This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1. Generale Endothelial Cell Culture <ol><li> Culture bovina cellule endoteliali aortiche (passaggi 4-9) su gelatina rivestita fiasche di coltura tissutale (rivestimento superficiale coltura tissutale con 0,1% w / v di gelatina in PBS a temperatura ambiente per 15 min) in EGM-2 supporti (con l&#39;EGM-2 proiettile kit contenente siero bovino fetale 5%, fattori di crescita e tutti gli integratori fornite dal produttore, tranne idrocortisone). </li><li> Quando le cellule sono quasi confluenti (circa 3 giorni dopo la semina dopo un 1: 4 split), cellule raccolto mediante trattamento con 0,05% w / v tripsina / 0.02% w / v EDTA in PBS a 37 ° C. Dopo la maggioranza delle cellule sono distaccato, aggiungere completi EGM-2 supporti per placare la tripsina e centrifugare (100 xg, 5 min). </li><li> Preparare cellule per studi sull&#39;adesione de novo di cellule endoteliali a fibronectina (Esperimento 1: Sezione 2) e la successiva de-adesione delle cellule endoteliali con adesione stabilita su tale substrato (Esperimento 2: Sezione 3). <ol><li> Lavare raccoltecellule una volta con senza siero Medium 199 contenente 1% w / v di albumina sierica bovina (BSA) e ri-centrifuga (100 xg, 5 min). </li><li> Risospendere le cellule in senza siero Medium 199 contenente 1% w / v BSA a 2,5 x 10 5 cellule / ml (misure di impedenza cell-substrato) o 5 x 10 5 cellule / ml (analisi di imaging cellulare dal vivo) e mantenere a 37 ° C prima dell&#39;uso. NOTA: Le risposte adesione delle cellule sono molto sensibili alle differenze di temperatura (ad esempio, a causa di effetti di convezione) così tutte le apparecchiature e le soluzioni utilizzati per gestire e trattare cellule durante i seguenti protocolli devono essere mantenuti ad una temperatura costante di 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Esperimento 1: Quantificare De Novo endoteliale Adesione cellulare su Native e MPO-ossidato fibronectina (impedenza Cell-substrato) NOTA: Esperimento 1 esamina il grado di MPO-mediata ossidazione della fibronectina compromette la capacità di supportare de novo </em&gt; Adesione delle cellule endoteliali in sospensione. <ol><li> Cappotto fibronectina su 96 pozzetti cell-substrato matrici di microelettrodi impedenza oro. Aggiungere 80 ml / pozzetto di purificata bovina fibronectina a 5 ug / ml in PBS, incubare per 2 ore a 37 ° C e rimuovere la soluzione. </li><li> Incubare superfici fibronectina rivestite con MPO per consentire il legame di MPO alla fibronectina superficiale legata. Aggiungere 80 ml / pozzetto di purificato MPO neutrofili umani a 20 nM in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e incubare per 0,5 ore a 37 ° C. </li><li> Lavare superfici due volte con HBSS per rimuovere non legato MPO. </li><li> Aggiungere H 2 O 2 (0-10 mM concentrazione finale) per i pozzetti della piastra matrice microelettrodo contenente 80 microlitri / pozzetto HBSS di avviare MPO-catalizzata, HOCl-dipendente fibronectina ossidazione e incubare per altri 0,5 ore a 37 ° C. </li><li> Per esaminare l&#39;effetto degli inibitori rilevanti o modulatori di reazioni MPO-catalizzate (ad esempio, alternativa MPO enzimisubstrati, inibitori enzimatici o antiossidanti; vedi 9 per i dettagli), aggiungerli al HBSS immediatamente prima H 2 O 2 aggiunta. </li><li> Dopo 0,5 ore, il trattamento di superfici con metionina per placare residue specie ossidanti superficie-bound, cioè, clorammine legati alle proteine ​​reattive, che possono esercitare attività cellulari confondenti. Aggiungi metionina 10 mm di 80 microlitri HBSS per pozzetto e incubare per 10 min a 37 ° C. </li><li> Block superfici con BSA. Aggiungere 80 ml / pozzetto di BSA allo 0,2% w / v in PBS, incubare per 2 ore a 37 ° C e rimuovere la soluzione. NOTA: regioni superficiali non rivestite residui sosterrà l&#39;adesione cellulare e bloccando questi con una proteina non adesivo (cioè, BSA) assicura che le risposte adesione cellulare strettamente dipendono dalla matrice di celle adesivo purificato impiegato, in questo caso fibronectina. </li><li> Lavare superfici due volte con HBSS. NOTA: Nessuno dei trattamenti superficiali precedenti influisce sensibilmente cellula-substrato readings. </li><li> Seed cellule endoteliali in sospensione (aggiungere 200 microlitri / bene a circa 2,5 x 10 5 cellule / ml, preparati in senza siero Medium 199 contenente BSA 1%; vedere 1.3) sulle superfici fibronectina rivestite nativi o MPO-ossidati. </li><li> Immediatamente dopo la semina di cellule (cioè, prima di qualsiasi attaccamento cellulare e diffusione), montare la piastra matrice microelettrodo sulla porta incubatore (ospitato in un 37 ° C incubatore in presenza di 2 5% CO). <ol><li> Utilizzando il software dello strumento prendere immediatamente un &#39;blank&#39; lettura per normalizzare successiva impedenza cellula-substrato (&#39;index cell&#39;) valori ai valori iniziali di fondo ottenuti in assenza di cellula-aderenza. </li><li> Avviare l&#39;acquisizione dei dati di indice delle cellule continue (minimo di una cella dell&#39;indice di lettura / min). </li></ol></li><li> Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 2 ore, un periodo di tempo durante il quale l&#39;adesione cellulare e la massima diffusione è realizzato; questo si rifletteun plateauing dei valori di indice cella (si veda la Figura 3A). NOTA: L&#39;esperimento precedente (Esperimento 1) esamina come iniziale ossidazione MPO-mediata della fibronectina limita la capacità delle cellule endoteliali a stabilire l&#39;adesione cellulare su questo substrato. Il seguente esperimento (Esperimento 2) esamina come MPO-mediata ossidazione fibronectina promuove diminuzioni adesione cellula-matrice (cioè de-adesione) in cellule endoteliali, con l&#39;adesione stabilito su questo substrato. I trattamenti in questi due esperimenti sono essenzialmente identici, eccetto per i tempi di ossidazione MPO-mediata fibronectina (cioè prima adesione cellulare - Esperimento 1, dopo l&#39;adesione cellulare - Esperimento 2). </li></ol> 3. Esperimento 2: Quantificare cellule endoteliali De-adesione da fibronectina in risposta a MPO-mediata fibronectina ossidazione (impedenza Cell-substrato e Imaging Live Cell) <ol><li> Cappotto fibronectina su 96 pozzetti oro microelettrodo unrrays per misure di impedenza cell-substrato (aggiungere 80 ml / pozzetto di fibronectina a 5 mg / ml in PBS e incubare per 2 ore a 37 ° C) o 35 millimetri dal fondo di vetro piatti di coltura cellulare per le analisi di imaging cellulare dal vivo (aggiungere 2 ml / piatto di fibronectina a 5 ug / ml in PBS ed incubare per 2 ore a 37 ° C). </li><li> Block superfici con BSA. Aggiungere BSA allo 0,2% w / v in PBS a volumi indicati in 3.1 e incubare per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Incubare superfici con MPO per consentire il legame di MPO alla fibronectina. Aggiungere 20 nM purificato MPO umana in HBSS ai volumi indicati in 3.1 e incubare per 0,5 ore a 37 ° C. </li><li> Lavare superfici due volte con HBSS per rimuovere non legato MPO. </li><li> Seed cellule endoteliali in sospensione (preparati in Medium 199 contenente 1% w / v BSA senza siero, vedi 1.3) sulle superfici rivestite fibronectina nativi o MPO-cuscinetto. <ol><li> Aggiungere 200 microlitri / pozzetto di 2,5 x 10 5 cellule / ml a 96 e cellula-substrato array di microelettrodi impedenza. </li> &lt;li&gt; Aggiungi 2 ml / piatto a 5 x 10 5 cellule / ml a 35 millimetri di vetro piatti di coltura cellulare fondo. </li></ol></li><li> Immediatamente dopo la semina di cellule (cioè, prima di qualsiasi attaccamento cellulare e diffusione): <ol><li> Mount 96 pozzetti di matrice microelettrodo sul porto incubatore impedenza cell-substrato (ospitato in un 37 ° C incubatore in presenza del 5% 2 CO) e le letture &quot;in bianco&quot; per avviare l&#39;acquisizione continua di dati di indice delle cellule (cf. Sezione 2.10 ). </li><li> Trasferimento 35 millimetri fondo di vetro piatti di coltura cellulare ad un 37 ° C incubatore in presenza di 5% CO 2. </li></ol></li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 2 ore per consentire l&#39;attaccamento cellulare e massima diffusione (cfr Sezione 2.11). </li><li> Brevemente rimuovere le (letture indice cella pausa a questo punto), 96 pozzetti matrice microelettrodi o 35 millimetri con fondo di vetro cellulare piatto cultura dalla C incubatore 37 °, rimuovere il surnatante cellulare e aggiungere riscaldata (37 ° C) HBSS (volumi come per passo 3.1). NOTA: HBSS viene impiegato quando si studia MPO-catalizzate reazioni ossidative invece di terreni di coltura completo come quest&#39;ultimo contiene specie ossidabili che interferiscono con le reazioni di ossidazione. </li><li> Per esaminare l&#39;effetto degli inibitori / modulatori di reazioni MPO-catalizzate (substrati enzimatici alternativi, inibitori enzimatici o antiossidanti) o inibitori di segnalazione cellulare (ad es, 40 micron blebbistatin per inibire actomiosina contrattilità), aggiungere questi ora. </li><li> Porre immediatamente la piastra matrice microelettrodi indietro nel (letture indice cella ri-commence a questo punto), 37 ° C porta incubatore o vetro 35 millimetri con fondo cella piatto cultura indietro nel C incubatore 37 °, e permettono alle cellule di equilibrare in HBSS per 0,5 ore. NOTA: dopo 0,5 ore equilibrio in HBSS, valori di indice cella si stabilizzano su valori leggermente inferiori; quando pre-incubando le cellule con i substrati di enzimi, enzimi e gli inibitori di segnalazione cellulare o antiossidanti, prima assicurarsi che these non incidono in modo significativo i valori ottenuti dopo il raggiungimento dell&#39;equilibrio. </li><li> Avvio MPO-catalizzata, HOCl dipendente ossidazione fibronectina e de-adesione. <ol><li> Per gli studi di impedenza cellulari utilizzando 96 e piastre di matrice microelettrodi: <ol><li> Rimuovere la piastra matrice microelettrodo dal termostato e mettere in pausa le misurazioni dell&#39;indice cellulare. </li><li> Aggiungi H 2 O 2 (concentrazione finale di 0-10 micron) per la HBSS e mescolare delicatamente pipettando ripetute. </li><li> Immediatamente, ri-montare la matrice microelettrodo indietro sulla C porto incubatore 37 ° e ri-iniziare l&#39;acquisizione di letture indice cellulare. </li></ol></li><li> Per gli studi di imaging cellulare dal vivo con piastra da 35 mm con fondo trasparente coltura cellulare: <ol><li> Rimuovere il piatto cultura dal termostato e montare su un C palco riscaldato di un microscopio confocale invertito dotato di una lente obiettivo 63X acqua con ottica DIC adatti per la registrazione di filmati cellule vive 37 °. </li><li> Concentrarsi sulle cellule eottimizzare ottica DIC (illuminazione Köhler, ritardo pregiudizi e fotocamera offset / guadagno, per i dettagli, vedi 13). </li><li> Avviare film DIC e registrare le letture di base di cellule non trattate per 1 min. </li><li> Aggiungi H 2 O 2 (concentrazione finale di 0-10 micron) e mescolare delicatamente pipettando ripetute. Rimettere a fuoco il microscopio (se necessario) e continuare la registrazione DIC filmati delle cellule trattate per il periodo di tempo richiesto. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Analisi dei dati e presentazione <ol><li> Dati impedenza Cell-substrato <ol><li> Esportazione dati grezzi (indice rispetto al tempo delle cellule) in un foglio di calcolo. </li><li> Per gli studi di cellule de-adesione (Esperimento 2: Sezione 3), normalizzare i dati impostando valori registrati immediatamente prima dell&#39;inizio della MPO-mediata ossidazione fibronectina per un valore di 1 (vale a dire, immediatamente prima dell&#39;aggiunta di H 2 O 2 a 3.11 .1.1). NOTA: Questo assicura che relativacambiamenti nei valori di indice delle cellule indotte da MPO-mediata ossidazione fibronectina non vengono mascherati da piccole differenze iniziali nei valori tra pozzi di indice cella assoluti. <ol><li> I dati attuali come trame di indice normalizzato cellulare (asse y) in funzione del tempo (asse x). </li></ol></li></ol></li><li> Dati di imaging cellulare dal vivo (studi delle cellule de-adesione in Esperimento 2: Sezione 3) <ol><li> Aprire DIC vivono film di imaging cellulare registrati immediatamente prima e dopo l&#39;apertura di MPO-mediata ossidazione fibronectina in un programma di analisi di immagine standard (ad esempio, il software ImageJ). </li><li> In almeno due film separati DIC casualmente selezionare più celle e misurare la loro area proiettata in fotogrammi in sequenza (ad esempio, a intervalli di 1 min) tracciando manualmente il loro vantaggio a membrana e quantificare il numero di pixel chiusi. </li><li> Esportazione dati grezzi (area di cella proiettata rispetto al tempo) di un foglio di calcolo Excel e normalizzare dati dell&#39;area cella impostando valori registrati immediatamente primal&#39;apertura di MPO-mediata ossidazione fibronectina ad un valore di 1 (cioè, immediatamente prima dell&#39;aggiunta di H 2 O 2 in 3.11.2.3). </li><li> Presentare i dati come un terreno di zona normalizzata cellulare (asse y) in funzione del tempo (asse x). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function.">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li><li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+extracellular+matrix+and+its+role+in+human+pathologies.">Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies.</a> Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).</li><li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+transcytosis+of+myeloperoxidase+confers+specificity+to+vascular+ECM+proteins+as+targets+of+tyrosine+nitration.">Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration.</a> J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).</li><li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+pulmonary+and+vascular+nitrotyrosine+reveals+the+pivotal+role+of+myeloperoxidase+as+a+catalyst+for+tyrosine+nitration+in+inflammatory+diseases.">Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases.</a> Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).</li><li>Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+control+of+endothelial+function+and+dysfunction:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-derived+oxidants+selectively+disrupt+the+protein+core+of+the+heparan+sulfate+proteoglycan+perlecan.">Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan.</a> Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+subendothelial+matrix+oxidation+by+myeloperoxidase+triggers+myosin+II-dependent+de-adhesion+and+alters+signaling+in+endothelial+cells.">Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells.</a> Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically.">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li><li>Vissers, M. C., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypochlorous+acid+disrupts+the+adhesive+properties+of+subendothelial+matrix.">Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix.</a> Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).</li><li>Ziv, N. E., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Interference+Contrast+(DIC)+Imaging+of+Living+Cells.">Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Kennett, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+modifies+the+structure+and+function+of+the+extracellular+matrix+proteoglycan+perlecan+by+reaction+with+both+the+protein+core+and+the+heparan+sulfate+chains.">Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains.</a> Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).</li><li>Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+dominates+adhesive+ligand+density+in+regulating+cellular+de-adhesion+and+retraction+kinetics.">Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics.</a> Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).</li><li>Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+subcellular+release+for+studying+the+dynamics+of+cell+detachment.">Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment.</a> Nat Methods. 6, 211-213 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno informativa da fare.

Adesione cellula-matrice e processi de-adesione possono essere quantificati con precisione in tempo reale ad alta risoluzione temporale con impedenza di cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci in tempo reale forniscono un grande vantaggio rispetto end-point analisi di adesione cellulare, che offrono scarsa risoluzione temporale. Per quantificare con precisione le risposte de-adesione rapide con alta risoluzione temporale, queste analisi possono fornire spunti critici in modalità morfolog...

Contatti adesivi stabili tra le cellule e la loro matrice extracellulare che circonda sono necessari per mantenere l&#39;omeostasi tissutale. Per esempio, l&#39;adesione delle cellule endoteliali alla matrice sottoendoteliale nei vasi sanguigni gioca un ruolo critico nel mantenere l&#39;integrità dello strato endoteliale e la sua funzione omeostatica come normativo, semi-permeabile barriera vascolare 1. Il citoscheletro actina è accoppiato meccanicamente ad adesivo molecole della matrice in siti di adesione cellula-matrice e contatti adesivo all&#39;interfaccia cellula-matrice svolgere un ruolo importante nel determinare la posizione della membrana cellulare resistendo centralmente dirette forze di trazione actomiosina. Stimoli extracellulari che alterano l&#39;adesione cellula-matrice necessariamente alterare l&#39;equilibrio delle forze all&#39;interfaccia cellula-matrice, un evento che è rapidamente &#39;percepite&#39; di proteine ​​di segnalazione meccano-sensibili, causando la trasduzione di &quot;outside-in di segnalazione&quot;. Questa scommessa cross-talkcellule Ween e la loro matrice extracellulare che circonda svolge un ruolo chiave nel controllo la forma delle cellule, la motilità, la funzione, la proliferazione e la sopravvivenza 2. Processi patofisiologici Varie (sviluppo embrionale, infiammazione, riparazione delle ferite e le metastasi del cancro) sono caratterizzati da rimodellamento dinamico di substrati matrice adesivo ossidanti e / o enzimi 3,4 matrice-degradanti. Ad esempio, proteine ​​della matrice adesiva subendoteliali nei vasi sanguigni (es, fibronectina) sono implicati come obiettivi principali per la modifica o la degradazione in malattie infiammatorie umane a causa della produzione localizzata di ossidanti reattivi (per esempio, acido ipocloroso, HOCl) dall&#39;enzima leucociti derivato mieloperossidasi (MPO), che si accumula all&#39;interno del subendothelium durante malattia vascolare infiammatoria (Figura 1) 5-9. Variazioni di adesione cellula-matrice indotte da ossidanti MPO-derivati ​​e altri stimoli matrice-modifica sono likely a giocare un ruolo importante nel modificare l&#39;omeostasi vascolare durante una varietà di processi patologici, ad esempio, alterando la segnalazione delle cellule endoteliali, la morfologia e la vitalità, che a sua volta perturba funzione endoteliale e integrità della barriera. Tuttavia, le risposte di segnalazione morfologiche e cellulari delle cellule aderenti a modifiche della matrice extracellulare stanno solo iniziando a essere capito. Per capire come le modifiche di matrice auto cambiamenti nelle dinamiche di adesione cellulare e delle cellule vie di segnalazione di adesione-dipendente, le tecniche, sono necessari a quantificare con precisione i cambiamenti in adesione cellula-matrice in tempo reale, con alta risoluzione temporale. Qui, descriviamo complementare impedenza cell-substrato e tecniche di imaging cellulare dal vivo che soddisfano questi criteri e fornire una piattaforma per quantificare l&#39;adesione delle cellule e dei processi di de-adesione in modo non invasivo. Mostriamo come questi impedenza della cella-substrato e vivo appro imaging cellularedolori possono essere facilmente impiegati per (i) monitorare le dinamiche di attaccamento cellulare e diffusione (cioè, de novo adesione cellulare) su substrati matrice nativi e modificati e (ii) per misurare le dinamiche di distacco cellula-matrice (cioè, de-aderenza ) da parte delle cellule aderenti esposte a stimoli matrice-modifica. Il sistema xCELLigence cellula-substrato biosensore impedenza fornisce una misurazione continua della superficie di contatto cellula-matrice quantificando impedenza elettrica alla superficie 96 pozzetti array oro microelettrodi ed esprime queste misurazioni dell&#39;impedenza elettrici come &#39;indice di cellule&#39;, un valore adimensionale che è sostanzialmente proporzionale all&#39;area di cellula-substrato contatto 10 (figura 2), mentre anche essendo sensibile alle variazioni della distanza media tra la (isolante) membrana cellulare e la superficie dell&#39;elettrodo 11. Un ulteriore aumento dei valori di indice cella è ottenuta anche sulla formazione di stretto contatto cellula-cellula that limitare i flussi di corrente paracellulare, 11 condizioni che non prevalgono nei esperimenti descritti in questo studio. Misurazione della superficie proiettata delle singole cellule nel tempo per l&#39;analisi delle immagini di time-lapse contrasto di interferenza differenziale (DIC) film fornisce una misura complementare di variazioni dell&#39;area di contatto cellula-substrato e fornisce ulteriori informazioni sulla natura esatta e la dinamica del cambiamenti morfologici quantificati dall&#39;approccio impedenza cellula-substrato. In particolare, si descrive l&#39;applicazione di questi approcci per monitorare come ossidazione delle proteine ​​della matrice subendoteliale adesivi (ad esempio, fibronectina) (i) MPO-mediata riduce l&#39;adesione de novo di cellule endoteliali sospese su fibronectina purificato e (ii) innesca cellula-matrice de -adhesion in cellule endoteliali, con l&#39;adesione stabilito sulla fibronectina. Eseguendo segnalazione cellulare parallela analisi nel tempo utilizzando biochem rilevantesaggi iCal (ad esempio, blotting occidentale), le relazioni temporali e causali tra i processi di adesione / de-adesione e cambiamenti associati nella segnalazione cellulare eventi adesione-dipendente può essere determinato. Questi approcci sono stati recentemente utilizzati per dimostrare che l&#39;ossidazione della matrice extracellulare catalizzata da depositi subendoteliali di MPO innesca una rapida perdita di adesione cellula-matrice delle cellule endoteliali che è guidato da preesistenti forze actomiosina contrattili 9. È importante sottolineare che, consentendo la relazione temporale tra cambiamenti sia adesione delle cellule e delle cellule di adesione-dipendente di segnalazione da stabilirsi, questi approcci identificati che modifica matrice MPO-indotta e cellulare de-adesione innesca cambiamenti di importanti vie di segnalazione delle cellule adesione-dipendente tra cui Src chinasi -dipendente fosforilazione paxillina e leggera della miosina catena II fosforilazione (Figura 1) 9. Questa modalità di segnalazione redox-dipendente, involving l&#39;attivazione di eventi di segnalazione intracellulare da reazioni ossidative extracellulari che inficiano l&#39;adesione cellula-matrice, rappresenta una nuova modalità di segnalazione cellulare denominato &quot;fuori-nella segnalazione redox&quot; (Figura 1) 9. In generale, questi complementare biosensore impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo dovrebbero essere utili nel rivelare come i diversi stimoli o agenti matrice-modificando auto cambiamenti nelle dinamiche di adesione cellulare, morfologia e segnalazione all&#39;interno di diversi tipi di cellule aderenti soggette a una vasta gamma di impostazioni sperimentali. Il protocollo segue descrive come quantificare l&#39;impatto di ossidazione matrice MPO-mediata su de novo di adesione delle cellule endoteliali (Esperimento 1) e cellule endoteliali de-adesione (Esperimento 2) processi. MPO lega avidamente alla fibronectina e altre proteine ​​della matrice extracellulare subendoteliali adesivi e cies perossido di idrogeno (H 2 O 2) per convertire ioni cloruro (Cl -) al altamente reattivo clorurante ossidante acido ipocloroso (HOCl), che reagisce localmente con queste proteine ​​della matrice e disturba le loro proprietà adesive delle cellule (Figura 1) 8,9, 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1328">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:551px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">E-Plate 96</td>
			<td>single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">blebbistatin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B0560</td>
			<td>selective inhibitor of non-muscle myosin-II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">BW-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGM-2 BulletKit</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">CC-3162</td>
			<td>endothelial cell growth media kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fibronectin, lyophilized powder</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F-4759</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td>
			<td style="width:223px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:151px;">FD35-100</td>
			<td>Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G9391</td>
			<td>cell culture substratum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:223px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">107298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Medium-199</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11150-059</td>
			<td>serum-free cell media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Methionine</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9500</td>
			<td>quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">475911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td>Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cell-substrate impedance and live cell imaging to measure real-time changes in cellular adhesion and de-adhesion induced by matrix modification

Adesione cellulare matrice gioca un ruolo chiave nel controllo della morfologia cellulare e di segnalazione. Stimoli che sconvolgono l&#39;adesione cellula-matrice (ad esempio, la mieloperossidasi e altri ossidanti matrice-modifica / enzimi rilasciati durante l&#39;infiammazione) sono implicati nella innescare cambiamenti patologici in funzione cellulare, fenotipo e la vitalità in una serie di malattie. Qui, descriviamo come impedenza cell-substrato e approcci di imaging cellulare dal vivo possono essere facilmente impiegati per quantificare con precisione i cambiamenti in tempo reale di adesione cellulare e de-adesione indotta da modifiche alla matrice (utilizzando cellule endoteliali e la mieloperossidasi come stimolo matrice modificando fisiopatologico) con alta risoluzione temporale e in modo non invasivo. Il sistema di impedenza della cella-substrato xCELLigence quantifica continuamente la zona di adesione cellula-matrice misurando l&#39;impedenza elettrica all&#39;interfaccia cellula-substrato in cellule cresciute su array di microelettrodi oro. L&#39;analisi delle immagini di time-lapse differenziale film contrasto interferenze quantifica variazione dell&#39;area proiettata di singole cellule nel tempo, rappresentano variazioni dell&#39;area di contatto cellula-matrice. Entrambe le tecniche quantificare con precisione rapidi cambiamenti dei processi di adesione cellulare e de-adesione. Impedenza Cell-substrato su array microelettrodo biosensori fornisce una piattaforma per le misure robusta, ad alta produttività. Imaging cellulare dal vivo analizza fornire ulteriori dettagli circa la natura e la dinamica dei cambiamenti morfologici quantificati da misure di impedenza cella-substrato. Questi approcci complementari forniscono nuove preziose intuizioni come mieloperossidasi-catalizzata ossidativo modifica dei componenti della matrice extracellulare subcellulari innesca rapidi cambiamenti di adesione cellulare, la morfologia e di segnalazione nelle cellule endoteliali. Questi approcci sono applicabili per studiare dinamiche di adesione cellulare in risposta ad altri stimoli matrice modificanti e in cellule aderenti correlate (ad esempio, cellule epiteliali) anche.

In tempo reale quantificazione delle cellule endoteliali de-adesione da fibronectina in risposta ad ossidazione fibronectina MPO-mediata (Esperimento 2). La semina di sospensioni cellulari endoteliali su nativo (MPO gratuito) fibronectina o MPO-cuscinetto risultati fibronectina in allegato cellule massima e la diffusione in 2 ore, come giudicato da un plateauing di valori di indice cella nella misure di impedenza substrato cellulare (Figura 3A). Questa fase iniziale di adesione delle ce...

Watch this Scientific Journal Video about Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification at JoVE.

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare continuamente i processi di adesione cellulare e de-adesione con alta risoluzione temporale in modo non invasivo per impedenza cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci rivelano le dinamiche dei processi di adesione cellulare / de-adesione innescato da modifica della matrice e la loro relazione temporale con gli eventi di segnalazione adesione-dipendente.

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K Views.  University of New South Wales.  Qui, vi presentiamo un protocollo per quantificare continuamente i processi di adesione cellulare e de-adesione con alta risoluzione temporale in modo non invasivo per impedenza cellule-substrato e imaging cellulare dal vivo analisi. Questi approcci rivelano le dinamiche dei processi di adesione cellulare / de-adesione innescato da modifica della matrice e la loro relazione temporale con gli eventi di segnalazione adesione-dipendente. 

Video: Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Ricerca

Bioingegneria

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

Contemporaneamente Catturare immagini in tempo reale in due canali di emissione Utilizzando un Splitting sistema Dual Camera Emissione: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universale Mano libera tridimensionale optoacustica Imaging Probe per Deep Tissue angiografia umana e funzionali studi preclinici in tempo reale

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Mano clinico fotoacustico sistema di Imaging per Imaging animale piccolo Non-invasivo in tempo reale

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...