&quot; para normalizar la lectura de impedancia de la célula-sustrato posterior (&quot;índice de teléfono &#39;) valores a los valores de fondo iniciales obtenidos en ausencia de adhesión celular. </li><li> Iniciar adquisición de datos de índice de células continuas (mínimo de una celda índice de lectura / min). </li></ol></li><li> Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2 horas, un período de tiempo durante el cual la unión de células máxima y la difusión que se consigue; esto se refleja porun estancamiento de los valores del índice de células (ver Figura 3A). NOTA: El experimento anterior (Experimento 1) examina cómo oxidación inicial mediada por MPO de la fibronectina limita la capacidad de las células endoteliales para establecer la adhesión celular en este sustrato. El siguiente experimento (Experimento 2) examina la forma en la oxidación mediada por la fibronectina MPO promueve disminuciones en la adhesión célula-matriz (es decir, de-adhesión) en las células endoteliales con la adhesión establecido en este sustrato. Los tratamientos en estos dos experimentos son esencialmente idénticos, salvo en el momento de la oxidación mediada por MPO fibronectina (es decir, antes de la adhesión celular - Experimento 1; después de la adhesión celular - Experimento 2). </li></ol> 3. Experimento 2: Cuantificación de células endoteliales De-adhesión de fibronectina en respuesta a mediada MPO fibronectina Oxidación (Impedancia de la célula-sustrato y imágenes de células vivas) <ol><li> Fibronectina Escudo en 96 pozos de microelectrodos de oro unrrays para mediciones de impedancia célula-sustrato (añadir 80 l / pocillo de fibronectina a 5 g / ml en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ° C) o 35 mm placas de cultivo celular con fondo de cristal para análisis de imágenes de células vivas (añadir 2 ml / plato de la fibronectina a 5 g / ml en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ° C). </li><li> Bloquear las superficies con BSA. Añadir BSA al 0,2% w / v en PBS a los volúmenes indicados en el punto 3.1 y se incuba durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Incubar las superficies con MPO para permitir la unión de MPO a la fibronectina. Añadir 20 nM purificado MPO humana en HBSS a los volúmenes indicados en el punto 3.1 y se incuba durante 0,5 horas a 37 ° C. </li><li> Lave las superficies dos veces con HBSS para eliminar cualquier MPO no unido. </li><li> Semilla células endoteliales en suspensión (preparados en medio libre de suero que contiene 199 1% w / v BSA; véase 1.3) sobre las superficies recubiertas de fibronectina nativas o portadoras de MPO. <ol><li> Añadir 200 l / pocillo en 2,5 x 10 5 células / ml a 96 así célula-sustrato arrays de microelectrodos impedancia. </li> &lt;li&gt; Añadir 2 ml / placa en 5 x 10 5 células / ml a 35 mm con fondo de cristal placas de cultivo celular. </li></ol></li><li> Inmediatamente después de la siembra de células (es decir, antes de cualquier fijación de las células y la difusión): <ol><li> Monte 96 y placas de matriz de microelectrodos en el puerto incubadora impedancia célula-sustrato (guardadas en una incubadora a 37ºC en presencia de CO2 al 5%) y tomar las lecturas &quot;en blanco&quot; para iniciar la adquisición continua de datos de índice de células (véase la Sección 2.10 ). </li><li> Transferencia de 35 mm con fondo de cristal placas de cultivo celular a una incubadora a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 2 horas para permitir la fijación máxima de células y la difusión (véase la Sección 2.11). </li><li> Eliminar brevemente los (lecturas de índice de células pausa en este punto) 96 y la placa matriz de microelectrodos o 35 mm con fondo de cristal placa de cultivo de células de la incubadora a 37ºC, quite sobrenadante celular y añadir calentado (37 ° C) HBSS (volúmenes como per paso 3.1). NOTA: HBSS se emplea cuando se estudia MPO catalizada por reacciones oxidativas en lugar de medio de cultivo completo ya que éste contiene especies oxidables que interfieren con las reacciones de oxidación. </li><li> Para examinar el efecto de los inhibidores / moduladores de reacciones catalizadas-MPO (sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas alternativos o antioxidantes) o inhibidores de la señalización de células (por ejemplo, blebbistatin 40 mM para inhibir la contractilidad actomiosina), añadir estos ahora. </li><li> Colocar inmediatamente la placa matriz de microelectrodos de nuevo en los (las lecturas de índice celular volverá a empezar en este punto) 37 ° C Puerto incubadora o el vidrio de 35 mm de fondo placa de cultivo celular de nuevo en la incubadora a 37ºC, y permitir que las células se equilibren en el HBSS durante 0,5 h. NOTA: Después de equilibrio de 0,5 horas en HBSS, los valores del índice de células se estabilizan en valores ligeramente inferiores; cuando las células pre-incubación con sustratos de enzimas, enzimas e inhibidores de señalización celular o antioxidantes, asegurarse primero de que tstos no afectan significativamente los valores obtenidos después del equilibrio. </li><li> Iniciar catalizada-MPO, oxidación fibronectina HOCl-dependiente y adherencia DE. <ol><li> Para los estudios de impedancia de células usando 96 y placas de matriz de microelectrodos: <ol><li> Retire la placa matriz de microelectrodos de la incubadora y la pausa mediciones del índice de célula. </li><li> Añadir H 2 O 2 (concentración final de 0-10 mM) a la HBSS y mezclar suavemente con la pipeta repetido. </li><li> Inmediatamente, vuelva a montar la matriz de microelectrodos de nuevo en el puerto C incubadora a 37 ° y volver a iniciar la adquisición de lecturas del índice celular. </li></ol></li><li> Para los estudios de imágenes de células vivas utilizando 35 mm plato con fondo de cristal de cultivo celular: <ol><li> Retire la placa de cultivo de la incubadora y su montaje en una etapa C calentada de un microscopio confocal invertido equipado con una lente de objetivo 63X agua con óptica DIC adecuados para la grabación de películas de células vivas 37 °. </li><li> Centrarse en las células yoptimizar DIC óptica (iluminación Köhler, retraso sesgo y el desplazamiento de la cámara / ganancia; para más detalles, véase 13). </li><li> Iniciar película CID y registrar las lecturas iniciales de las células no tratadas durante 1 min. </li><li> Añadir H 2 O 2 (concentración final de 0-10 mM) y mezclar suavemente con la pipeta repetido. Re-enfocar el microscopio (si es necesario) y continuar la grabación de películas DIC de las células tratadas durante el periodo de tiempo requerido. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Análisis de Datos y Presentación <ol><li> Datos de impedancia de la célula-sustrato <ol><li> Exportar datos en bruto (índice frente al tiempo de células) en una hoja de cálculo. </li><li> Para los estudios de células de-adhesión (Experimento 2: Sección 3), normalizar los datos mediante el establecimiento de valores registrados inmediatamente antes de la iniciación de la oxidación fibronectina mediada MPO en un valor de 1 (es decir, inmediatamente antes de la adición de H 2 O 2 en 3.11 .1.1). NOTA: Esto asegura que relativalos cambios en los valores del índice de células producidas por la oxidación fibronectina mediada MPO no están enmascarados por pequeñas diferencias iniciales en los valores del índice de células absolutas entre pozos. <ol><li> Los datos se presentan como diagramas de índice normalizado de células (eje y) frente al tiempo (eje x). </li></ol></li></ol></li><li> Datos de imágenes de células vivas (estudios de células de-adhesión en el Experimento 2: Sección 3) <ol><li> Abra DIC en vivo de imágenes de células películas grabadas inmediatamente antes y después de la iniciación de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un programa de análisis de imagen estándar (por ejemplo, software ImageJ). </li><li> En al menos dos películas separadas DIC seleccionar aleatoriamente varias celdas y medir su área proyectada en fotogramas secuenciales (por ejemplo, a intervalos de 1 min) trazando manualmente su borde de la membrana y cuantificar el número de píxeles cerrados. </li><li> Exportar datos en bruto (área celular proyectado en función del tiempo) a una hoja de cálculo Excel y normalizar los datos del área de células mediante el establecimiento de los valores registrados inmediatamente antesla iniciación de la oxidación de fibronectina mediada por MPO en un valor de 1 (es decir, inmediatamente antes de la adición de H 2 O 2 en 3.11.2.3). </li><li> Los datos actuales como una parcela de área normalizada de células (eje y) frente al tiempo (eje x). </li></ol></li></ol>

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	<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function.">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li><li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. 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R., Witting, P. K., Drummond, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+control+of+endothelial+function+and+dysfunction:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-derived+oxidants+selectively+disrupt+the+protein+core+of+the+heparan+sulfate+proteoglycan+perlecan.">Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan.</a> Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).</li><li>Rees, M. 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P., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+dominates+adhesive+ligand+density+in+regulating+cellular+de-adhesion+and+retraction+kinetics.">Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics.</a> Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).</li><li>Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+subcellular+release+for+studying+the+dynamics+of+cell+detachment.">Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment.</a> Nat Methods. 6, 211-213 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen revelaciones para hacer.

La adhesión célula-matriz y los procesos de-adhesión pueden cuantificarse con precisión en tiempo real con alta resolución temporal utilizando impedancia de la célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques en tiempo real proporcionan una gran ventaja sobre los análisis de punto final de la adhesión celular, que proporcionan una pobre resolución temporal. Al cuantificar con precisión rápidas respuestas de-adhesión con alta resolución temporal, estos análisis pueden proporcionar ...

Se requieren contactos adhesivas estable entre las células y su matriz extracelular circundante para el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Por ejemplo, la adhesión celular endotelial a la matriz subendotelial en los vasos sanguíneos desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la integridad de la capa endotelial y su función homeostática como una barrera vascular reguladora, semi-permeable 1. El citoesqueleto de actina está acoplado mecánicamente al adhesivo moléculas de la matriz en los sitios de adhesión célula-matriz y los contactos de adhesivo en la interfase célula-matriz desempeñar un papel importante en la determinación de la posición de la membrana celular mediante la resistencia a fuerzas de tracción de actomiosina centralmente dirigidas. Estímulos extracelulares que alteran la adhesión célula-matriz alterar necesariamente el equilibrio de fuerzas en la interfase célula-matriz, un evento que es rápidamente &quot;sintieron&quot; por proteínas de señalización mecano-sensible, lo que resulta en la transducción de &quot;afuera hacia adentro de señalización&quot;. Esta apuesta cruzada hablarween células y su matriz extracelular circundante juegan un papel clave en el control de la forma celular, la motilidad, la función, la proliferación y la supervivencia 2. Procesos fisiopatológicos diversos (desarrollo embrionario, la inflamación, la reparación de heridas y la metástasis del cáncer) se caracterizan por la remodelación dinámica de sustratos de matriz adhesiva por oxidantes y / o enzimas que degradan la matriz 3,4. Por ejemplo, adhesivo de proteínas de la matriz subendotelial en los vasos sanguíneos (por ejemplo, fibronectina) están implicados como los principales objetivos para la modificación o degradación en las enfermedades inflamatorias humanos debido a la producción localizada de oxidantes reactivos (por ejemplo, ácido hipocloroso, HOCl) por la enzima derivadas de leucocitos mieloperoxidasa (MPO), que se acumula dentro de la subendotelio vascular durante la enfermedad inflamatoria (Figura 1) 5-9. Los cambios en la adhesión célula-matriz inducidos por oxidantes derivados de MPO y otros estímulos de matriz modificadores son likEly jugar un papel importante en la alteración de la homeostasis vascular durante una variedad de procesos patológicos, por ejemplo, mediante la alteración de la señalización celular endotelial, morfología y viabilidad, que a su vez perturba la función endotelial y la integridad de la barrera. Sin embargo, las respuestas de señalización morfológicos y celulares de las células adherentes a las modificaciones de la matriz extracelular sólo están empezando a ser entendido. Para entender cómo las modificaciones de la matriz coche cambios en la dinámica de adhesión celular y vías de señalización celular de adhesión dependiente, se requieren técnicas que cuantificar con precisión los cambios en la adhesión célula-matriz en tiempo real, con alta resolución temporal. A continuación, describimos impedancia de la célula-sustrato complementaria y técnicas de imágenes de células vivas que cumplen estos criterios y proporcionar una plataforma para cuantificar la adhesión celular y los procesos de-adhesión de una manera no invasiva. Mostramos cómo éstos impedancia célula-sustrato y en directo apro imágenes de célulasdolores se pueden emplear fácilmente para (i) controlar la dinámica de la unión celular y la propagación (es decir, de novo de adhesión celular) sobre sustratos de matriz nativos y modificados y (ii) para medir la dinámica de desprendimiento de las células de la matriz (es decir, de-adhesión ) por las células adherentes expuestos a estímulos matriz modificadores. El sistema xCELLigence célula-sustrato impedancia de biosensor proporciona una medición continua de la zona de contacto célula-matriz mediante la cuantificación de impedancia eléctrica en la superficie de 96 pocillos arrays de microelectrodos de oro y expresa estas mediciones de impedancia eléctrica como &quot;índice de célula, un valor adimensional que es en gran parte proporcional al área de contacto célula-sustrato 10 (Figura 2), mientras que también es sensible a los cambios en la distancia media entre la (aislante) membrana celular y la superficie del electrodo 11. También se consigue un aumento adicional de los valores del índice de células en la formación de apretado contactos célula-célula del that restringir los flujos actuales paracelulares, 11 condiciones que no prevalecen dentro de los experimentos descritos en este estudio. Medición del área proyectada de las células individuales en el tiempo por análisis de imágenes de contraste de interferencia diferencial de lapso de tiempo (DIC) películas proporciona una medida complementaria de los cambios en el área de contacto célula-sustrato y proporciona información adicional con respecto a la naturaleza exacta y la dinámica de la cambios morfológicos cuantificados por el enfoque de impedancia de la célula-sustrato. Específicamente, se describe la aplicación de estos enfoques para supervisar cómo oxidación de proteínas de la matriz subendotelial adhesivas (por ejemplo, fibronectina) (i) mediada por MPO reduce la adhesión de novo de las células endoteliales en suspensión en fibronectina purificada y (ii) desencadena célula-matriz de -adhesion en las células endoteliales con la adhesión establecido en la fibronectina. Mediante la realización de la señalización celular paralelo analiza en el tiempo utilizando biochem relevanteensayos de cos (por ejemplo, transferencia de Western), las relaciones temporales y causales entre los procesos de adhesión / DE-adhesión y los cambios asociados en los eventos de señalización celular de adhesión dependiente se puede determinar. Estos enfoques han usado recientemente para demostrar que la oxidación de la matriz extracelular catalizada por depósitos subendoteliales de MPO activa una rápida pérdida en la adhesión célula-matriz de las células endoteliales que es impulsado por las fuerzas de pre-existentes contráctiles actomyosin 9. Es importante destacar que, al permitir que la relación temporal entre cambios tanto en la adhesión celular y la adhesión celular dependiente de señalización que se determine, estos enfoques identificados que modificación de la matriz inducida por MPO y celular de-adhesión desencadena cambios en importantes vías de señalización celular de adhesión dependiente incluyendo Src quinasa fosforilación paxilina -dependiente y cadena ligera de miosina II fosforilación (Figura 1) 9. Este modo de señalización redox dependientes, involving la activación de los eventos de señalización intracelular por reacciones oxidativas extracelulares que romper la adhesión célula-matriz, representa un nuevo modo de señalización celular denomina &quot;fuera-en la señalización redox&quot; (Figura 1) 9. En general, estos complementaria biosensor impedancia de la célula-sustrato y enfoques imágenes de células vivas deben ser valiosa para revelar cómo los diferentes estímulos o agentes modificadores de la matriz coche cambios en la dinámica de adhesión celular, la morfología y la señalización dentro de diferentes tipos de células adherentes sujetos a una amplia variedad de parámetros experimentales. El siguiente protocolo describe cómo cuantificar el impacto de la oxidación matriz mediada por MPO de novo adhesión de células endoteliales (Experimento 1) y la célula procesos de adhesión endotelial (2 Experimento). MPO se une ávidamente a la fibronectina y otras proteínas de la matriz extracelular subendotelial adhesivas y nosotroses peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para convertir los iones de cloruro (Cl -) para el oxidante de cloración ácido hipocloroso altamente reactivo (HOCl), que reacciona localmente con estas proteínas de la matriz y altera sus propiedades adhesivas celular (Figura 1) 8,9, 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1328">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:551px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">E-Plate 96</td>
			<td>single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">blebbistatin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B0560</td>
			<td>selective inhibitor of non-muscle myosin-II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">BW-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGM-2 BulletKit</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">CC-3162</td>
			<td>endothelial cell growth media kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fibronectin, lyophilized powder</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F-4759</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td>
			<td style="width:223px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:151px;">FD35-100</td>
			<td>Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G9391</td>
			<td>cell culture substratum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:223px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">107298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Medium-199</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11150-059</td>
			<td>serum-free cell media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Methionine</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9500</td>
			<td>quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">475911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td>Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cell-substrate impedance and live cell imaging to measure real-time changes in cellular adhesion and de-adhesion induced by matrix modification

La adhesión célula-matriz desempeña un papel clave en el control de la morfología celular y la señalización. Los estímulos que interrumpen la adhesión célula-matriz (por ejemplo, mieloperoxidasa y otros oxidantes matriz modificar / enzimas liberadas durante la inflamación) están implicados en el desencadenamiento de cambios patológicos en la función celular, el fenotipo y la viabilidad en un número de enfermedades. Aquí se describe cómo impedancia de la célula-sustrato y enfoques imágenes de células vivas se pueden emplear fácilmente para cuantificar con precisión los cambios en tiempo real en la adhesión celular y de-la adhesión inducida por la modificación de la matriz (utilizando células endoteliales y la mieloperoxidasa como un estímulo matriz de modificadores de fisiopatológico) con alta resolución temporal y de una manera no invasiva. El sistema de impedancia de la célula-sustrato xCELLigence cuantifica de forma continua el área de la adhesión célula-matriz mediante la medición de la impedancia eléctrica en la interfase célula-sustrato en las células cultivadas sobre matrices de microelectrodos de oro. Análisis de imágenes de time-lapse diferencial películas de contraste de interferencia cuantifica los cambios en el área proyectada de las células individuales en el tiempo, que representa los cambios en el área de contacto célula-matriz. Ambas técnicas cuantificar con precisión los cambios rápidos en los procesos de adhesión celular y de-adhesión. Impedancia de la célula-sustrato sobre biochips microelectrodos proporciona una plataforma para mediciones robusto, de alto rendimiento. Imágenes de células vivas analiza proporcionar detalles adicionales con respecto a la naturaleza y la dinámica de los cambios morfológicos cuantificados mediante mediciones de impedancia célula-sustrato. Estos enfoques complementarios proporcionan valiosos nuevos conocimientos sobre cómo la modificación oxidativa catalizada por mieloperoxidasa de los componentes de la matriz extracelular subcelulares provoca cambios rápidos en la adhesión celular, la morfología y señalización en las células endoteliales. Estos enfoques son también aplicables para el estudio de la dinámica de adhesión celular en respuesta a otros estímulos matriz modificar y en células adherentes relacionados (por ejemplo, células epiteliales).

La cuantificación en tiempo real de células endoteliales de adhesión de fibronectina en respuesta a la oxidación mediada por la fibronectina MPO (Experimento 2). La siembra de las suspensiones de células endoteliales en nativo (MPO libre) de fibronectina o MPO-cojinete resultados de fibronectina en la unión celular máxima y la difusión dentro de 2 h, según se juzga por un estancamiento de valores de índice celular en las mediciones de impedancia sustrato de células (Figura 3A).</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification at JoVE.

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

A continuación, presentamos un protocolo para cuantificar de forma continua adhesión celular y de-adhesión procesos con alta resolución temporal de una manera no invasiva por impedancia célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques revelan la dinámica de los procesos de adhesión celular / DE-adhesión desencadenados por modificación de la matriz y su relación temporal de los eventos de señalización de adhesión dependiente.

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K vistas.  University of New South Wales.  A continuación, presentamos un protocolo para cuantificar de forma continua adhesión celular y de-adhesión procesos con alta resolución temporal de una manera no invasiva por impedancia célula-sustrato y análisis de imágenes de células vivas. Estos enfoques revelan la dinámica de los procesos de adhesión celular / DE-adhesión desencadenados por modificación de la matriz y su relación temporal de los eventos de señalización de adhesión dependiente. 

Video: Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Investigación

Bioingeniería

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

La captura simultánea imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión mediante un sistema de división de doble cámara de emisiones: Las solicitudes de adhesión de células

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal de mano-tridimensional optoacústica Imaging Sonda de Tejido Profundo Angiografía Humano y Estudios preclínicos funcionales en Tiempo Real

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Fotoacústica clínica mano sistema de imagen por imagen no invasiva en tiempo real de Animal pequeño

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Medición de metaloproteinasa de la matriz celular Global y actividad metabólica en hidrogeles 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...